C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用

摘要

C‑末端芳香酯化修饰的内吗啡肽‑1类似物及其合成方法和应用，涉及一种内吗啡肽‑1类似物及其合成和应用。是要解决现有内吗啡肽‑1的镇痛时间短，酶解稳定性，外周给药的镇痛效果差，及具有镇痛耐受、心血管和呼吸系统副作用的问题。该类似物为C‑末端芳香酯化修饰的内吗啡肽‑1类似物。方法：一、苄氧羰基‑色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成；二、苄氧羰基‑酪氨酸‑脯氨酸的合成；三、苄氧羰基‑酪氨酸‑脯氨酸‑色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成；四、酪氨酸‑脯氨酸‑色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成。本发明用于制备多肽镇痛药物。

说明书

技术领域

本发明涉及一种内吗啡肽-1类似物及其合成方法和应用。

背景技术

阿片和阿片类药物作用于细胞膜上的阿片受体，广泛用于镇痛。目前认为神经系统中至少有三种亚型，即μ-，δ-和κ-阿片受体，而吗啡等阿片类药物的主要作用是通过位于中枢神经系统的μ-阿片受体实现的。因此对μ-阿片受体内源性配体的研究具有十分重要的意义。早在1997年，Zadina及其同事等从牛脑中发现了内源性的μ-阿片受体配体，即内吗啡肽-1(Tyr-Pro-Trp-Phe-NH₂,EM-1)和内吗啡肽-2(Tyr-Pro-Phe-Phe-NH₂,EM-2)。在所有已知的阿片物质中，内吗啡肽对μ-阿片受体具有极高的亲和性和选择性。内吗啡肽通过与G蛋白偶联的μ-阿片受体结合，参与对痛觉、心血管、呼吸、胃肠、运动、行为、内分泌及免疫等诸多功能的调节，但其主要作用是强效的镇痛活性，可产生活性强于吗啡而副作用较少的镇痛作用。特别是在神经性疼痛动物模型中也表现出明显的镇痛活性，比大多数阿片肽都更有效，使其具有潜在的开发前景。

当然，基于内吗啡肽的主链骨架和芳香环侧链的经典特性，它们也是研究结构活性关系的模型肽。内吗啡肽虽然只有四个氨基酸残基，但却蕴涵了丰富的信息，其结构的相对简单为阿片领域的研究，阿片肽的化学模拟以及新型高效镇痛药物的开发提供了更加便捷的模式。然而，内吗啡肽在发挥其镇痛作用的同时，具有镇痛时间短，持续时间一般仅为20min左右，酶解稳定性差，在血清和脑质膜的半衰期仅为几到十几分钟，比镇痛持续时间还短，而且存在不易透过血脑屏障等缺点，从而限制了其作为临床镇痛药物的应用。因此，探究基于内吗啡肽结构的高效、低毒副作用的多肽镇痛药物已成为当今生物医药领域的研究热点。

发明内容

本发明是要解决现有内吗啡肽-1的镇痛时间短，酶解稳定性，外周给药的镇痛效果差，及具有镇痛耐受、心血管和呼吸系统副作用的问题，提供C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物及其合成和应用。

本发明C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物的结构如下：

其中n＝1、2或3。

上述C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，包括以下步骤：

一、苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成

将苄氧羰基-色氨酸和4-二甲氨基吡啶加入重蒸的二氯甲烷反应液中，之后加入芳香醇，0～5℃冰浴5～10min，得到反应混合液；其中苄氧羰基-色氨酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(0.3～0.5)，苄氧羰基-色氨酸的摩尔量和芳香醇的体积比为1mol：(1～4)mL；其中所述芳香醇为苯甲醇、苯乙醇或苯丙醇；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于重蒸的二氯甲烷溶液中，并加入反应混合液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～15h；其中苄氧羰基-色氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：(1.1～1.3)；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯；

二、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，用1～4mol/L的氢氧化钠溶液将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～15h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸的摩尔比为1：(1.3～1.6)；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用稀盐酸和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；

三、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成

将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将与苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸等摩尔量的苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯溶于的绝对甲醇中，加入60～150mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h；其中苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的摩尔量与绝对甲醇的体积比为1mol：(6～15)mL，苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的摩尔量与钯碳的质量比为1mol：(60～150)mg；

