桑树钾离子通道相关基因MaKCO5及其应用

摘要

本发明公开了桑树钾离子通道相关基因MaKCO5及其应用，所述基因的序列为SEQ ID NO.1，所述基因编码的蛋白序列为SEQ ID NO.2。本发明所述桑树钾离子通道相关基因MaKCO5的克隆完善了桑树基因组数据库；本发明所述桑树钾离子通道相关基因MaKCO5及其编码的蛋白可作为桑树处于的钾浓度和/或非生物胁迫条件的标志物。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种标志物及其应用，具体为桑树钾离子通道相关基因MaKCO5及其应用。

背景技术

钾是植物生长发育所必需的大量元素之一,而且也是唯一一种植物所需的以较高浓度存在的阳离子,占植物总干重的10％左右。钾作为一种大量元素,参与植物体很多重要的生理功能,如植物的氮代谢、脂肪的代谢及蛋白的合成、渗透调节、中和阴离子的负电荷、控制细胞膜的极化等等。钾在植物中几乎都呈离子状态，部分在细胞质中处于吸附状态。为了适应土壤中不断变化的钾离子含量及应付其它形式的胁迫，植物必须在整体水平和细胞水平上严格控制钾离子的转运。

离子通道中，K⁺通道是最庞大的家族，根据不同的标准可分为不同的类别。从生物学角度，依据结构和功能的不同K⁺通道可分为三大类:Shaker家族通道、KCO通道和其他通道。KCO通道即钾通道(K⁺channel)、钙激活的(Ca²⁺activated)和外向整流(outward-rectifying)的缩写，是1997年通过基因数据库搜索动物K⁺通道新的植物对应物时所鉴定。植物KCO通道可分为具有4个TMS、2个孔道区域的KCO-2P亚族和2个TMS、1个孔道区域的KCO-1P亚族两类。KCO通道不具有电压感受器功能的TMS,在孔道区有K⁺高通透性的特征基序。推测多数KCO在胞质侧的C末端有Ca²⁺结合位点-EF手型结构域(EF>+,TPK),EF手型结构域的存在是植物KCO通道的一个独特特点。

目前，KCO通道已有广泛研究，在拟南芥中,KCO-2P家族具有5个成员(KCO1、KCO2、KCO4、KCO5和KCO6),而KCO-1P家族只有一个成员(KCO3)，其中只有KCO1得到了鉴定。KCO1是Czempinski等从植物细胞中筛选出的具有外向性K⁺转运作用的第一个K⁺通道蛋白,也是从拟南芥中鉴定出来的第一个两孔钾通道。它是以Shaker通道的P结构域的保守序列为探针,从拟南芥的EST数据库中筛选出的。KCO1是一种新型K⁺通道,它具有2个P结构域、4个跨膜结构域(片段)。异源表达表明,KCO1能够向外转运K⁺并且依赖于胞质中的Ca²⁺,随后证实KCO1中能够结合Ca²⁺的EF模体存在C末端。KCO1在整个植株中都有表达,不仅能在叶片和花中表达,也能在幼苗中表达,但表达较低。Fox和Guerinot在亚细胞水平上,把它被定位在液泡膜上,调查表明KCO1失活只对叶肉外向整流缓慢液泡离子流有贡献,而对快速液泡离子流没有影响。在拟南芥KCO/TPK家族中,At>+及膜电位平衡的调节,最近克隆出的该类通道基因有:雨树的SPOCK1,马铃薯的St>

不同钾条件下，MaKCO5基因的转录水平均有变化。同种钾源不同浓度，同种浓度不同钾源，对植物生长与发育都有一定影响。非生物胁迫干旱、低温和高盐的条件下，MaKCO5基因的相对表达量也均有不同程度的变化。

我国是桑树的起源中心，种质资源极为丰富。经过桑树种质资源及育种工作者几十年的努力，现在全国已收集保存有近3000份桑树种质资源，其中不少资源都具有果用价值、药用价值、经济价值等。植物营养性状一般是多基因控制的数量性状，其遗传机制采用传统的方式很难研究，而应用分子标记技术并利用有关分子图谱则可以对这些复杂的数量性状进行比较方便的研究。由于起步较晚，分子标记技术在植物营养性状中的应用还不太普遍，主要集中在植物耐低养分胁迫和耐矿质元素毒害等几方面。探讨植物对钾的吸收利用，前人主要从植物对钾的吸收及利用差异，植物对钾吸收效率的遗传特性和植物对钾高效基因型筛选三方面进行探讨，充分利用标记钾相关基因及非生物胁迫下的标记物进行研究。为充分利用植物对环境的遗传多样性开展钾高效植物基因型筛选，解决我国钾素缺乏问题提供参考。

