基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法

摘要

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法。该方法为以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。石墨烯的负载增大了电信号，增加了传感器的灵敏度和稳定性。本发明利用自组装技术和静电吸附减小酶的失活，使得酸性磷酸酯酶生物传感器的稳定性与重现性好，增加了酸性磷酸酯酶生物传感器的寿命。

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法。

背景技术

酶是人们体内一种非常重要的物质，酶可以催化反应，降低反应所需的活化能，加快反应速率。酶还具有以下特点：高专一性、可调节性、高效率、高不稳定性。例如：胰蛋白酶是由胰腺分泌的，它主要是起消化作用，分解蛋白质，利于小肠的吸收，此外，如果胰蛋白酶的活性升高或降低可以导致人们身体不适。再如，酸性磷酸酯酶(ACP)是一种水解酶，它可以将人们体内的物质水解，促进体内物质的代谢。ACP存在于肾、肝等部位，当这些部位发生病变时，体内的ACP会升高。

石墨烯具有优良的导电性，是制备生物传感器的一种理想的电极材料。它可以加快电子的运动速率，使传感器的检测性增强，反应速度更快，可以改善传感器的灵敏度等性能。

中国专利103743797A公开一种利用石墨烯组装多层生物酶传感器提高检测性能的新方法，以期利用一种带有大π环端基的试剂芘丁酸，通过与生物酶(以葡萄糖氧化酶为例)表面的氨基基团的酰胺化反应，对其进行改造，得到表面具有大π环端基的葡萄糖氧化酶。改造后的葡萄糖氧化酶利用石墨烯通过层层组装的方法固定在电极的表面，制备出层数可控、灵敏度高的生物酶传感器。通过π-π叠加作用将改性酶与石墨烯进行层层组装，从而解决了层数可控、结构有序、性能稳定的生物传感器组装问题，能大大提高此生物酶传感器的检测灵敏度和检测范围。该专利中的石墨烯的作用是与改性酶通过π-π叠加作用形成生物传感器。

目前还未发现由氧化石墨烯与酸性磷酸酯酶共同制备生物传感器的有关报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法，得到的酸性磷酸酯酶生物传感器的稳定性与重现性好，寿命长。

本发明所述的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的构建方法：以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。

优选地，将金电极通过自组装L-半胱氨酸得到自组装金电极，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，再在其表面负载羧基化氧化石墨烯，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，最后修饰酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器，包括以下步骤：

(1)制备自组装金电极

将金电极置于铁氰化钾溶液中，利用循环伏安法扫描至稳定，之后浸泡于L-半胱氨酸溶液中，得到自组装金电极；

(2)制备羧基化氧化石墨烯

在浓硫酸中依次加入石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾，升温反应，反应完毕再加入双氧水反应，得到氧化石墨烯；氧化石墨烯与氢氧化钠、溴乙酸反应，得到羧基化氧化石墨烯；

(3)制备基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器

步骤(1)自组装金电极经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，将羧基化氧化石墨烯负载到初次活化后的自组装金电极上，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，再将酸性磷酸酯酶修饰到再次活化后的自组装金电极上，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。

其中：

步骤(1)中，采用平均粒度为0.05μm的氧化铝粉对金电极抛光；

步骤(1)中，铁氰化钾溶液的浓度为2.5×10^-5mol/L，铁氰化钾溶液中含有氯化钾，氯化钾的浓度为10mmol/L；

步骤(1)中，L-半胱氨酸溶液的浓度为1×10^-3mol/L；

步骤(1)中，浸泡温度3-5℃，浸泡时间为10-15h。

步骤(2)中，石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾、浓硫酸、双氧水的用量比为1-2:1-2:5-6:20-25:4-6，其中石墨粉、硝酸钾、高锰酸钾以g计，浓硫酸、双氧水以ml计；

步骤(2)中，氧化石墨烯、氢氧化钠、溴乙酸的质量比为0.1-0.3:5-7:4-6；

步骤(2)中，采用3-7wt.％的氯化氢溶液洗涤至中性，得到氧化石墨烯。

步骤(3)中，自组装金电极经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化后，将羧基化氧化石墨烯溶液滴加到初次活化后的自组装金电极上，晾干，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化后，再将酸性磷酸酯酶溶液滴加到再次活化后的自组装金电极上，晾干，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。

