一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针及其应用

摘要

本发明公开了一种取代吲哚‑2‑羧酸类Bcl‑2小分子荧光探针及其应用。该荧光探针的结构通式如式如下所示：

说明书

技术领域

本发明涉及取代吲哚-2-羧酸衍生物及其作为Bcl-2小分子荧光探针，与其在Bcl-2抑制剂活性筛选、细胞毒性评价及细胞成像中的应用，属于药物技术领域。

背景技术

B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell leukemia/lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族是细胞凋亡内源性途径中重要的调控因子，在细胞凋亡通路中起着重要的调节作用。根据结构与功能不同，Bcl-2蛋白家族可分为抗凋亡家族蛋白和促凋亡家族蛋白。在正常的细胞中，促凋亡家族蛋白和抗凋亡家族蛋白异二聚体化，使细胞保持正常生长状态，既避免细胞过早凋亡又避免细胞因不发生凋亡而转化为肿瘤细胞。但在一些恶性肿瘤中，Bcl-2蛋白家族的抗凋亡蛋白成员过度表达，导致一般的化疗手段无法使肿瘤细胞发生凋亡，从而影响肿瘤的治疗效果，产生耐药性。因此，针对Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员的抑制剂研究已经成为近年来抗肿瘤药物的研究热点。

目前在哺乳动物体内已经发现超过25个Bcl-2蛋白家族成员，这些成员根据结构与功能不同可分为两个亚族：抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白。抗凋亡蛋白成员包括Bcl-2，Bcl-xl，Mcl-1，Al，Bcl-w，Bcl-RAMBO和Boo。该亚族成员能够抑制细胞凋亡,大部分(除了Mcl-1和A1)都含有四个Bcl-2同源区(Bcl-2homology,BH)BH1-BH4。促凋亡蛋白又可分为两个亚家族：含有2-3个保守区域的多区域促凋亡蛋白亚家族(Bak、Bax等)和只含有一个保守BH3区域的BH3-only蛋白(Bad、Bik、Bid、Bim、Hrk、Bmf、Puma、Noxa等)。

Bcl-2蛋白家族是细胞凋亡线粒体途径中关键调节因子，通过调节线粒体膜通透性调控细胞凋亡。正常情况下，Bax和Bak与Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员(如Bcl-2、Mcl-1等)相互结合以非活性的单体形式存在。非活性的Bax主要分布于细胞质中，而Bak则主要镶嵌在线粒体外膜上。当细胞接受凋亡信号之后，一些BH3-only蛋白(如Bad、Noxa等)竞争性与Bcl-2抗凋亡成员的疏水结合域相结合，释放出被抑制的Bax和Bak蛋白。此后，另一些BH3-only蛋白(如Bim、Puma等)可直接与Bax和Bak蛋白相互作用使其活化。活化的Bax和Bak蛋白在线粒体外膜上发生寡聚化，使细胞通透性孔打开，膜通透性增大而释放细胞色素c等细胞凋亡因子，诱导细胞凋亡。因此，抑制肿瘤细胞的Bcl-2蛋白家族抗凋亡成员可促进肿瘤细胞的凋亡。目前，约有五类Bcl-2抑制剂，其中大部分已处于临床研究例如Gossypol处于I/II期临床等，但是经过临床研究发现，由于细胞凋亡途径的多样性，部分抑制剂仍无法使肿瘤细胞发生凋亡，从而影响肿瘤的治疗效果，产生耐药性，从而导致该类药物的临床应用受到很大限制。