发明内容

解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，本发明采用已克隆得到的鲁桑品种(Morus multicaulis)育71-1MaKCO5基因序列，通过生物信息学分析其序列特征，同时，利用荧光定量PCR的方法检测了MaKCO5在干旱、高盐和低温胁迫条件下和不同钾处理下的转录水平的变化规律。通过对该基因的研究，使我们从分子水平了解到桑树MaKCO5基因在不同钾及胁迫条件下的表达情况，从而获得一种能够标记桑树处于的钾浓度和/或非生物胁迫条件的标志物。

技术方案：桑树钾离子通道相关基因MaKCO5，所述基因的序列为SEQ ID NO.1。

桑树钾离子通道相关基因MaKCO5编码的蛋白，所述蛋白序列为SEQ ID NO.2。

所述桑树钾离子通道相关基因MaKCO5在标记桑树处于的钾浓度和/或非生物胁迫条件中的应用。

所述桑树钾离子通道相关基因MaKCO5编码的蛋白在标记桑树处于的钾浓度和/或非生物胁迫条件中的应用。

优选的，所述钾浓度为300μM～30mM。

优选的，所述非生物胁迫为干旱、高盐和/或低温。

有益效果：(1)本发明所述桑树钾离子通道相关基因MaKCO5的克隆完善了桑树基因组数据库；(2)本发明所述桑树钾离子通道相关基因MaKCO5及其编码的蛋白可作为桑树处于的钾浓度和/或非生物胁迫条件的标志物。

附图说明

图1是桑树钾离子通道相关基因的扩增结果图；其中，M为2000bp DNA分子量标记1为RT-PCR产物；

图2是桑树钾离子通道相关基因推导的氨基酸序列保守区预测软件截图；

图3是定量RT-PCR检测MaKCO5基因在干旱胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；

图4是定量RT-PCR检测MaKCO5基因在高盐胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；

图5是定量RT-PCR检测MaKCO5基因在低温胁迫下桑苗嫩叶中的相对表达量图；

图6是定量RT-PCR检测MaKCO5基因在不同钾处理下桑苗嫩叶中的相对表达量图；

图7是定量RT-PCR检测MaKCO5基因在低钾处理下桑苗嫩叶中的相对表达量图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

1.桑树钾离子通道相关基因MaKCO5的克隆

供试桑树品种为鲁桑品种(Morus multicaulis)育71-1苗，保存于中国农业科学院蚕业研究所国家种质镇江桑树圃。利用已获得的包含桑树钾离子通道相关基因MaKCO5基因cDNA片段的ESTs序列，设计引物，并加以验证，引物序列如下：

