石墨炔纳米材料作为自由基清除剂及辐射防护剂的新用途

摘要

本发明公开了一种石墨炔纳米材料作为自由基清除剂及辐射防护剂的新用途，属于纳米材料、自由基清除以及辐射防护技术领域。本发明所采用的石墨炔纳米材料不仅具有共轭大π键结构，还具有反应活性高的二炔键结构，这些独特的使其具有良好的吸电子能力，从而能有效地清除自由基，可作为自由基清除剂。由于石墨炔具有良好的自由基清除活性，它可以有力的清除放疗过程中由高能射线诱导机体产生的大量ROS，减少这些ROS对正常组织的损害，从而达到辐射防护的效果。本发明首次将石墨炔纳米材料应用在自由基清除上，为发开新的自由基清除剂抗氧化提供了新契机。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料、自由基清除以及辐射防护技术领域，涉及一种石墨炔纳米材料用作自由基清除剂及辐射防护剂的新用途，尤其涉及一种基于牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料用作自由基清除剂和辐射防护剂的新用途。

背景技术

活性氧(ROS)自由基在机体的氧化损伤中扮演着重要角色。它们可以与细胞内的大分子(例如DNA，RNA，蛋白质以及细胞膜)相互作用，造成细胞损伤，从而损害机体。特别是在放射治疗过程中，所采用的高能射线会辐解细胞内的水产生大量的ROS，造成对机体的辐射损伤。因此，开发有效的自由基清除剂对于抗氧化及辐射防护等领域来说具有重大的意义。

目前临床上应用的清除自由基药物主要是氨磷汀，但是作为一种分子药物，它具有血液循环半衰期短，在体内降解太快，药效时间短的缺点。更重要的是，它会对身体产生毒副作用。因此，研究者们开始寻找新的生物利用度高清除自由基药物。

近年来，纳米医学的快速发展为清除自由基新药物的开发提供了新的契机。相对于分子药物来说，纳米材料具有更长的体内循环半衰期以及更长的降解时间，因此被广泛地研究应用为纳米药物。事实上，目前已经有很多纳米材料被报道具有清除自由基的功能。比如：碳材料，氧化铈以及过渡金属硫化物纳米颗粒等等。在这众多的具有清除自由基活性的纳米材料中，具有共轭大π键结构的碳材料，例如石墨烯，碳纳米管，富勒烯及其衍生物等等，由于其生物相容性好，低毒，可以有效地捕获自由基，因此引起了研究者们的广泛关注。可见，具有共轭大π键结构的碳材料是一类有效地自由基清除剂。

最近，有研究报道了一种新型的具有共轭大π键结构的碳材料——石墨炔。相比于石墨烯及碳纳米管的结构来说，石墨炔不仅具有共轭大π键，还具有反应活性很高的二炔键。由于石墨炔的独特的结构，它已在储能，太阳能电池，催化，场发射等领域得到热点研究。然而将其用作自由基清除剂以及辐射防护剂却未见报道。

因此，在本领域期望得到一种生物相容性好，自由基清除能力强，能够起到辐射防护作用的石墨炔纳米材料。

发明内容

本发明的目的在于提供一种石墨炔纳米材料作为自由基清除剂及辐射防护剂的新用途，其中，石墨炔纳米材料具有共轭大π键及反应活性很高的二炔键，能够有效地捕获和清除自由基，适用作为自由基清除剂；同时该石墨炔材料还能应用于辐射防护，能够清除辐射诱导机体产生的过量自由基，可以降低自由基对机体的损伤，实现辐射防护。

其技术解决方案包括：

石墨炔纳米材料作为自由基清除剂或辐射防护剂的应用。

作为本发明的一个优选方案，上述石墨炔纳米材料为由牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料。

作为本发明的另一个优选方案，由牛血清蛋白修饰的石墨炔纳米材料是通过物理吸附法制备所得。

进一步的，所述物理吸附法依次包括以下步骤：

a、制备石墨炔纳米材料水溶液；

b、将牛血清白蛋白溶解在超纯水中，得到牛血清白蛋白水溶液；

c、将步骤a所得石墨炔纳米材料水溶液与步骤b所得牛血清白蛋白水溶液混合，室温搅离心，即得牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料。

进一步的，步骤a中，所述石墨炔纳米材料水溶液的制备方法包括：首先将石墨炔进行研磨；然后加超纯水分散形成石墨炔水溶液；最后将所述石墨炔水溶液置于超声破碎仪中进行冰浴超声破碎，即得石墨炔纳米材料水溶液。