过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯，将色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～15h，减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤，无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯；

四、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成

将0.5-0.8mmol苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯溶于6～15mL的绝对甲醇中，加入60～150mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物即为C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物——酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯。

上述C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。

本发明的有益效果：

本发明C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物，是通过将内吗啡肽-1母体的第4位苯丙氨酸去除，并对C-末端进行苯甲酯、苯乙酯和苯丙酯化修饰，构建高效的内吗啡肽-1类似物。内吗啡肽-1类似物的产率可达95％～98％。

本发明采用酯化修饰能够显著提高多肽的酶解稳定性和脂溶性等药理学特性。本发明中将内吗啡肽-1的4位苯丙氨酸去除，减小C-末端的空间位阻，目的为了提高内吗啡肽的μ-阿片受体亲和性。同时对C-末端进行不同的芳香酯化修饰，能够提高类似物的酶解稳定性和脂溶性。通过外周给予类似物，增强药物向中枢系统的运输能力，进而提高药物的利用率和镇痛效能，有利于神经肽镇痛药物的研发与应用，具有重要的医用价值。

通过放射性标记亲和实验，离体酶解稳定性，正辛醇/缓冲液分配系数测定，镇痛与耐受实验，以及整体血压和离体支气管实验，对本发明合成的类似物进行药理学活性鉴定。结果表明，本发明的内吗啡肽-1类似物的生物稳定性和脂溶性均显著提高，而且C-末端苯乙酯化修饰的类似物2具有比母体内吗啡肽-1更高的μ-阿片受体亲和性。此外，类似物1和2具有中枢和外周给药的高效镇痛活性，并且镇痛耐受副作用明显降低，尤其类似物2具有无耐受的镇痛特性，且类似物1和2对心血管和呼吸系统的副作用也明显降低。且镇痛持续时间较长，类似物1和2的镇痛％MPE在给药后60min测定，分别为13.07％和19.24％，表明类似物1和2通过外周给药持续时间可以达到60min以上。因此，本发明的内吗啡肽-1类似物在制备高效、低副作用的多肽镇痛药物方面具有很高的应用价值。

附图说明

图1为实施例1制备的类似物1的中枢镇痛效果曲线；

图2为实施例2制备的类似物2的中枢镇痛效果曲线；

图3为类似物1和2的外周镇痛效果曲线；

图4为侧脑室注射内吗啡肽-1的镇痛耐受剂量曲线；

图5为侧脑室注射类似物1的镇痛耐受剂量曲线；

图6为侧脑室注射类似物2的镇痛耐受剂量曲线；

图7为静脉注射内吗啡肽-1及类似物1和2对大鼠系统动脉压的作用；

图8为静脉注射内吗啡肽-1及类似物1和2对大鼠心率的作用；

图9为内吗啡肽-1及类似物1和2对4Hz频率的电刺激引起的大鼠支气管收缩的抑制作用。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物的结构如下：

其中n＝1、2或3。

具体实施方式二：本实施方式C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物的合成方法，包括以下步骤：

一、苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成

将苄氧羰基-色氨酸和4-二甲氨基吡啶加入重蒸的二氯甲烷反应液中，之后加入芳香醇，0～5℃冰浴5～10min，得到反应混合液；其中苄氧羰基-色氨酸和4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(0.3～0.5)，苄氧羰基-色氨酸的摩尔量和芳香醇的体积比为1mol：(1～4)mL；其中所述芳香醇为苯甲醇、苯乙醇或苯丙醇；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于重蒸的二氯甲烷溶液中，并加入反应混合液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～15h；其中苄氧羰基-色氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：(1.1～1.3)；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后洗涤，干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯；

二、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液A；其中苄氧羰基-酪氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液A中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将脯氨酸的pH值调到9～11，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～15h；其中苄氧羰基-酪氨酸和脯氨酸摩尔比为1：(1.3～1.6)；

减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后洗涤，干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸；

三、苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成

将苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入无水四氢呋喃中，0～5℃搅拌，得反应液B；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

将N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于四氢呋喃中，并加到反应液B中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应4～8h；其中苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和N,N’-二环己基碳二亚胺的摩尔比为1：(1.2～1.4)；