小分子荧光探针具有快速、灵敏、高通量和易于自动化等特点在蛋白标记与成像技术中有着重要的作用，目前小分子荧光探针已经广泛应用于蛋白质、核酸等重要生物分子的生物学和药理学检测中，对疾病机制探讨、临床诊断及药物筛选等领域的发展具有重要的意义。但是能够专一地与目标蛋白结合的小分子探针较少，设计和合成方法的缺乏是主要因素，目前还没有用于研究Bcl-2家族蛋白间相互作用的小分子荧光探针。鉴于此，为了更深入了解Bcl-2蛋白间的作用机制及发现更有效的抑制剂，亟待研发一种可以特异性结合Bcl-2蛋白的小分子探针。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明提供一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针及其制备方法、光学活性、生物活性和在制药领域中的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针，具有下述结构通式：

通式I中，R₁为各类荧光团；R₂为卤素；

通式II，R₃为各类荧光团；R₄为卤素。

优选地，所述R₁为萘磺酰胺类和AIE类荧光团；R₂为氯；R₃为萘磺酰胺类荧光团；R₄为氯；

更优选地，本发明的取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针选自如下结构式的化合物：

该取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针L1的制备方法，其反应过程如下：

优选的，具体步骤为：

(1)4-氯苯胺在盐酸与亚硝酸钠条件下生成重氮盐，重氮盐再与2-环戊酮甲酸乙酯生成中间体2，

(2)中间体2经过成酯反应得到中间体3，

(3)中间体3再经环合反应得到产物4，

(4)产物4经脱保护反应得到中间体5。

(5)化合物6在氨气条件下得化合物7，

(6)关键中间体5与7酰胺缩合再经脱乙酯反应，则可得终产物L1。

进一步优选的，所述步骤(1)的具体步骤为：盐酸被加入圆底烧瓶中，加入水，之后，在冰浴条件下，3-氯苯胺被加入到反应瓶中，5分钟后亚硝酸的水溶液被逐渐加入。2-环戊酮甲酸乙酯被溶于EtOH中，然后和KOH溶液被逐渐滴入，半小时后，3-氯苯胺的反应液逐渐被加入到后者反应液中，混合反应液于40℃油浴中反应1h。反应液被浓缩得到粗产品2，未经纯化直接进行下一步反应。

所述的盐酸、水：3-氯苯胺、亚硝酸、2-环戊酮甲酸乙酯、EtOH及氢氧化钾的使用比为(7m，1M)L：9mL：(1.27g，10mmol)：(1.38g，20mmol)：(2.5mL，15mmol)：(5.0g，90mmol)。

进一步优选的，所述步骤(2)的具体步骤为：化合物2溶于乙醇溶液中浓硫酸被逐渐加入。混合反应液回流反应2h，后反应液恢复至室温，蒸除乙醇溶剂用乙酸乙酯进行萃取，干燥浓缩后经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝5:1)得到纯产物3。

所述的化合物2、乙醇及浓硫酸的使用比为(3.3g，10mmol)：25mL：3mL。

所述的产物3为浅黄色固体，产率为40％，mp：81-83℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ9.86(s,1H),7.40-7.39(m,1H),7.28(s,1H),7.23-7.22(m,1H),6.94-6.91(m,1H),4.36-4.27(m,4H),2.65-2.61(m,2H),2.50-2.47(m,2H),1.80-1.74(m,2H),1.43(t,J＝8.0Hz,3H),1.37(t,J＝8.0Hz,3H)。

进一步优选的，所述步骤(3)的具体步骤为：中间体3溶于甲苯中，对甲苯磺酸被加入反应液回流12h。冷却反应液后旋除溶剂用乙酸乙酯萃取，干燥旋干后得的油经重结晶(正己烷)得到纯的化合物4。

所述的中间体3、甲苯、甲苯磺酸的使用比为(0.68g，2mmol)：10mL：(0.58g，3mmol)。

所述的产物4为浅黄色固体，白色固体，产率为83％，mp：93-95℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ9.91(d,J＝12.0Hz,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),7.39(s,1H),7.15-7.12(m,1H),4.46-4.42(m,2H),4.19-4.09(m,2H),3.76-3.72(m,1H),3.42(t,J＝8.0Hz,1H),2.74-2.67(m,2H),1.47-1.44(m,3H),1.30(t,J＝8.0Hz,1H),1.24(t,J＝8.0Hz,2H)。

进一步优选的，所述步骤(4)的具体步骤为：化合物4被加入到圆底烧瓶中，冰醋酸被加入。后浓HCl被加入然后反应液被加热至80℃。三小时后，水被加入出现白色固体后被过滤得产物5.

