miR-582在制备前列腺癌骨转移的诊断、预后试剂盒及药物中的应用

摘要

本发明公开了miR‑582在制备前列腺癌骨转移的诊断、预后试剂盒及药物中的应用。发明人意外地发现miR‑582‑3p和miR‑582‑5p在骨转移的前列腺癌组织中低表达，并且miR‑582‑3p或miR‑582‑5p低表达预示着更低的无骨转移生存率；此外，体内体外实验均证实pri‑miR‑583过表达能上调miR‑582‑3p和miR‑582‑5p，并通过TGF‑β信号通路抑制前列腺癌骨转移，及前列腺癌骨转移细胞系的迁移和侵袭。因此，基于上述发现，能将miR‑582应用于制备前列腺癌骨转移诊断、预后试剂盒，并且有望开发出抑制前列腺癌骨转移的药物。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，更具体地涉及miR-582在制备前列腺癌骨转移的诊断、预后 试剂盒及药物中的应用。

背景技术

在世界范围内，前列腺癌(Prostate Cancer、PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一，也是癌 症死亡的第二大因素，仅次于肺癌。前列腺癌的主要死因是肿瘤发生远处转移，特别是骨转 移，尽管原发性前列腺癌可以通过手术、激素治疗、放疗等手段得到有效控制，但是骨转移 前列腺癌却仍然无法治愈，患者的生存率极低。因此，骨转移的早期诊断对于前列腺癌的预 后及诊疗来说非常关键，同时，针对前列腺癌骨转移的治疗药物的开发对于提高患者生存率 也大有帮助。

近年来，前列腺癌骨转移相关的特异性miRNA的发现为其诊断和治疗打开了新局面， miRNA可以通过与mRNA的3’未翻译区域(3’-UTR)结合，抑制mRNA的翻译或促进mRNA 的降解，从而调节基因的表达。越来越多证据表明，miRNA在肿瘤转移中发挥着重要的作用，对于特定癌种而言，某些miRNA能够抑制肿瘤转移，某些miRNA能够促进肿瘤转移，在恶 性肿瘤中的miRNA的表达谱各异，因此，挖掘和探究新的miRNA在前列腺癌骨转移中的分 子机制，对前列腺癌骨转移的预防和靶向性治疗将提供新的思路。

发明内容

本发明的目的在于提供miR-582在制备前列腺癌骨转移的诊断、预后试剂盒及药物中的 应用。

本发明所采取的技术方案是：

检测miR-582和/或其编码基因的试剂在制备前列腺癌转移诊断试剂盒中的应用。

作为优选的，所述试剂选自引物、探针、芯片中的一种或多种。

作为优选的，所述miR-582选自pri-miR-582、pre-miR-582、miR-582-3p、miR-582-5p及 其片段或变体中的一种或几种。

作为优选的，所述转移包括骨转移、脑转移和淋巴结转移。

检测miR-582和/或其编码基因的试剂在制备前列腺癌预后试剂盒中的应用。

作为优选的，所述miR-582选自pri-miR-582、pre-miR-582、miR-582-3p、miR-582-5p及 其片段或变体中的一种或几种。

作为优选的，所述预后的指标为无转移生存时间/生存率，其中，转移包括骨转移、脑转 移和淋巴结转移。

以下物质中的一种或多种在制备抑制前列腺癌骨转移药物中的应用：1)能上调miR-582 表达量的物质；2)能增强miR-582活性的物质；3)能增长miR-582有效作用时间的物质；4) 能增强miR-582稳定性的物质。

作为优选的，所述能上调miR-582表达量的物质选自：1)miR-582分子；2)miR-582修饰物；3)miR-582模拟物；4)编码miR-582的DNA；5)表达miR-582载体或病毒。

作为优选的，所述miR-582选自pri-miR-582、pre-miR-582、miR-582-3p、miR-582-5p及 其片段或变体中的一种或几种。

本发明的有益效果是：

发明人意外地发现miR-582-3p和miR-582-5p在骨转移的前列腺癌组织中低表达，并且 miR-582-3p或miR-582-5p低表达预示着更低的无骨转移生存率；此外，体内体外实验均证实 pri-miR-583过表达能上调miR-582-3p和miR-582-5p，并通过TGF-β信号通路抑制前列腺癌 骨转移，及前列腺癌骨转移细胞系的迁移和侵袭。因此，基于上述发现，能将miR-582应用 于制备前列腺癌骨转移诊断、预后试剂盒，并且有望开发出抑制前列腺癌骨转移的药物。