SEQ ID NO.3，MaKCO5-F:5'-ATGGAAGATGAGCCTTTTCTC-3'；

SEQ ID NO.4，MaKCO5-R:5'-TCAAAGAATAGAATTTCCAACTTTTTG-3'；

根据已获得的基因序列设计进行荧光定量分析的引物，引物序列如下：

SEQ ID NO.5，qMaKCO5-F:5'-ATTGGTGTGGGAGCATTGT-3'；

SEQ ID NO.6，qMaKCO5-R:5'-AACCGTCGTAACCGACATAAC-3'；

根据NCBI上查找的在桑树中稳定表达的β-actin基因(GeneBank登录号：DQ785808)序列设计内参基因的上下游引物，

SEQ ID NO.7，上游引物序列β-actin-F为5'-AGCAACTGGGATGACATGGAGA-3'；

SEQ ID NO.8，下游引物序列β-actin-R为5'-CGACCACTGGCGTAAAGGGA-3'。

2.桑树钾离子通道相关基因MaKCO5基因cDNA片段的克隆

取鲁桑育71-1嫁接苗顶端幼叶，用RNA试剂盒提取桑树总RNA。先准备RNAiso抽提液于离心管中，把桑树嫩叶进行液氮研磨成粉末状，将粉末放入抽提液的离心管，冰盒上放30min，然后4℃，12000rpm，离心5min，抽取上清700-800μL，到新离心管，然后加入200μL氯仿，震荡1min，混匀冰冰盒上放置6-10min，然后4℃，12000rpm，20min离心，吸取上清300μL至另一个离心管内。加入等体积预冷的异丙醇，混匀后冰上静置10-15min，13000rpm、4℃去离心20min，除上清，缓缓加入1mL预冷的75％乙醇，4℃，13000rpm离心5min，弃上清。然后室温干燥沉淀2-5min。最后加入适量ddH₂O，轻弹管壁，以充分溶解RNA。

RNA自身不能作为PCR反应的模板，须现将其反转录为cDNA。以提取总RNA9μL为模板，oligo(dT)₁₈4μL为引物进行反转录，70℃保温10min后，然后迅速放入冰上2min以上，离心数秒，在上述13μL的模板RNA/oligo(dT)18变性溶液中加入5×M/MLV缓冲液4μL、10mMdNTP混合物1μL、40U/μL>

以合成的cDNA第1链为模板，分别利用上述设计的MaKCO5–F和MaKCO5–R为引物进行RT-PCR扩增。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃30s，52℃35s，72℃50s，循环35次；72℃延伸10min；4℃保存。各取5μL的RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测目的片段的大小，检测目的片段大小与预测大小是否相符(图1)。条件相符后，用TAE缓冲液制作的1％琼脂糖凝胶，各取40μL RT-PCR产物进行电泳，采用CWBIO公司Gel Extraction Kit快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行目的片段的胶回收和纯化。胶回收产物通过DNA连接酶与pMD^TM18-T载体连接。连接产物转化到宿主菌E.coli>

3.桑树钾离子通道相关基因MaKCO5的生物信息学分析

利用在线工具PSORT，根据已报道的文献对目的基因进行核定位序列的预测及相关保守基因序列的分析(图2)；运用NCBI的Blast工具对其进行同源搜索和比对，并下载部分同源氨基酸序列；利用Clustal X软件将基因编码的氨基酸序列与桑树钾离子通道相关基因MaKCO5相关蛋白的氨基酸序列进行同源比对；利用DNAStar软件和在线分析(http://www.expasy.org)对桑树钾离子通道相关基因MaKCO5进行较全面的分析，比如：该基因所编码的氨基酸及ORF预测，基因编码蛋白质的等电点及分子质量的预测等；然后，用MEGA4.1软件构建进化树，并研究相关蛋白的关系。

4.桑树钾离子通道相关基因MaKCO5在不同钾及胁迫条件下目的基因的表达模式

在供试桑苗的新梢生长至约20cm长时，对桑苗分别进行不同钾和胁迫条件处理。不同钾条件为300μM KCl、3mM KCl、30mM KCl、300μM>3、3mM>3和30mM>3。低钾处理的植株用蛭石和沙土进行培养。胁迫处理为干旱、高盐和低温。在整个处理过程中，所有试验用苗的温度，光照强度，光周期以及湿度等非生物条件均保持不变。每天定时处理和观察桑树苗的生长趋势，分别取对照和各种条件处理下的桑树幼叶，用铝箔纸包裹后迅速投入液氮中，放于-80℃的冰箱中保存。在整个处理过程中，所有扦插苗的光照强度，光周期及湿度均保持不变。采用荧光定量PCR的方法，以桑树稳定表达的肌动蛋白基因(β-actin)作为内参，测定桑树在胁迫条件下目的基因的表达水平。所有胁迫实验均重复3次。

干旱胁迫：供试桑苗放置于同一个光照培养箱的一个干燥的空间，一直不浇水，分别于1d、3d、5d、10d和15d取桑树幼叶(第1-3叶位)为实验材料。

高盐胁迫：供试桑苗用浓度为0.3mol/L的NaCl溶液进行盐胁迫诱导处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度25℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于1d、2d、4d、7d和10d时取盐胁迫条件下的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

低温胁迫：供试桑苗放置于4℃培养箱诱导处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度4℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于12h、1d、3d、5d和10d以及之后复性2d和5d时取低温胁迫条件下的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