所述的化合物4、冰醋酸、浓HCl、水的使用比为(0.32g，1mmol)：3.5mL：0.5mL：10mL。

所述的产物5为白色固体，产率为89％，mp：210-213℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ12.09(s,1H),11.71(s,1H),7.74(d,J＝8.0Hz,1H),7.42(t,J＝4.0Hz,1H),7.11-7.07(m,1H),4.36-4.32(m,2H),4.27(t,J＝8.0Hz,2H),2.53(t,J＝8.0Hz,2H),1.37(t,J＝8.0Hz,3H)。

进一步优选的，所述步骤(5)的具体步骤为：化合物6溶于的二氯甲烷中，通入氨气，15min后，停止反应，溶剂被旋除，白色逐渐析出过滤得产物7。

所述的化合物6、二氯甲烷的使用比为(0.5g，1.8mmol)：10mL。

所述的产物7为白色固体，产率为99％，mp：210-213℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ8.43(d,J＝8.0Hz,1H),8.30(d,J＝8.0Hz,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,1H),8.13(d,J＝8.0Hz,1H),7.63-7.56(m,4H),7.26(d,J＝8.0Hz,1H),2.83(s,6H)。

进一步优选的，所述步骤(6)的具体步骤为：中间体5溶于干燥的二氯甲烷中，在冰浴条件下，DIEA被加入，10分钟后,HATU被加入，反应液变浑浊继续搅拌半小时后，化合物7被加入。反应液被搅拌过夜后用二氯甲烷进行萃取，干燥旋除溶剂后得黄色油，油经简单柱层析得产物8，未经二次纯化直接进行下一步反应。重要中间体8被溶于乙醇中，50％的NaOH液被加入到反应液中，室温下反应过夜，溶剂被蒸除，水被加入后用1M HCl调pH至中性出现白色固体，白色固体过滤并被乙醇与水重结晶得到纯的终产物L1。

所述的化合物中间体5、二氯甲烷、DIEA、HATU、化合物7、NaOH、水的使用比为(0.15g，0.5mmol)：10mL：(0.19g，1.5mmol)：(0.23g，1.2mmol)：(0.14g，0.55mmol)：2mL：10mL。

所述的产物L1为黄色固体，产率为41％，mp：158-161℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ11.51(s,1H),8.44(d,J＝8.0Hz,1H),8.32-8.27(m,1H),8.18(d,J＝8.0Hz,1H),7.62-7.52(m,3H),7.34(s,1H),7.22-7.15(m,1H),7.02(d,J＝8.0Hz,1H),6.94(d,J＝12.0Hz,1H),3.08(t,J＝8.0Hz,2H),2.83(s,6H),2.41(s,2H).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ173.34,163.52,151.72,137.84,136.52,129.95,129.79,129.68,129.41,129.28,128.02,126.19,125.82,123.91,122.40,121.56,120.08,119.57,115.27,112.03,45.52,38.29,20.06HRMS(ESI)m/z>35H₃₈BrN₈O₅S([M-H]^-)761.1869；found>

