一种使用钯纳米复合物评价烟气暴露对细胞损伤的方法

摘要

本发明公开了使用钯纳米复合物评价烟气暴露对细胞损伤的方法，包括如下步骤：A、将钯纳米粒子充分分散于透明质酸胶体水溶液中，然后对混合物进行冷冻喷雾干燥，得到分散的表面包覆有透明质酸水凝胶的钯纳米粒子，即为所述钯纳米复合物；B、使待测细胞摄入所述钯纳米复合物；摄入后该钯纳米复合物以催化发夹组装方法与mRNA结合并进而通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA‑DNA，其可发荧光；然后，C、向包含受试细胞的样品溶液中加入上述钯纳米复合物并静置足够长时间，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测方法领域。

背景技术

人们抽吸烟草制品发出的烟雾时，呼吸道细胞会因直接暴露于烟气而受到不同程度的损伤。烟草企业一直在努力对烟草进行减害化处理以便减少这种损伤。已经开发出了各种减害化方法，为了评价减害效果的优劣，需要有一种评价烟气暴露对细胞损伤的方法，最好是定量化方法。

传统方法是取人体呼吸道细胞(例如人肺泡II型上皮细胞系A549细胞)使之暴露于烟气，通过检测烟气暴露后凋亡细胞的数量，来评价烟气暴露对细胞的损伤程度。该方法中需要使用荧光染色剂对细胞DNA进行染色，进而对活体细胞数量进行分析。但荧光染色剂会破坏细胞的活性并导致细胞内毒素的产生，这就可能对电子烟烟雾细胞暴露的结果进行干扰，影响了评价结果的准确性。

为此，需要提出更好的评价烟气暴露对细胞损伤的方法。

发明内容

本发明提供了一种使用钯纳米复合物评价烟气暴露对细胞损伤的方法，包括如下步骤：

A、将钯纳米粒子充分分散于透明质酸胶体水溶液中，然后对混合物进行冷冻喷雾干燥，得到分散的表面包覆有透明质酸水凝胶的钯纳米粒子，即为所述钯纳米复合物；

B、使待测细胞摄入所述钯纳米复合物；摄入后该钯纳米复合物以催化发夹组装方法与mRNA结合，结合有该钯纳米复合物的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，形成可在外界光辐射作用下发荧光的细胞；

C、向包含受试细胞的样品溶液中加入上述钯纳米复合物并静置足够长时间，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别在光辐射下测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定烟气暴露前后的细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。

各步骤具体如下：

A、复合纳米钯的制备

本发明选用钯纳米粒子作为载体与高分子材料进行结合制备无损细胞的钯纳米粒子复合物，纳米钯颗粒具有典型的纳米材料特性，即较大的比表面积，表面布满阶梯状结构，这种结构具有高表面能的不安定原子，即有许多不饱和化学键，这提供了较多的吸附位点与作用位点，极易同外来分子通过化学键结合。同时钯纳米粒子本身具有荧光介质的属性可在基因检测中提供荧光，避免使用化学荧光剂带来的细胞毒性，使用本发明可以实现细胞目标基因的无损检测。

使用原位合成法，通过三维复合搅拌技术将透明质酸水凝胶高分子网络体系与纳米钯粒子充分均匀混合，制备成纳米钯粒子透明质酸复合物，并形成稳定的配位化合物。

具体合成步骤如下：在室温光催化条件下，使用纳米钯颗粒与透明质酸水凝胶进行三维混合搅拌，混合搅拌速度90转/分钟。使用扫描电镜表征透明质酸水凝胶与钯纳米颗粒的结合程度。待纳米钯颗粒在透明质酸水凝胶中达到均匀分散即可停止搅拌。得到均匀稳定的纳米钯/透明质酸水凝胶复合物后对其进行冷冻干燥处理，最终得到纳米钯/透明质酸复合物颗粒，见图1。