进一步的，步骤c中，所述石墨炔纳米材料水溶液与所述牛血清白蛋白水溶液二者的体积比为1:1。

进一步的，所述石墨炔纳米材料水溶液浓度为1mg/mL，所述牛血清白蛋白水溶液浓度为1mg/mL。

进一步的，步骤c中，搅拌时间为10-14h。

进一步的，离心步骤中，离心转速为12000rpm，离心时间为20min。

进一步的，上述石墨炔纳米材料的平均水合粒径为11.16nm；由牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料的平均水合粒径为25.91nm

与现有技术相比，本发明带来了以下有益技术效果：

(1)在本发明中，所采用的石墨炔纳米材料不仅具有共轭大π键结构，还具有反应活性高的二炔键结构，这些独特的使其具有良好的吸电子能力，从而能有效地清除自由基，可作为自由基清除剂。

(2)在本发明中，由于石墨炔具有良好的自由基清除活性，它可以有力的清除放疗过程中由高能射线诱导机体产生的大量ROS，减少这些ROS对正常组织的损害，从而达到辐射防护的效果。

(3)经牛血清白蛋白修饰后的石墨炔纳米材料，其作用效果比单纯的石墨炔纳米材料更为显著，具体参见具体实施方式及说明书附图3、4、5、6。

本发明首次将石墨炔纳米材料应用在自由基清除上，为发开新的自由基清除剂抗氧化提供了新契机。

附图说明

下面结合附图对本发明做进一步说明：

图1为本发明石墨炔材料的结构示意图；

图2为本发明石墨炔纳米材料的透射电镜图；

图3为本发明石墨炔纳米材料的以及牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料的动态光散射图；

图4为本发明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基的清除效果图；

图5为本发明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)自由基的清除效果图；

图6为本发明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对氢氧自由基(·OH)的清除效果图；

图7为本发明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对非酶系统产生的超氧自由基(O₂^-·)的清除效果图；

图8为本发明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对酶系统产生的超氧自由基(O₂^-·)的清除效果图；

图9为本发明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对被辐照小鼠胃保护效果的苏木精-伊红(H&E)染色图。

具体实施方式

本发明提出了一种石墨炔纳米材料作为自由基清除剂及辐射防护剂的新用途，为了使本发明的优点、技术方案更加清楚、明确，下面结合具体实施例对本发明做详细说明。

一、本发明所需原料均可通过商业渠道购买获得。

本发明提供的石墨炔材料的结构如图1所示，从图1可知，该材料由具有共轭大π键的苯基单元以及具有炔键的二炔基单元桥接而成。

实施例1：

经牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料的制备方法，包括以下步骤：

(1)将石墨炔粉末置于玛瑙研钵中研磨10min；

(2)将研磨后的石墨炔分散于超纯水中形成石墨炔的水溶液，石墨炔的水溶液浓度为1mg/mL；

(3)将石墨炔水溶液在超声破碎仪中进行冰浴超声破碎，超声破碎时间为12h，破碎功率为400W，得到石墨炔纳米材料的水溶液；

(4)将石墨炔纳米材料分散在超纯水中，得到石墨炔纳米材料的水溶液，石墨炔纳米材料的水溶液浓度为1mg/mL；

(5)将牛血清白蛋白溶解在超纯水中，得到牛血清白蛋白水溶液，牛血清白蛋白水溶液浓度为1mg/mL；

(6)将石墨炔纳米材料的水溶液与牛血清白蛋白水溶液混合，二者体积比为1:1，搅拌12h后对混合液在离心，混合液离心转速为12000rpm，离心时间为20min，然后将离心产物重新分散于超纯水中，得到牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料。

实施例2：

与实施例1不同之处在于：搅拌时间为10h。

实施例3：

与实施例1不同之处在于：搅拌时间为14h。

下面结合具体工艺参数对本发明的一个优选实施例做详细说明。

实施例4：

步骤一：将50mg石墨炔粉末置于玛瑙研钵中进行研磨10min，然后将研磨后的石墨炔分散于50mL超纯水中形成1mg/mL石墨炔的水溶液，随后将石墨炔水溶液在超声破碎仪中进行冰浴超声破碎12h，破碎功率为400W，得到1mg/mL石墨炔纳米材料的水溶液。

步骤二：取步骤一中的1mg/mL石墨炔纳米材料的水溶液15mL，逐滴加入1mg/mL牛血清白蛋白水溶液15mL，室温搅拌12h后对混合液在12000rpm下离心20min，然后将离心产物重新分散于超纯水中，得到牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料。