该取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针L2的制备方法，其反应过程如下：

优选的，具体步骤为：

(1)中间体5经缩合反应后还原得到化合物10。

(2)化合物10与丹酰氯反应再经脱乙酯反应得终产物L2。

进一步优选的，所述步骤(1)的具体步骤为：

a.中间体5溶于THF液中,SOCl₂和DMF被后续加入。反应液在室温下被搅拌2个小时。然后，氨气被通入到反应液中。氨气饱和后搅拌1小时，溶剂被除掉加入大量水，白色固体出现被过滤得到纯的产物9。

b.化合物9溶于THF，硼烷的THF液在氮气保护的条件下被加入。混合反应液在常温下被搅拌16h，反应结束后，加入大量乙醇淬灭反应后浓缩，后续HCl被加入回流反应1h，反应液后被氢氧化钠液中和并用乙酸乙酯进行萃取，浓缩后得到粗产物后经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得到苍白色产物10，未经二次纯化直接进行下一步反应。

所述步骤a中的化合物中间体5、THF、SOCl₂、DMF的使用比为(0.30g，1mmol)：15mL：0.11mL：2d。

所述的产物9为白色固体，产率为100％，mp：228-230℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ11.67(s,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.41-7.39(m,1H),7.23(t,J＝8.0Hz,1H),7.13-7.06(m,1H),6.74-6.71(m,1H),4.37-4.32(m,2H),3.24-3.16(m,2H),2.39-2.33(m,2H),1.38(t,J＝8.0Hz,3H)。

所述步骤b中的化合物9、THF、硼烷的THF液、HCl的使用比为：(0.58g，2mmol)：5mL：(8mL,8mmol)：(3M，4mL)。

进一步优选的，所述步骤(2)的具体步骤为：

a.产物10溶于THF中，Et₃N被加入。搅拌0.5h后，丹酰氯被加入并搅拌过夜。然后，THF溶剂被蒸除得粗品经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝7:1)得到纯的产物11。

b.产物11溶于无水乙醇中，50％NaOH溶液被加入，后混合液室温下搅拌过夜。第二天，乙醇溶剂被旋除，15mL水被加入。反应液被1M HCl溶液中和，白色固体出现并被过滤得粗产物，粗产物后经乙醇与水重结晶得到纯的终产物L2。

所述步骤a中的产物10、THF、Et₃N、丹酰氯(0.13g，0.5mmol)：20mL：(0.15mL，1.05mmol):(0.15g，0.525mmol).

所述的产物11为黄色固体，产率为84％，mp：118-120℃。¹H-NMR(400MHz,CDCl₃),δ11.61(s,1H),8.45(d,J＝8.0Hz,1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,1H),7.94(s,1H),7.60(t,J＝8.0Hz,2H),7.40-7.37(m,2H),7.26(d,J＝8.0Hz,1H),6.99(d,J＝8.0Hz,1H),4.28-4.23(m,2H),2.81(s,10H),1.56-1.53(m,2H),1.26-1.23(m,3H).

所述步骤b中的化合物11、NaOH、水使用比为70mg：1.5ml：15mL。

所述的产物L2为黄色固体，产率为86％，mp：70-73℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ10.96(s,1H),9.20(s,1H),8.42(t,J＝8.0Hz,2H),8.05(dd,J₁＝8.0Hz,J₂＝4.0Hz,1H),7.61-7.53(m,2H),7.31-7.28(m,2H),7.24(d,J＝8.0Hz,1H),6.87(dd,J₁＝8.0Hz,J₂＝4.0Hz,1H),2.97-2.94(m,2H),2.81(s,6H),2.70-2.49(m,2H),1.54-1.47(m,2H).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ163.51,151.79,136.63,136.53,129.81,129.53,129.49,128.70,128.27,126.29,125.36,124.02,122.35,122.17,120.12,119.56,115.54,112.08,45.49,42.95,31.12,21.69.HRMS(ESI)m/z>35H₃₈BrN₈O₅S([M-H]^-)761.1869；found761.1867.

