一种STAT3抑制剂在增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用

摘要

本发明公开了一种STAT3抑制剂在增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。本领域技术人员知道，激活STAT3会促进肿瘤细胞的增殖并减弱其对NK细胞等免疫细胞的敏感性，STAT3的激活还会抑制NK细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，同时紊乱免疫细胞之间的调节，抑制免疫细胞向肿瘤的迁移。本发明发现，Lobocrassin C、Lobocrassin D为STAT3抑制剂，Lobocrassin C、Lobocrassin D通过抑制STAT3表达激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力；Lobocrassin E不具备这种作用。

说明书

技术领域

本发明属于免疫领域，涉及二萜类化合物及其衍生物在细胞免疫治疗方面的应用，具体涉及一种STAT3抑制剂在增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。

背景技术

近年来，肿瘤的免疫疗法在临床研究等方面取得了巨大的进展，但主要的研究都是针对特异性免疫系统中T细胞等展开的。然而，随着对属于固有免疫系统的自然杀伤(natural killer，NK)细胞研究的深入，其在肿瘤免疫疗法中的作用越来越受到重视。NK细胞是一类独立的淋巴细胞亚群，最近被发现是先天淋巴样细胞家族的初始成员。与T细胞和B细胞不同的是NK细胞不需要特异性的抗原刺激就可以杀伤靶细胞，具有免疫清除和免疫监视等功能。故NK细胞在抵御肿瘤，尤其是转移瘤细胞和微小肿瘤细胞的清除中起到重要作用。

STAT3和STAT5是JAK-STAT通路的重要组成部分。激活STAT3会促进肿瘤细胞的增殖并减弱其对NK细胞等免疫细胞的敏感性。另外STAT3的激活还会抑制NK细胞等免疫细胞对肿瘤的杀伤作用，同时紊乱免疫细胞之间的调节，抑制免疫细胞向肿瘤的迁移。因此抑制肿瘤微环境内的STAT3信号通路或许是治疗某些肿瘤的途径之一。STAT5既可促进肿瘤细胞的生长发育又可促进NK细胞的发育和细胞毒性。抑制NK细胞的STAT5水平不仅损害NK细胞的正常功能，而且促进肿瘤的生长。因而促进STAT5在NK细胞中的表达有利于对肿瘤的治疗(参考文献：STAT3、STAT5在NK细胞中的抗肿瘤作用研究进展，转化医学电子杂志2017年第4期第5卷)。

Lobocrassin C、Lobocrassin D、Lobocrassin E为从一种珊瑚中分离得到的二萜类化合物，结构式如下(参考文献：Terpenoids from the octocorals Menella sp.(Plexauridae)and Lobophytum crassum(Alcyonacea).MarDrugs,2012,10:427-438)。

现有技术没有报道过Lobocrassin C、Lobocrassin D用作STAT3抑制剂的用途，也没有报道过其可以提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

发明内容

本发明目的在于提供一种STAT3抑制剂在增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力方面的应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

Lobocrassin C或Lobocrassin D用作STAT3抑制剂的用途。

Lobocrassin C或Lobocrassin D用于增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的用途。

进一步地，所述肿瘤为胃癌。

一种STAT3抑制剂，含有Lobocrassin C或Lobocrassin D，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。

进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。

一种用于增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的药物制剂，含有Lobocrassin C或Lobocrassin D，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型。

进一步地，所述药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料。

进一步地，所述药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。

进一步地，所述肿瘤为胃癌。

本发明的技术效果：

本发明发现，Lobocrassin C或Lobocrassin D为STAT3抑制剂，Lobocrassin C或Lobocrassin D通过抑制STAT3的表达进而提高NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力。

附图说明

图1为各组NK细胞STAT3表达量及对胃癌细胞SGC-7901、BCG-823的杀伤力。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

一、实验材料

RPMI-1640、胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司；NK细胞培养基购自德国CellGro。

重组人白细胞介素2(rhIL-2)购自双鹭药业；淋巴细胞分离液购自NycomedPharma。

人胃癌细胞SGC-7901、BCG-823购自中国科学院上海细胞库。

二、实验方法

1、单个核细胞分离、分组及NK细胞培养

采集健康志愿者外周血，Ficoll密度梯度离心，分离获得外周血单个核细胞(PBMC)。Day 0，用含有5％自体血浆、80U/ml庆大霉素的NK细胞培养液将PBMC调至起始细胞数为1.0×10⁶/L，将细胞均分为对照组和给药组，对照组常规培养：day>2培养箱培养，以后每2天半量换液1次，将细胞数控制为1.0×10⁶/L。给药组(Lobocrassin>