利用透射电子显微镜(JEM2100Plus)对本实施例得到的石墨炔纳米材料进行表征，结果如图2所示，从图中可以看出石墨炔纳米材料的粒径约10nm。

利用动态光散射(Omni)对本实施例得到的石墨炔纳米材料以及牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料进行表征，结果如图3所示，从图中可以看出石墨炔纳米材料(graphdiyne)的平均粒径为11.16nm，牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料(graphdiyne-BSA)的平均粒径为25.91nm。

作为本发明的主要创新之处在于：通过上述实施例1-实施例4制备得到的牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料，其既可以作为自由基清除剂，又可以作为辐射防护剂，相当于石墨炔纳米材料的新用途。

二、下面通过具体的实验来说明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料在自由基清除中的应用效果。

(1)牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对DPPH自由基清除效果的研究

DPPH是一种经典的体外自由基模型，它在517nm处具有特征吸收峰，当它与自由基清除剂发生反应后，特征吸收峰的吸收值就会降低，根据降低的程度就可以评估自由基清除剂对DPPH自由基的清楚效果。基于此，利用该原理来评价牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对DPPH自由基清除能力。

参见图4，图4为牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对DPPH自由基清除效果，其中DPPH自由基的浓度为100μM。由图可见牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对DPPH自由基具有良好的清除效果，并且该效果是呈现浓度依赖性的，牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料浓度越高，对DPPH自由基的清除能力就越强。

(2)牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对ABTS自由基清除效果的研究

ABTS是另一种经典的体外自由基模型，它在734nm处具有特征吸收峰，当它与自由基清除剂发生反应后，特征吸收峰的吸收值就会降低，根据降低的程度就可以评估自由基清除剂对DPPH自由基的清楚效果。由此，利用该原理来评价牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对ABTS自由基清除能力。

参见图5，图5为牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对ABTS自由基清除效果，由图可见牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对ABTS自由基具有良好的清除效果，并且该效果是呈现浓度依赖性的，牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料浓度越高，对ABTS自由基的清除能力就越强。

(3)牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对·OH清除效果的研究

·OH自由基是一种造成细胞内DNA损伤的重要自由基，因此评价材料对·OH的清除能力对于抵御ROS诱导的机体损伤具有重要的意义。本发明采用TMB显色法来检测牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对·OH清除效果。·OH由经典的Feton反应(H₂O₂+Fe²⁺)得到，生成的·OH能够氧化TMB形成蓝色的产物，该产物在652nm处具有特征吸收峰，如果在该反应体系中加入·OH清除剂，则氧化的程度就会降低，生成的蓝色的产物就会减少，反映为652nm处吸收值降低。

参见图6，图6为牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对·OH清除效果，由图可见当反应体系中不存在牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，得到的产物的吸收曲线在652nm处的值最大，当反应体系中存在50μg/mL牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，得到的产物的吸收曲线在652nm处的值有所降低，当反应体系中存在100μg/mL牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，得到的产物的吸收曲线在652nm处的值降低的更多，证明了牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料能够清除·OH，并且该效果是呈现浓度依赖性的，材料浓度越高，对·OH的清除能力就越强。

(4)牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对非酶系统产生的O₂^-·清除效果的研究

O₂^-·是另一种造成细胞损伤的重要自由基，同样的，评价材料对O₂^-·的清除能力对于保护机体具有重要的意义。本发明采用非酶O₂^-·清除法来评估牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对O₂^-·清除效果。这里的O₂^-·由NADH/PMS非酶反应系统生成，生成的O₂^-·可以与氯化硝基四氮唑蓝(NBT)反应形成在560nm处具有特征吸收的产物。如果在该反应体系中加入O₂^-·清除剂，则氧化的程度就会降低，生成的产物就会减少，反映为560nm处吸收值偏低。

参见图7，图7为牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对非酶系统产生的O₂^-·清除效果，由图可见，随着反应时间的进行，吸收都逐渐增加趋于平稳，代表着O₂^-·的生成；当反应体系中不存在牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，吸收值最大，表示O₂^-·生成的最多，当反应体系中存在50μg/mL牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，吸收值有所降低，表示O₂^-·的生成量减少，当反应体系中存在100μg/mL牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，吸收值更低，表示O₂^-·的生成量更少，证明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料能够清除O₂^-·，并且该效果是呈现浓度依赖性的，材料浓度越高，对O₂^-·的清除能力就越强。