该取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针L3的制备方法，其反应过程如下：

优选的，具体步骤为：

(1)关键中间体5与丙炔胺酰胺缩合得12，

(2)二苯甲烷与4-甲基二苯甲酮反应再经脱水、溴代、亲核取代反应得产物16，

(3)关键中间体16与12经Click反应后经脱保护反应得到终产物L3。

进一步优选的，所述步骤(1)的具体步骤为：加入炔丙胺(30mg，0.55mmol)于一个圆底烧瓶中，产物5和4-二甲氨基吡啶被溶于的二氯甲烷液中，EDCI在冰浴条件下被加入。搅拌过夜，用二氯甲烷对反应液进行萃取，干燥旋除溶剂后经柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝2:1)得到产物12。

所述的化合物炔丙胺、产物5、4-二甲氨基吡啶、二氯甲烷液、EDCI的使用比为(30mg，0.55mmol)：(0.15g，0.5mmol)：(74mg，0.6mmol)：100mL：(0.29g，1.5mmol)。

所述的产物12为粉红色固体，产率为42％，mp：180-183℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ11.93(s,1H),11.68(s,1H),7.73(d,J＝8.0Hz,1H),7.42-7.40(m,1H),7.10-7.06(m,1H),4.38-4.32(m,2H),3.88-3.86(m,1H),3.81-3.79(m,1H),3.53-3.48(m,1H),3.26(t,J＝8.0Hz,1H),3.10-3.07(m,1H),2.43-2.36(m,2H),1.38(t,J＝8.0Hz,3H).

进一步优选的，所述步骤(2)的具体步骤为：

a.干燥的THF液被加入到一个二颈瓶中后冷却至0℃在N₂保护条件下，正丁基锂被慢慢注入。搅拌过会，二苯甲烷被滴入。混合反应液在0℃条件下被搅拌1h，4-甲基二苯甲酮被加入到反应液中。后续反应液恢复至室温且搅拌过夜。反应完毕，大量饱和NH₄Cl溶液被加入淬灭反应后用二氯甲烷萃取，有机层被合并浓缩后加入石油醚，出现白色固体过滤得产物13。

b.在50mL的圆底烧瓶中加入化合物13和对甲苯磺酸，加入甲苯。反应液被回流4h。反应液冷却后，用正己烷进行萃取。溶剂被收集并浓缩。之后，石油醚被加入出现白色固体被过滤得中间体14。

c.在100mL的圆底烧瓶中加入的14、N-溴代丁二酰亚胺和过氧化苯甲酰，后续CCl₄被加入回流12h。当反应结束，大量水被加入并且用二氯甲烷进行萃取。合并有机层减压蒸除溶剂后用正己烷进行柱层析得纯产物15。

d.在100mL的双颈瓶中加入中间体15和叠氮化钠，加入DMSO，抽真空充氮气，在氮气保护下反应过夜。第二天，加入大量水后用大量二氯甲烷进行萃取，合并二氯甲烷浓缩后柱层析(石油醚：乙酸乙酯＝150:1)得到纯的产物16。

所述步骤a中的THF、正丁基锂、二苯甲烷、4-甲基二苯甲酮、石油醚的使用比为10mL：(5mL，2.5M)：(1.01g,10mmol)：(1.63g，8.3mmol)：10mL。

所述的产物13为白色固体，产率为86％，mp：138-141℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ7.47(t,J＝8.0Hz,5H),7.40(t,J＝8.0Hz,3H),7.13-6.92(m,11H),5.87(s,1H),

所述步骤b中的化合物13、对甲苯磺酸、甲苯、石油醚的使用比为(0.5g,10mmol)：0.01g：10mL：5mL。

所述的产物14为白色固体，产率为78％，mp：175-178℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ7.15-7.09(m,9H),6.98-6.93(m,8H),6.85(d,J＝8.0Hz,2H),2.20(s,3H).

所述步骤c中的中间体14、N-溴代丁二酰亚胺、过氧化苯甲酰、CCl₄使用比为(0.7g，2.0mmol)：(0.40g，2.2mmol)：0.005g：12mL。

所述的产物15为白色固体，产率为64％，mp：120-123℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ7.13-7.09(m,11H),7.03-6.98(m,8H),4.42(s,2H).