步骤(3)中，羧基化氧化石墨烯与L-半胱氨酸的摩尔比为1:1-1.2。

步骤(3)中，酸性磷酸酯酶溶液的浓度为3-4mg/ml。

步骤(3)中，初次活化时间为20-30min；再次活化时间为15-30min。

本发明通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)溶液对电极进行活化，并且利用静电吸附减小酶的失活。EDC/NHS溶液中，EDC与NHS的质量比为本领域技术人员的常规选择，本发明优选质量比为1:1。

本发明首先将L-半胱氨酸修饰到金电极上，得到自组装金电极，然后在自组装金电极上负载羧基化氧化石墨烯与酸性磷酸酯酶，最终得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。其反应过程如下：

本发明的Au与L-半胱氨酸的-SH结合后，生成Au—S—L-Cys—NH₂，Au—S—L-Cys—NH₂的氨基与羧基化氧化石墨烯的一个羧基反应生成Au—S—L-Cys—NHOC—CGO—COOH，羧基化氧化石墨烯的另一个羧基再与ACP上的氨基反应，得到Au—S—L-Cys—NHOC—CGO—COHN—ACP，即本发明的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。

本发明的有益效果如下：

本发明以自组装金电极为载体，在其表面负载羧基化氧化石墨烯、酸性磷酸酯酶，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。石墨烯的负载增大了电信号，增加了酸性磷酸酯酶生物传感器的灵敏度和稳定性。本发明利用自组装技术和静电吸附减小酶的失活，使得酸性磷酸酯酶生物传感器的稳定性与重现性好，增加了酸性磷酸酯酶生物传感器的寿命。

附图说明

图1是金电极、自组装金电极、酸性磷酸酯酶生物传感器的循环伏安扫描图；

其中：a：酸性磷酸酯酶生物传感器；b：自组装金电极；c：金电极；

图2是pH值对酸性磷酸酯酶生物传感器的影响图；

图3是温度对酸性磷酸酯酶生物传感器的影响图；

图4是酸性磷酸酯酶生物传感器的动力学性能图。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明做进一步描述。

实施例1

(1)制备自组装金电极

将直径为1mm的金电极用0.05μm Al₂O₃粉抛光至镜面，用蒸馏水冲净，然后放到乙醇和水配制的溶液中，在超声波中清洗15min，取出自然晾干，在2.5×10^-5mol/L的铁氰化钾溶液(含10mmol/L>

再将金电极浸泡在1×10^-3mol/L的L-半胱氨酸溶液中，在4℃冰箱中浸泡自组装12h，得到自组装金电极。

(2)制备羧基化氧化石墨烯

先称取2.0000g石墨粉、1.0000g硝酸钾和6.0000g高锰酸钾，然后准备一个250ml圆底烧瓶放到冰浴中，加入23ml浓硫酸打开搅拌器，分别缓慢加入石墨粉和硝酸钾搅拌均匀，然后再分次加入高锰酸钾控制温度不高于20℃，搅拌20min升温到35℃，继续搅拌2h使其充分反应，加入46ml蒸馏水，搅拌20min后加入5ml H₂O₂，溶液变为亮黄色，再升温到98℃，保温10min，趁热过滤，然后用5wt.％的氯化氢溶液洗涤至中性，得到的氧化石墨烯，在烘箱中烘干备用；

称取氧化石墨烯0.2000g放到150ml的烧杯中，加入100ml蒸馏水混匀，然后再分别称取6.0000g NaOH和5.0000g CH₃COOBr，放在盛有氧化石墨烯的烧杯中，在超声清洗仪中超声3h，然后离心，洗涤至中性，干燥箱中烘干，得到羧基化氧化石墨烯。

(3)制备基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器

将自组装金电极用蒸馏水淋洗，经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液初次活化20min，配置浓度为3mg/ml的羧基化氧化石墨烯溶液，用移液枪取10μL羧基化氧化石墨烯溶液，滴加到初次活化后的自组装金电极上，自然晾干；经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺溶液再次活化20min后，再用移液枪取10μL浓度为3.63mg/ml ACP溶液，滴加到再次活化后的自组装金电极上，自然晾干，得到基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器。