B、纳米钯/透明质酸复合物组装

将制备好的钯纳米透明质酸复合物颗粒使用催化发夹组装(CHA，一种无需酶催化的扩增方法)的方法与DNA结合制备成为纳米分析平台。具体实施过程中纳米钯透明质酸颗粒使用催化发夹组装方法与mRNA结合。带有钯纳米颗粒透明质酸复合物的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA。

钯纳米透明质酸复合物颗粒的作用是光照介质。该纳米平台不仅可以增加灵敏性还可以使mRNA在细胞中特异成像。本发明的钯纳米透明质酸复合物颗粒与mRNA存活素的区别是存活素在不同细胞中有不同的效率，而钯纳米透明质酸复合物颗粒靠光辐射能提供高效的光照介质。该钯纳米透明质酸复合物颗粒的使用是灵敏度高和特异性好的细胞内成像介质。

C、荧光强度检测

向包含受试细胞的样品溶液中加入上述钯纳米复合物并静置足够长时间，然后在暴露于烟气捕集物之前和之后，分别在光辐射下测定细胞发出的荧光强度，根据二者比例确定烟气暴露前后的细胞凋亡率，进而评价烟气暴露对细胞的损伤程度。

本发明的有益效果：

1、本发明使用透明质酸水凝胶包裹钯纳米粒子，使得其被细胞摄入后，不会杀灭细胞，而是能稳定存在于活体细胞中。如果没有该透明质酸水凝胶包裹，则钯纳米粒子会因其强杀菌性而杀死待测细胞。

2、避免了有细胞毒性的常规荧光染色剂的使用，使得测定结果更准确。

附图说明

图1是本发明中制备的钯纳米复合物的扫描电镜照片(a,b,c,d为复合物间不同的结合状态)。

具体实施方式

实施例1

首先，通过如下方式制备表面包覆有透明质酸的钯纳米粒子。

在室温和光催化条件下，使用长度约为50-70nm直径约为40-60nm的球状纳米钯颗粒与透明质酸水凝胶进行混合搅拌，混合搅拌速度90转/分钟。使用扫描电镜表征透明质酸水凝胶与钯纳米颗粒的结合程度。待纳米钯颗粒在透明质酸水凝胶中达到均匀分散即可停止搅拌。得到均匀稳定的纳米钯/透明质酸水凝胶复合物后对其进行冷冻干燥处理，最终得到纳米钯/透明质酸复合物颗粒，见图1(a,b,c,d分别为不同连接形态的钯纳米粒子复合物)。然后，采用Coresta抽吸模式，用剑桥滤片捕集新型烟草制品受热后产生的烟气，然后用溶剂浸泡剑桥滤片将捕集到的烟气转移到溶液中，作为待测溶液。取人肺泡II型上皮细胞系A549细胞作为受试细胞。

将含有上述细胞的培养液均分为两份，一份直接加入本发明的纳米钯/透明质酸复合物颗粒，本发明的纳米钯/透明质酸复合物颗粒能够与活体细胞中的mRNA结合，进而结合有纳米钯/透明质酸复合物颗粒的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，结合有纳米钯/透明质酸复合物颗粒的mRNA-DNA在氩离子激光器发出激光照射下能发出金属粒子外层电子发生跃迁发出荧光，充分反应后，测定其初始荧光强度。

另一份则向细胞培养液中加入上述含有烟气捕集物的待测溶液，并在适合细胞存活的温度下静置足够长时间后，再加入本发明的纳米钯/透明质酸复合物颗粒，由于本发明的纳米钯/透明质酸复合物颗粒能够与活体细胞中的mRNA结合，进而结合有纳米钯/透明质酸复合物颗粒的mRNA通过碱基互补配对原则进行基因杂交形成mRNA-DNA，而死去的细胞则不会发生上述结合过程，故通过检测荧光强度并与初始荧光强度相比较，就能够方便快捷地检测存活的细胞比例。以此存活细胞的比例，来评价烟气捕集物的细胞毒性。

对比例1

使用同样的钯纳米粒子，但未经透明质酸包裹，结果发现，向受试细胞中加入钯纳米粒子后，由于钯纳米粒子强大的杀菌作用，受试细胞全部被杀死，无法进行后续实验。