所述步骤d中的中间体15、叠氮化钠、DMSO的使用比为(0.21g，0.5mmol)：(0.048g，7.5mmol)：10mL。

所述的产物16为白色固体，产率为50％，mp：105-108℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ7.04-7.02(m,9H),6.97-6.94(m,10H),4.18(s,2H).

进一步优选的，所述步骤(3)的具体步骤为：

a.中间体12和中间体16加入50mL茄型瓶中，加入溶剂叔丁醇/水(2:1)。随后，抗坏血酸钠溶液和硫酸铜溶液被加入到反应液中。浑浊的反应液在避光条件下加热至50℃反应1h，然后冷却至室温。旋除溶剂加入二氯甲烷。有机层被收集并被干燥后减压浓缩后，经过简单得柱层析得粗品17。未经第二次纯化直接进行下一步反应。

b.关键中间体17溶于EtOH后加入50％NaOH溶液，搅拌12h后，反应溶剂被除掉后用1M HCl调节pH至中性出现白色固体，过滤出白色固体用乙醇和水重结晶得到终产物L3。

所述步骤a中的中间体12、中间体16、叔丁醇/水、抗坏血酸钠溶液、硫酸铜溶液使用比为(0.07g,0.2mmol)：(0.086g,0.22mmol)：10.0mL：(10mL，0.1M)：(0.1M，1.6mL)。

所述步骤b中的中间体17、EtOH、NaOH的使用比为：0.10g：5mL：2ml

所述的产物L3为灰色固体，产率为73％，mp：208-210℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ11.34(d,J＝8.0Hz,1H),9.16(s>1＝16.0Hz,J₂＝8.0Hz,2H),3.56(t,J＝8.0Hz,2H),2.45(t,J＝8.0Hz,1H),1.91(s,1H).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆):δ177.74,172.55,172.20,172.10,171.84,146.09,145.91,143.55,143.46,141.33,140.44,137.11,135.99,134.61,134.57,131.39,131.04,128.37,128.31,128.26,127.82,127.13,127.02,126.73,126.08,123.41,123.32,122.07,120.08,119.51,111.88,45.07,37.23,34.71,21.62,21.24.HRMS(ESI)m/z>42H₃₄ClN₅O₃([M-H]^-)690.2277；found>

该取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针L4的制备方法，其反应过程如下：

优选的，具体步骤为：

(1)丹酰氯与3-氨基-1-丙醇反应得化合物23,

(2)化合物23与21经光延反应得化合物24再经去乙酯反应得到终产物L4。

进一步优选的，所述步骤(1)的具体步骤为：丹酰氯被加入到一个100mL的圆底烧瓶中，加入二氯甲烷，3-氨基-1-丙醇被溶于Na₂CO₃溶液后加入到反应瓶中，混合反应液被剧烈搅拌1h。然后减压蒸除溶剂。向反应瓶中加入乙酸乙酯/石油醚(乙酸乙酯：石油醚)＝1:2，白色固体被过滤得纯产物23。

所述的化合物丹酰氯、二氯甲烷、3-氨基-1-丙醇、Na₂CO₃、乙酸乙酯/石油醚的使用比为(0.27g,1.00mmol)：10mL：(0.11g,1.50mmol)：(5.4mL，2M：10mL。

所述的产物23为白色固体，产率为84％，mp：118-120℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ8.62(d,J＝8.0Hz,1H),8.64(d,J＝8.0Hz,1H),8.62(d,J＝8.0Hz,1H),7.67-7.64(m,1H),7.46(s,2H),6.85(d,J＝8.0Hz,1H),4.50(s,1H),4.06(s,2H),3.37(s,8H),1.75(s,2H).