本发明分别以实施例1中的金电极、自组装金电极、酸性磷酸酯酶生物传感器作为工作电极，铂电极为辅助电极、饱和甘汞电极为参比电极，在2.5×10^-5mol/L铁氰化钾(含10mmol/LKCl)中，进行循环伏安扫描实验，结果如图1所示。从图中可以得知金电极修饰上L-半胱氨酸后，阻碍了电子的转移，使电流减小，可逆性变差。而酸性磷酸酯酶生物传感器的电流增大，说明酸性磷酸酯酶促进了电子转移，可逆性变好。

本发明对实施例1中的基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器的使用条件作出了以下研究：

(1)缓冲溶液及其pH值对酸性磷酸酯酶生物传感器的影响

将基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器分别在醋酸缓冲溶液与磷酸缓冲溶液中进行活性检测，结果显示，酸性磷酸酯酶在磷酸缓冲溶液中的活性最大；

另外，还研究了缓冲溶液的pH值对酸性磷酸酯酶生物传感器的影响：将酸性磷酸酯酶生物传感器分别放在pH值为4.00、4.50、4.70、5.00、5.50、6.00、6.50的浓度为1×10^-3mol/L的5’-AMP(0.2mol磷酸氢钠和0.2mol磷酸二氢钠配制)中，结果如图2所示，从图中可以看出：随着pH值升高，电流也随之增加，在pH值为5.50时获得的电流最大，当pH值为6.00时，溶液偏碱性，抑制了酶的活性，导致电流减小。则pH值为5.50时，酸性磷酸酯酶的活性达到最大。

(2)温度对酸性磷酸酯酶生物传感器的影响

将酸性磷酸酯酶生物传感器置于pH值为5.50的磷酸缓冲溶液中，改变温度，对其进行检测，结果如图3所示。从图中可以看出，随着温度的不断升高，电流也在不断增大，当温度达到35℃时，酸性磷酸酯酶的活性最大，当温度超过35℃时，电流呈下降趋势，说明酸性磷酸酯酶的活性受到抑制或失活。则35℃时，酸性磷酸酯酶的活性达到最大。

(3)动力学分析

将酸性磷酸酯酶生物传感器置于35℃，pH值为5.50的5’-AMP缓冲溶液(0.2mol磷酸氢钠和0.2mol磷酸二氢钠配制)，改变5’-AMP缓冲溶液的浓度，记录下初始电流，隔五分钟测一次，求出电流差，再求出电流速度V，测试五组，结果如图4所示。从图中可以看出，电流随着5’-AMP的浓度不断增大而增大，呈良好的线性关系I＝0.927c+0.1674，相关系数为0.9968；根据出米氏方程可知，Km值为5.54，Vmax为5.974。其中Vmax为最大反应速率，K_m为米氏常数，[S]为底物5’-AMP浓度(mmol/L)。

根据动力学分析，将5’-AMP缓冲溶液的浓度固定，就可以得到样品的电流速度V，本领域技术人员就可以判断出样品中酸性磷酸酯酶的活性。

(4)酸性磷酸酯酶生物传感器的重现性、稳定性

对基于巯基功能化石墨烯自组装的酸性磷酸酯酶生物传感器进行了重现性、稳定性研究：

将含有酸性磷酸酯酶、羧基化氧化石墨烯的混合物在4℃冰箱中反应12h后，将L-半胱氨酸修饰的自组装金电极浸泡在混合物中，得到酸性磷酸酯酶生物传感器，再将酸性磷酸酯酶生物传感器保存5-7天。经计算相对标准偏差为0.75％；7天以后，相对标准偏差开始增大，说明酸性磷酸酯酶生物传感器的重现性良好。

将同一支L-半胱氨酸修饰的自组装金电极在4℃冰箱中，置于浓度为3.63mg/ml的酸性磷酸酯酶中储存7天，将其取出后放入2×10^-5mol/L的铁氰化钾溶液中，然后测定传感器的电流，结果电流变化值为5％，表明该传感器在长时间内具有良好的稳定性，使用寿命可达20天以上。

因此，本发明制得的酸性磷酸酯酶生物传感器重现性、稳定性良好，可以用于酸性磷酸酯酶的动力学分析。酸性磷酸酯酶生物传感器在35℃，pH值为5.50的磷酸缓冲溶液中酸性磷酸酯酶的活性最大。