不同非生物胁迫下MaKCO5相对表达量变化显示：干旱胁迫条件下，MaKCO5基因表达量总体的趋势是先缓慢的波动变化上升后下降最后骤升，在实验处理第十五天时达到一定阶段的的相对最大值(图3)。盐胁迫条件下，MaKCO5基因表达量总体的趋势是先上升，后下降然后上升，总体处于较高水平(图4)。低温胁迫条件下，MaKCO5基因表达量总体的趋势是先上升后略下降，然后复性处理后先上升再下降(图5)。MaKCO5基因在各种胁迫条件下都有明显的波动状态，这表明MaKCO5可能在桑树生长和代谢中发挥其功能，在非生物胁迫条件下，诱发MaKCO5基因的表达，使植物应对外界非生物胁迫进行表达。通过荧光定量PCR分析，利用MaKCO5基因在干旱胁迫、盐胁迫和低温胁迫条件下总体表达的升降情况、在不同的胁迫时间内相对基因表达量指标，以及MaKCO5基因在植物中的保守性，可以以此标识植物是否处于盐胁迫、低温或干旱生长环境。

不同浓度KNO₃处理：供试桑苗用浓度为300μM、3mM、30mM的KNO₃溶液分别进行处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度25℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于1d、3d、6d、10d和12d时取不同钾条件处理的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

不同浓度KCl处理：供试桑苗用浓度为300μM、3mM、30mM的KCl溶液分别进行处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度25℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于1d、3d、6d、10d和12d时取不同钾条件处理的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

低钾处理：供试桑苗移栽于蛭石和沙土中用MS低钾培养基溶液进行处理。对照桑苗一直放置于同一个光照培养箱，温度25℃不变，每天12小时光照，12小时黑暗。分别于1d、3d、7d、9d、10d和12d时取低钾条件处理的桑树幼叶(第1-3叶位)作为实验材料。

不同钾条件处理下MaKCO5相对表达量变化显示：不同浓度KNO₃处理条件下，MaKCO5基因表达量总体的趋势是波动下降，上升到最高值，然后下降。300μM>3处理条件下，MaKCO5基因表达量先下降后略升高，后期波动降低。3mM>3处理条件下，MaKCO5基因的表达量前期波动不大，后期波动下降。30mM>3处理条件下，MaKCO5基因的表达量先下降，再升高，最后下降。不同浓度KCl处理条件下：300μM>3处理、不同浓度KCl处理和低钾处理下总体表达的升降情况、在不同的处理期内相对基因表达量指标，以及MaKCO5基因在植物中的保守性，可以以此标识植物是否处于不同钾条件下。

序列表

<110> 江苏科技大学

<120> 桑树钾离子通道相关基因MaKCO5及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1282