(5)牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对酶系统产生的O₂^-·清除效果的研究

这里的O₂^-·由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶构成的酶反应系统生成，同样地，生成的O₂^-·可以与NBT反应形成在560nm处具有特征吸收的产物。如果在该反应体系中加入O₂^-·清除剂，则氧化的程度就会降低，生成的产物就会减少，反映为560nm处吸收值偏低。

参见图8，图8为牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对酶系统产生的O₂^-·清除效果，由图可见，当反应体系中不存在牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，吸收值最大，当反应体系中存在50μg/mL牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，吸收值有所降低，当反应体系中存在100μg/mL牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料时，吸收值更低，证明了牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料能够清除O₂^-·，并且该效果是呈现浓度依赖性的，材料浓度越高，对O₂^-·的清除能力就越强。

上述自由基清除研究表明，本发明所述的牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料可以有效的清除多种自由基，因此有望被用作新型的自由基清除剂。

三、本发明还提供上述牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料在辐射防护上的应用。

由于在放射治疗过程中，所采用的高能射线会辐解细胞内的水产生大量的自由基，这些自由基可以攻击细胞部件引起细胞损伤，最终造成对机体损伤，因此清除辐射诱导产生的过量自由基可以保护机体免受辐射损伤。上述实验已证明石墨炔材料具有自由基清除作用，基于此，本发明进一步将石墨炔材料应用于辐射防护。

本发明首次将石墨炔纳米材料应用在辐射防护上，不仅为辐射防护剂的开发提供了新的契机，也为石墨炔纳米材料在生物医学上的应用提供了一条新的途径。

下面通过具体的实验来说明牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料在辐射防护中的应用效果。

牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对胃的辐射防护的研究：

为了评价牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对胃的辐射防护效果，首先，在北京维通利华实验动物技术有限公司购买BALB/c雄鼠18只，并将其随机平均分配为3个小组(每组6只)：(ⅰ)PBS缓冲液组(control组)；(ii)单独X射线照射组(X-ray组)；(ⅲ)牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料与X射线照射组(graphdiyne-BSA+X-ray组)；对于(ⅰ)和(ii)组老鼠，尾静脉注射200μL PBS，对于(ⅲ)组老鼠，尾静脉注射200μL牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料。注射后，对(ii)和(ⅲ)组老鼠采用X-ray(6.5Gy)照射，7天后，处死小鼠，取出小鼠胃进行分析。

图9为牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对被辐照小鼠胃保护效果的胃壁直观图，在control组，单独X射线照射组，牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料与X射线照射组三个组中各取一个胃，去除胃中食物，对胃壁进行观察，

在实验中，对牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对被辐照小鼠胃保护效果进行分析，分为三组，分别为control组、单独X射线照射组和经牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料组，经试验观察，相比于control组，单独X射线照射组的小鼠的胃壁明显变薄；牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料与X射线照射组的小鼠的胃壁相比于control组的有一定程度的变薄，但是变薄的程度明显的低于X射线照射组，说明了牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料可以抵御辐射对胃壁的损伤。

图9为牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料对被辐照小鼠胃保护效果的H&E染色图，对control组，单独X射线照射组，牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料与X射线照射组三个组的小鼠的胃进行H&E染色分析。由图可见，对于control组，鳞状上皮及胃底腺型胃粘膜，大致正常，腺体排列规整，形态规则，细胞无明显异型，散在少许中性粒细胞浸润。对于单独X射线照射组，鳞状上皮及胃底腺型胃粘膜，表面粘膜广泛糜烂，腺体减少，细胞排列紊乱，结构破坏，细胞部分肿胀变性，少许炎细胞浸润。对于牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料与X射线照射组，胃底腺型胃粘膜，表面粘膜稍有糜烂，腺体排列规整，细胞形态大致正常。仅少数腺体结构仍紊乱，腺体有减少。由此可见，相比于control组，X-ray组病变情况最重，M+X-ray组部分粘膜已经出现明显修复，接近正常。说明了牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料可以抵御辐射引起的胃损伤。

上述辐射防护研究表明，本发明所述的牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料可以有效的保护辐射引起的胃损伤，因此有望被用作新型的辐射防护剂。

本发明提供了一种牛血清白蛋白修饰的石墨炔纳米材料，其制备方法简单易行，低成本，绿色环保。该材料可以有效地清除各种自由基，为新型的自由基清除剂开发提供了新的思路。同时，它还可以有效地抵御辐射引起的胃损伤，因此也为新型的辐射防护剂的开发提供了新的契机。

本发明中未述及的部分借鉴现有技术即可实现。

需要说明的是：在本说明书的教导下本领域技术人员所做出的任何等同方式，或明显变型方式均应在本发明的保护范围内。