进一步优选的，所述步骤(2)的具体步骤为：

a.中间体23，化合物21和三苯基膦分别加入到一个二颈瓶中。在氮气保护下注入四氢呋喃溶剂，随后偶氮二甲酸二乙酯被缓慢注入，反应液加热至70℃回流反应24h。反应结束溶剂被减压蒸除。经过简单得柱层析得粗品24。未经二次纯化直接进行下一步。

b.关键中间体24溶于乙醇中，加入NaOH溶液吧，室温下搅拌过夜。第二天溶剂被除掉，加入1M HCl溶液调节pH至中性后未出固体，用乙酸乙酯进行萃取浓缩液用乙醇与水进行重结晶得纯的终产物L4。

所述步骤a中的中间体23、化合物21、三苯基膦、二甲酸二乙酯的使用比为(0.25g，1.1mmol)：(0.31g，1mmol)：(0.35g，1.32mmol)：(0.25g，1.43mmol).

所述步骤b中NaOH溶液为1mL 50％NaOH。

所述的产物L4为黄色固体，产率为88％，mp：200-203℃。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d₆),δ13.07(s,1H),8.45(d,J＝8.0Hz,1H),8.31(d,J＝8.0Hz,1H),8.05-7.99(m,2H),7.71(d,J＝8.0Hz,1H),7.62-7.57(m,2H),7.33(d,J＝8.0Hz,1H),7.27(d,J＝8.0Hz,1H),7.21-7.18(m,1H),7.16(s,1H),4.43(t,J＝8.0Hz,2H),2.87-2.74(m,6H),1.72-1.65(m,2H),1.24(s,1H),1.18(s,1H).¹³C-NMR(100MHz,DMSO-d₆)δ162.84,151.84,137.30,136.23,129.93,129.53,129.49,129.47,128.85,128.37,126.67,125.31,125.06,124.04,121.69,119.43,115.59,112.83,109.92,45.49,42.29,30.82.HRMS(ESI)m/z>24H₂₄ClN₃O₄S([M-H]^-)484.1098；found>

本发明的取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针可以用于Bcl-2蛋白及其高表达的肿瘤细胞或组织的标记。

本发明的取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针可直接反应化合物对Bcl-2的抑制活性，可用于Bcl-2抑制剂的高通量筛选及其在抗肿瘤评价中的应用。

本发明的取代吲哚-2-羧酸类Bcl-2小分子荧光探针可以作为识别Bcl-2s蛋白的探针及Bcl-2蛋白在生理、病理及相关疾病的应用。

本发明的有益效果：

1.响应基团新颖，选择性好。

2.本发明探针的制备方法反应条件温和，原料便宜易得，操作及后处理简单。

3.本发明的探针分子生物活性强，与Bcl-2家族蛋白的亲和力高，灵敏度高。

4.本发明的探针可以用于Bcl-2蛋白及其高表达的肿瘤细胞或组织的标记。

5.本发明的探针可直接反应化合物对Bcl-2的抑制活性，可用于Bcl-2抑制剂的高通量筛选及其在抗肿瘤评价中的应用。

6.本发明的探针可以作为识别Bcl-2蛋白的探针及Bcl-2蛋白在生理、病理及相关疾病中有广阔的应用前景。

附图说明

图1探针分子L1(A，10μM)或L2(B，10μM)在HeLa细胞有无抑制剂棉酚(10μM)存在条件下的成像(A、B：HeLa细胞；C：HEK293细胞；1,3,5：明场；2,4,6：探针分子绿色通道)镜头的放大倍数:63×。

图2探针分子L4(5μM)在HeLa细胞在有无抑制剂棉酚(5μM)存在条件下的成像(A、B：HeLa细胞；C：HEK293细胞；1：明场；2：探针分子绿色通道)镜头的放大倍数:63×。

图3探针L1(10μM)、L3(10μM)-L4(5μM)与HeLa细胞在有无相同浓度的棉酚在室温下避光孵育30min后经细胞流式仪测得流式结果(曲线1：空白对照；曲线2：探针加同浓度抑制剂；曲线3：探针)。