附图说明

图1：miR-582-3p和miR-582-5p的表达情况；其中，图A和图B分别为TCGA数据库 中正常组织和前列腺癌组织中miR-582-3p和miR-582-5p的表达情况；图C和图D分别为前 列腺癌骨转移组织和无骨转移组织中miR-582-3p和miR-582-5p的表达情况；图E和图F分 别为miR-582-3p和miR-582-5p的表达量与骨转移状态的病例统计图，图中，组别标记带L 为低表达组，带H为高表达组，nBM表示无骨转移，BM表示骨转移，ANT表示正常组织， Tumor表示肿瘤组织；

图2：前列腺癌细胞系中miR-582-3p和miR-582-5p的相对表达量；

图3：miR-582-3p和miR-582-5p的表达量与前列腺癌的生存分析，其中，图A和图B为前列腺癌无骨转移生存率曲线，图C和图D为前列腺癌总生存率曲线；图中，组别标记带 L为低表达组，带H为高表达组；

图4：转染pri-miR-582过表达载体的三组前列腺癌细胞系中miR-582-3p和miR-582-5p 的表达量，组别标记中，vector表示转染了对照质粒，pri-miR-582表示转染了pri-miR-582过 表达载体；

图5：pri-miR-582过表达在体内抑制前列腺癌骨转移结果；其中，图A为BLI成像示意 图，图B为骨X射线图，图C为骨HE染色图，图D为骨转移评分结果；图E为BLI信号 结果图；图F为总生存曲线，图G为无骨转移生存曲线，组别标记中，vector表示接种了转 染有对照质粒的PC-3细胞，pri-miR-582表示接种了转染有pri-miR-582过表达载体的PC-3 细胞；

图6：miR-582-3p模拟物和miR-582-5p模拟物对三组前列腺癌细胞系的迁移和侵袭的 影响，其中，图A为miR-582-3p模拟物和miR-582-5p模拟物在三组前列腺癌细胞系中对 miR-582-3p或miR-582-5p的表达量；图B和图C分别为miR-582-3p模拟物和 miR-582-5p模拟物对三组前列腺癌细胞系的迁移和侵袭的能力的抑制，组别标记中，vector 表示转染了对照质粒，miR-582-3p表示转染了miR-582-3p模拟物，miR-582-5p表示转染 了miR-582-5p模拟物；

图7：miR-582-3p、miR-582-5p、miR-582对TGF-β转录活性的影响，组别标记中，vector 表示转染了荧光素酶标记的对照质粒，miR-582表示转染了荧光素酶标记的miR-582表达载 体，miR-582-3p表示转染了荧光素酶标记的miR-582-3p表达载体，miR-582-5p表示转染了 荧光素酶标记的miR-582-5p表达载体，TGF-β表示转染了TGF-β/Smad荧光素酶报告质粒；

图8：miR-582-3p和miR-582-5p生物信息学靶向预测结果；

图9：荧光素酶验证miR-582-3p、miR-582-5p、miR-582靶向结果；

图10：TGF-β信号通路解除pri-miR-582抑制的前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力，其中， +表示添加有该物质，-表示未添加该物质。

具体实施方式

下面结合实验，进一步阐述本发明，但并不局限于此。下述实验例中所使用的实验方法 或实验条件，如无特殊说明，均按常规方法或厂家说明书进行，下述实验例中所用的材料、 试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

样本来源

实验例所用的细胞系包括人前列腺癌细胞系(22Rv1、PC-3、VCaP、DU145、LNCaP)和正常前列腺上皮细胞RWPE-1，均从中科院上海细胞库获得；人前列腺癌细胞C4-2B购自MD安德森癌症中心；其中，RWPE-1细胞用Defined Keratinocyte-SFM(1X)(Invitrogen公司)培养，PC-3、LNCaP、22Rv1细胞用含有青霉素G(100U/ml)、链霉素(100mg/ml)和 10％胎牛血清(Life Technologies公司)的RPMI-1640培养基(Life Technologies公司)培养，DU145、VCaP细胞用含有10％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司)培养；C4-2B 细胞用含有10％胎牛血清的T培养基(Invitrogen公司)培养，以上细胞均在5％CO₂，37℃>

实验例所用的组织样本由广州市第一人民医院提供，包括157例手术或穿刺活检获得的 前列腺癌组织样本(其中，94例非骨转移前列腺癌组织，63例骨转移前列腺癌组织)，以上 组织样本均有对应的临床病理信息。

实验方法

1、RNA提取、逆转录和实时定量PCR

采用RNA提取试剂盒(Qiagen公司)提取待测组织或待测细胞的总RNA，mRNA和miRNA均按照Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher公司)说明书进行逆 转录，使用iQ SYBR Green(BIO-RAD公司)在CFX96系统上(BIO-RAD公司)对cDNA进行扩增和定量；以U6为内参，选用2-ddCt相对定量法进行荧光定量检测，计算miR-582-3p和miR-582-5p的相对表达量；其中，检测U6、miR-582-3p和miR-582-5p的引物由广州市锐博生物科技有限公司合成与纯化。