2、Western blot测定各组NK细胞中STAT3的表达量

收集Day 10各组NK细胞，用细胞裂解液裂解细胞提取总蛋白。配制12％SDS-丙烯酰胺凝胶，将蛋白与5×loading buffer混合后上样，浓缩胶中恒压60V，分离胶加至120V，待电泳完成，将蛋白转至PVDF膜上(恒流150mA，3h)。用5％脱脂牛奶将膜封闭2h后用TBST洗膜3次，每次10min，一抗以工作浓度1:500，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的二抗(STAT3为兔抗1:10000；β-actin为鼠抗1:12000)。孵育2h，用ECL发光剂压胶片发光、显影，以STAT3与内参β-actin的灰度比值作为STAT3表达量。将对照组STAT3表达量归一化，计算各给药组STAT3表达量的归一化值。

3、NK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤力测定

胃癌细胞SGC-7901的培养：从液氮中取出SGC-7901细胞株，置于温水中快速复苏，接种于含10％胎牛血清RPMI-1640培养基的50mL培养瓶中，37℃，5％CO₂环境培养，每2d半量换液，观察细胞生长情况并及时换液和传代。

各组NK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤力测定：Day 10，以SGC-7901细胞为靶细胞(2×10⁴/孔，100μl/孔)，10:1效靶比加入96孔板，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，置于CO₂培养箱。18h后，每孔加入20μl>

杀伤率(％)＝(实验组OD值-效应细胞组OD值)/靶细胞组OD值×100％。

4、NK细胞对胃癌细胞BCG-823的杀伤力测定

胃癌细胞BCG-823的培养：从液氮中取出BCG-823细胞株，置于温水中快速复苏，接种于含10％胎牛血清RPMI-1640培养基的50mL培养瓶中，37℃，5％CO₂环境培养，每2d半量换液，观察细胞生长情况并及时换液和传代。

各组NK细胞对胃癌细胞BCG-823的杀伤力测定：Day 10，以对数生长期BCG-823细胞为靶细胞(2×10⁴/孔，100μl/孔)，10:1效靶比加入96孔板，另设靶细胞组和效应细胞组。每组设3复孔，置于CO₂培养箱。18h后，每孔加入20μl>

5、统计学方法

采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

三、实验结果

1、各组NK细胞中STAT3的表达量比较

Lobocrassin C组、Lobocrassin D组NK细胞中STAT3表达量显著低于对照组，Lobocrassin E组NK细胞中STAT3表达量与对照组无显著差异。

结果如表1所示。

2、各组NK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤力测定结果

Lobocrassin C组、Lobocrassin D组NK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤力显著高于对照组，Lobocrassin E组NK细胞对胃癌细胞SGC-7901的杀伤力与对照组无显著差异。

结果如表1和图1所示。

3、各组NK细胞对胃癌细胞BCG-823的杀伤力测定结果

Lobocrassin C组、Lobocrassin D组NK细胞对胃癌细胞BCG-823的杀伤力显著高于对照组，Lobocrassin E组NK细胞对胃癌细胞BCG-823的杀伤力与对照组无显著差异。

结果如表1和图1所示。

表1各组NK细胞STAT3表达量及对胃癌细胞SGC-7901、BCG-823的杀伤力

结果表明，Lobocrassin C、Lobocrassin D为STAT3抑制剂，Lobocrassin C、Lobocrassin D通过抑制STAT3表达激活NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力；Lobocrassin E不具备这种作用。

实施例2：

一种STAT3抑制剂，含有Lobocrassin C或Lobocrassin D，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料，药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。

实施例3：

一种用于增强NK细胞对肿瘤细胞杀伤力的药物制剂，含有Lobocrassin C或Lobocrassin D，还含有药学上可以接受的载体或赋形剂，制成药学上可以接受的剂型；药学上可接受的载体或赋形剂包括一种或多种固体、半固体或液体辅料，药学上可以接受的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂。肿瘤细胞优选胃癌。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。