<212> DNA

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 1

gtgccatcgt cagtgattcg agctcggtac ccggggatcc gattatggaa gatgagcctt 60

ttctcgcctc ccaaacagca ccccaacaac tccctccaat catcgaacac cacgatttct 120

cattcccact cctccaagac cccgaatccg ccgccgccga tgcacctgcc cctaatcgga 180

gtctccaccg atgcaagacc gccccggccc tctccgtcgt ccgagacctc aaccccaagc 240

catcgtcgtc gtcccaaccg gactcggcgt ctcttgtgaa acaagccttc gtccttctcc 300

tcatctacct ctccttgggt gtcctcatct ataccttcaa caccgaccac ttctccggcg 360

tcgagaccca ccccctcgtc gacgccctct acttctgcat cgtcaccatg tgcaccatcg 420

gctacggaga catcgctccc cgaacgccat cgacgaagct cttcgcctgc ctcttcgtcc 480

tcgtcggctt cggcttcatc gacattctcc tcagcggagt cgtcaattac gtcctcgact 540

tgcaggagaa catgatcttg aacggaatgc atatggatca acatcatcat aatcatcatc 600

aaggattttc agcttgggat ttcatcatcg acgtggccaa aggcaggatg aggatcagac 660

tgaaagtcgg attggcgctg ggagtggtgg tgctgtgcat tggtgtggga gcattgttcc 720

tgcgattcgc cgaggatttg gattggattg attcggttta tttgtcagtt atgtcggtta 780

cgacggttgg ctacggggac agggccttca agacgctcaa tgggaggatt ttcgcggtag 840

tttggcttct gctgtcgacg ctggcggtgg ctcgggcgtt cttgtatctg gcggaggcga 900

gagtcgacaa gaggcaccga agaattgcca aatgggtgct gcatagggat atcaccgtcg 960

aggatttgat cgccgccgac attaataata acggtttcat tagtaagtcg gagtacgtaa 1020

tctacaagct taaagagatg ggaaggatag gcgagaaaga tatattggag atctgcaacc 1080

agttcagtaa gcttgacccc aacaactccg ggaagataac attgcctgat ctgttgcaga 1140

atcgcttgca atgtcaaaaa gttggaaatt ctattctttg aaatccatat gactagtaga 1200

tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag ctttccccta tagtgtcacc taaatagctg 1260

gcgtaatcat gtcaagggtc cc 1282

<210> 2

<211> 378

<212> PRT

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 2

Met Glu Asp Glu Pro Phe Leu Ala Ser Gln Thr Ala Pro Gln Gln Leu

1 5 1015

Pro Pro Ile Ile Glu His His Asp Phe Ser Phe Pro Leu Leu Gln Asp

202530

Pro Glu Ser Ala Ala Ala Asp Ala Pro Ala Pro Asn Arg Ser Leu His

354045

Arg Cys Lys Thr Ala Pro Ala Leu Ser Val Val Arg Asp Leu Asn Pro

505560

Lys Pro Ser Ser Ser Ser Gln Pro Asp Ser Ala Ser Leu Val Lys Gln

65707580

Ala Phe Val Leu Leu Leu Ile Tyr Leu Ser Leu Gly Val Leu Ile Tyr

859095

Thr Phe Asn Thr Asp His Phe Ser Gly Val Glu Thr His Pro Leu Val

100 105 110

Asp Ala Leu Tyr Phe Cys Ile Val Thr Met Cys Thr Ile Gly Tyr Gly

115 120 125

Asp Ile Ala Pro Arg Thr Pro Ser Thr Lys Leu Phe Ala Cys Leu Phe

130 135 140

Val Leu Val Gly Phe Gly Phe Ile Asp Ile Leu Leu Ser Gly Val Val

145 150 155 160

Asn Tyr Val Leu Asp Leu Gln Glu Asn Met Ile Leu Asn Gly Met His

165 170 175

Met Asp Gln His His His Asn His His Gln Gly Phe Ser Ala Trp Asp

180 185 190

Phe Ile Ile Asp Val Ala Lys Gly Arg Met Arg Ile Arg Leu Lys Val

195 200 205

Gly Leu Ala Leu Gly Val Val Val Leu Cys Ile Gly Val Gly Ala Leu

210 215 220

Phe Leu Arg Phe Ala Glu Asp Leu Asp Trp Ile Asp Ser Val Tyr Leu

225 230 235 240

Ser Val Met Ser Val Thr Thr Val Gly Tyr Gly Asp Arg Ala Phe Lys

245 250 255

Thr Leu Asn Gly Arg Ile Phe Ala Val Val Trp Leu Leu Leu Ser Thr

260 265 270

Leu Ala Val Ala Arg Ala Phe Leu Tyr Leu Ala Glu Ala Arg Val Asp

275 280 285

Lys Arg His Arg Arg Ile Ala Lys Trp Val Leu His Arg Asp Ile Thr

290 295 300

Val Glu Asp Leu Ile Ala Ala Asp Ile Asn Asn Asn Gly Phe Ile Ser

305 310 315 320

Lys Ser Glu Tyr Val Ile Tyr Lys Leu Lys Glu Met Gly Arg Ile Gly

325 330 335

Glu Lys Asp Ile Leu Glu Ile Cys Asn Gln Phe Ser Lys Leu Asp Pro

340 345 350

Asn Asn Ser Gly Lys Ile Thr Leu Pro Asp Leu Leu Gln Asn Arg Leu

355 360 365

Gln Cys Gln Lys Val Gly Asn Ser Ile Leu

370 375

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 3

atggaagatg agccttttct c 21

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 4

tcaaagaata gaatttccaa ctttttg 27

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 5

attggtgtgg gagcattgt 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 6

aaccgtcgta accgacataa c 21

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 7

agcaactggg atgacatgga ga 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 桑树(Morus multicaulis)

<400> 8

cgaccactgg cgtaaaggga 20