2、Western blotting

使用细胞分离试剂盒(Cell Signaling Technology公司)对待测细胞进行核质分离，用RIPA 缓冲液(Cell Signaling Technology公司)提取全细胞裂解物，Westernblotting按常规条件操 作，其中，SMAD2抗体(Cat#3195),、pSMAD3抗体(Cat#4664),、SMAD4抗体(Cat#5741)、 TGFBRI抗体(Cat#4706)、TGFBRII抗体(Cat#3950)购自Cell SignalingTechnology公司， PDLIM7抗体(Cat#:SAB1406807)购自Sigma-Aldrich公司，α-tubulin作为内参，其抗体购自 Sigma-Aldrich公司。

3、质粒及转染

从基因组DNA中扩增人pri-miR-582基因，将其克隆到pMSCV-puro逆转录病毒载体中 (Clontech公司)，(CAGAC)12/pGL3TGF-β/Smad荧光素酶报告质粒和对照质粒购自Clontech 公司，用于评价TGF信号通路组分的转录活性，从基因组DNA中扩增SMAD2、SMAD4、TGFBRI、TGFBRII的3’-UTR区域，并克隆到pmirGLO质粒(Promega公司)中，由广州市 锐博生物科技有限公司合成与纯化miR-582-3p模拟物、miR-582-5p模拟物、TGFBRI过表达 质粒、SMAD2过表达质粒及对照载体，转染采用Lipofectamine 3000(Life Technologies公司)。4、荧光素酶检测

将4×10⁴个细胞接种到24孔板培养24小时，按常规方法进行荧光素酶检测，待测细胞>

5、侵袭和迁移实验

采用transwell小室法进行侵袭和迁移实验，简而言之，transwell小室涂布或不涂布基质 胶(BD Biosciences)，将细胞用胰蛋白酶消化，并悬浮在无血清培养基中，上室添加1.5×10⁵个细胞，下室为含有10％胎牛血清的培养基，孵育24～48h后，用4％多聚甲醛固定，并用>

6、动物实验

5-6周龄，18～20g的BALB/c-nu裸鼠用于实验，实验前进行麻醉，左心室接种1×10⁵个(100μL>

实验例1、miR-582-3p和miR-582-5p在骨转移前列腺癌组织中低表达

前期通过TCGA数据库分析前列腺癌患者中miRNA序列情况，结果如图1所示，相比于正常组织，前列腺癌组织中miR-582-3p和miR-582-5p高表达(均P＜0.05，参考图1A和 图1B)。

进一步研究却意外地发现，在149例前列腺癌组织中，相对于94例无骨转移前列腺癌组 织，63例骨转移前列腺癌组织中miR-582-3p和miR-582-5p显著表达下调(如图1C和图1D 所示)，约为无骨转移前列腺癌组织的0.5～0.6倍。

按前列腺癌组织中miR-582-3p和miR-582-5p表达量的中位值对miR-582-3p和miR-582-5p分层为高表达量(H)和低表达量(L)，统计无骨转移和骨转移的前列腺癌组织中miR-582-3p和miR-582-5p的高表达及低表达例数，如图1E和图1F所示，骨转移前列腺 癌组织中，miR-582-3p和miR-582-5p低表达率均显著高于无骨转移前列腺癌组织，以上结果证明，miR-582-3p和miR-582-5p在骨转移前列腺癌组织中低表达。

实验例2、miR-582-3p和miR-582-5p在骨转移的前列腺癌细胞系中低表达

以前列腺癌细胞系为研究对象，培养正常的人前列腺上皮细胞RWPE-1和人前列腺癌细 胞系DU145、LNCaP、22Rv1、PC-3、VCaP、C4-2B，分别检测miR-582-3p和miR-582-5p 的表达量，结果如图2所示，与正常的人前列腺上皮细胞系RWPE-1相比，骨转移前列腺癌 细胞系PC-3、C4-2B、VCaP中miR-582-3p和miR-582-5p均低表达，细胞实验证明了miR-582-3p 和miR-582-5p在骨转移前列腺癌细胞系中低表达。

实验例3、miR-582-3p和miR-582-5p的低表达预示着低的前列腺癌患者无骨转移生存率

结合前列腺癌组织的临床病理数据，按前列腺癌组织中miR-582-3p和miR-582-5p表达 量的中位值对miR-582-3p和miR-582-5p分层为高表达量(H)和低表达量(L)，对各分层内 病例进行Kaplan-Meier生存分析，结果如图3所示，miR-582-3p和miR-582-5p的表达量与前 列腺癌患者的总生存率无关，然而，miR-582-3p和miR-582-5p的低表达却均预示着更低的无 骨转移生存率。