图4：HE染色(A)：鼠瘤组织切片；(B)：鼠正常组织切片；

图5：免疫组化实验(A)：肿瘤组织免疫组化(白光)；(C)：鼠肿瘤组织免疫组化GFP通道拍摄；(B)：鼠正常组织免疫组化(白光)；(D)：鼠正常组织免疫组化GFP通道拍摄。

图6：在GFP通道下的探针荧光成像实验：A与C为探针L1(10μM)与L3(10μM)鼠肿瘤组织成像；C与D分为探针L1(10μM)与棉酚(10μM)和L3(10μM)与棉酚(10μM)的鼠肿瘤组织成像；E与F分别为探针L1(10μM)与L3(10μM)鼠正常组织成像。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

实施例1光学活性的测定

表1：探针分子的光学特征

注：以上所有光学性质均在PH＝7.4的磷酸缓冲液中测量。

实施例2：生物活性的测定

以棉酚(Gossypol)为阳性药，采用FP或者TR-FRET实验，测定荧光探针分子与Bcl-2家族蛋白的结合活性实验，结果如表2所示。合成的探针分子L1、L3、L3的活性与阳性对照药棉酚活性相当，探针L4的活性较阳性对照药棉酚活性低。

表2：探针分子与Bcl-2家族蛋白的亲和力

实施例3：探针分子在Bcl-2高表达及低表达HEK293细胞成像中的应用

以探针分子L1与L3-L4为研究对象，考察其在细胞成像中的应用，选择Hela细胞为阳性细胞，选择HEK293为阴性细胞，在相同条件下，加入抑制剂棉酚作为阴性对照。具体步骤为：Hela细胞与HEK293细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基；在5％CO₂空气及37℃的环境中进行培养，成像前，将细胞接种于共聚焦小皿中，培养12-24h，将培养基吸掉，用不含血清的培养基洗涤一次，分别加入探针L1-L4(不含血清的培养基配制，浓度为1μM)；相同条件下，另一小皿分别加入探针L1-L4与抑制剂棉酚(不含血清培养基配制，L1与L3浓度为10μM，棉酚浓度为10μM；L4浓度为5μM，棉酚浓度为5μM)作阴性对照，孵育，然后吸出培养基，洗涤一次，用Zeiss>

成像结果如图1与图2所示，与阴性细胞对比下，探针分子能够标记Bcl-2高表达的Hela细胞，探针L1与L3-L4在Bcl-2生理、病理及相关疾病的研究中有广阔的应用前景。

实施例3：探针与细胞内蛋白相互作用探究实验

我们选择流失实验来探究探针分子与细胞中蛋白间的相互作用，我们采用细胞株为HeLa细胞，在实验前，将正处于指数增长的细胞离心后种于流失管中(每管>50万个细胞)，实验设置空白对照为不加探针，实验组只加探针和阴性对照组(加入同浓度的抑制剂棉酚和同浓度探针)，利用流式细胞仪进行流式实验。

流式实验结果(见图3)显示，相比空白对照组，加入探针后HeLa细胞被染色，当加入抑制剂后，细胞被染色程度下降说明我们探针是与抑制剂发生竞争作用，可以说明探针与抑制剂作用靶点为一致的为Bcl-2家族蛋白。

实施例4：探针在肿瘤与正常切片中的成像应用。

我们选择活性较好的探针L1与L3进行了鼠瘤切片实验，为了观察切片的肿瘤位置，我们对肿瘤切片与正常切片进行了HE染色和免疫组化实验，实验结果如下图4与图5所示，根据切片所示肿瘤位置，我们利用探针L1与L3进行了荧光成像实验。实验结果如图6所示，探针L1与L3可以标记肿瘤高发部位且与正常的组织或在有抑制剂棉酚竞争的情况下相比，仅用探针的肿瘤切片荧光强度更强，这些结果表明，我们的探针也许可用于临床肿瘤的诊断。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。