实验例4、pri-miR-582的过表达抑制体内前列腺癌细胞的骨转移

将含有miR-582-3p和miR-582-5p序列的pri-miR-582构建载体转染到三组骨转移前列腺 癌细胞系中(PC-3、C4-2B、VCaP)，如图4可见，与对照载体相比，三组骨转移前列腺癌细 胞系中，miR-582-3p和miR-582-5p表达量显著上调。

进一步地，将荧光素酶标记的对照载体或pri-miR-582过表达的PC-3细胞接种于裸鼠的 左心室，骨转移状况如图5所示，其中，BLI监测骨转移进展，X射线监测溶骨性病变，与 对照载体组相比，pri-miR-582过表达能抑制前列腺癌细胞骨转移能力(参考图5A和5B)， 取胫骨肿瘤切片染色，可见pri-miR-582过表达能降低骨中的肿瘤负荷(参考图5C)，并且与 对照载体组相比，转染了pri-miR-582过表达PC-3细胞的裸鼠具有更低的骨转移评分，更少 的溶骨性破坏，更高的总生存率和无骨转移生存率(参考图5D～5G)。

实验例5、miR-582-3p或miR-582-5p的上调表达抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力

将miR-582-3p模拟物和miR-582-5p模拟物单独转染至三组骨转移前列腺癌细胞系中 (PC-3、C4-2B、VCaP)，用于评价miR-582-3p或miR-582-5p对前列腺癌细胞迁移和侵袭能 力的影响，结果如图6所示，上调miR-582-3p或miR-582-5p能减弱前列腺癌细胞的侵袭和 迁移能力，以上结果足以证明miR-582-3p或miR-582-5p具有抑制前列腺癌细胞的侵袭性和 迁移性。

实验例6、miR-582-3p和/或miR-582-5p参与前列腺癌骨转移的机制

为了探究miR-582-3p和/或miR-582-5p参与前列腺癌骨转移的分子机制，我们发现，上 调miR-582-3p和/或miR-582-5p能抑制TGF-β/Smad荧光素酶报告质粒的转录活性(参考图7)， 因此我们预测miR-582-3p和/或miR-582-5p参与TGF-β信号通路。

结合生物信息学预测靶向位点，如图8所示，预测miR-582-3p靶向SMAD2、SMAD4、TGFBRI的3’-UTR；而miR-582-5p靶向SMAD2、SMAD4、TGFBRI、TGFBRII的3’-UTR。

进一步通过荧光素酶验证，结果如图9显示：上调miR-582-3p抑制SMAD2、SMAD4、TGFBRI的3’-UTR；而上调miR-582-5p抑制SMAD2、TGFBRI、TGFBRII的3’-UTR；同时 上调miR-582-3p和miR-582-5p则抑制SMAD2、SMAD4、TGFBRI、TGFBRII的3’-UTR。

此外，由于miR-582-3p和miR-582-5p过表达会导致迁移和侵袭能力受到抑制，我们进 一步研究，TGF-β信号通路或其组分(SMAD2或TGFBRI)能否解除上述被抑制的迁移和侵袭能力。结果如图10所示，在没有TGF-β的情况下，SMAD2或TGFBRI均不能解除对前 列腺癌细胞的迁移和侵袭能力的抑制，有TGF-β的情况下，前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力 显著提高，被miR-582-3p和miR-582-5p过表达而抑制的迁移和侵袭能力得到恢复。以上结 果证明了miR-582-3p和miR-582-5p确实通过TGF-β信号通路，抑制前列腺癌细胞的侵袭和 迁移。

总结以上实验例，可以得出：(1)miR-582可应用于制备前列腺癌转移诊断试剂盒；由 于miR-582-3p和miR-582-5p在骨转移前列腺癌组织中低表达，并且表达量为无骨转移前列 腺癌组织的0.5～0.6倍，因此，可以由此作为诊断标准，判断是否发生前列腺癌转移。2、 miR-582可应用于制备前列腺癌预后试剂盒；由于前列腺癌无骨转移生存率与miR-582-3p和 miR-582-5p相关，因此利用无骨转移生存率作为预后指标，可用于预后判断。3、经过体内和 体外实验均证实pri-miR-582上调表达，能够抑制前列腺癌骨转移，并且抑制前列腺癌骨转移 细胞系迁移和侵袭能力，根据公知常识和以上结论可以预想：以下任意一种物质都有望用于 制备抑制前列腺癌骨转移的药物：1)能上调miR-582表达量的物质；2)能增强miR-582活 性的物质；3)能增长miR-582有效作用时间的物质；4)能增强miR-582稳定性的物质；其 中，能上调miR-582表达量的物质选自：1)miR-582分子；2)miR-582修饰物；3)miR-582 模拟物；4)编码miR-582的DNA；5)表达miR-582载体或病毒。

以上所述仅是用于解释本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离 本发明原理的前提下做出的若干改进和润饰，也应视为本发明的保护范围。