过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液，将与苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸等摩尔量的苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯溶于的绝对甲醇中，加入60～150mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h；其中苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的摩尔量与绝对甲醇的体积比为1mol：(6～15)mL，苄氧羰基-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的摩尔量与钯碳的质量比为1mol：(60～150)mg；

过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯，将色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0～5℃搅拌反应20～40min，之后室温反应10～15h，减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后洗涤，干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯；

四、酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯的合成

将0.5-0.8mmol苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯溶于6～15mL的绝对甲醇中，加入60～150mg钯碳，通入氢气，室温反应2～4h，过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物即为C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物——酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯/苯乙酯/苯丙酯。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中洗涤的具体方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤一中用无水硫酸钠干燥有机相。其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤二中用1～4mol/L的氢氧化钠溶液调节脯氨酸的pH值。其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤二中洗涤的具体方法为：依次用稀盐酸和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤二中用无水硫酸钠干燥有机相。其它与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：步骤三中洗涤的具体方法为：依次用5％柠檬酸溶液、饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤。其它与具体实施方式二至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤三中用无水硫酸钠干燥有机相。其它与具体实施方式二至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物在制备多肽镇痛药物中的应用。

下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1：类似物1—酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯的合成

(1)苄氧羰基-色氨酸苯甲酯的合成

将2mmol的苄氧羰基-色氨酸和0.8mmol的4-二甲氨基吡啶加入体积为10mL的重蒸的二氯甲烷反应液中，之后将2mL苯甲醇加入其中，0℃冰浴5min。将2.4mmol的N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于5mL重蒸的二氯甲烷溶液中，并加入反应混合液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸苯甲酯，产率为89％。

(2)苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将2mmol的苄氧羰基-酪氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将3mmol的脯氨酸的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸，产率为81％。

(3)苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯的合成

将1mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和1.3mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将1.3mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将1mmol的苄氧羰基-色氨酸苯甲酯溶于10mL的绝对甲醇中，加入100mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸苯甲酯，将其加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯，产率为78％。

(4)酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯的合成

将0.5mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯溶于8mL的绝对甲醇中，加入80mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯，产率为97％。

酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯甲酯的结构式如下：

实施例2：类似物2—酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯乙酯的合成

(1)苄氧羰基-色氨酸苯乙酯的合成

将2mmol的苄氧羰基-色氨酸和0.8mmol的4-二甲氨基吡啶加入体积为10mL的重蒸的二氯甲烷反应液中，之后将2mL苯乙醇加入其中，0℃冰浴5min。将2.4mmol的N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于5mL重蒸的二氯甲烷溶液中，并加入反应混合液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸苯乙酯，产率为86％。

(2)苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将2mmol的苄氧羰基-酪氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将3mmol的脯氨酸的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸，产率为85％。

(3)苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯乙酯的合成

将1mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和1.3mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将1.3mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将1mmol的苄氧羰基-色氨酸苯乙酯溶于10mL的绝对甲醇中，加入100mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸苯乙酯，将其加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯乙酯，产率为80％。

(4)酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯乙酯的合成

将0.5mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯乙酯溶于8mL的绝对甲醇中，加入80mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯乙酯，产率为98％。

酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯乙酯的结构式如下：

实施例3：类似物3—酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯丙酯的合成

(1)苄氧羰基-色氨酸苯丙酯的合成

将2mmol的苄氧羰基-色氨酸和0.8mmol的4-二甲氨基吡啶加入体积为10mL的重蒸的二氯甲烷反应液中，之后将2mL苯丙醇加入其中，0℃冰浴5min。将2.4mmol的N,N’-二环己基碳二亚胺溶解于5mL重蒸的二氯甲烷溶液中，并加入反应混合液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-色氨酸苯丙酯，产率为81％。

(2)苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸的合成

将2mmol的苄氧羰基-酪氨酸和2.6mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将2.6mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。用2mol/L的氢氧化钠溶液将3mmol的脯氨酸的pH值调到10，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后用稀盐酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸，产率为82％。

(3)苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯丙酯的合成

将1mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸和1.3mmol的N-羟基琥珀酰亚胺加入10mL的无水四氢呋喃中，0℃冰浴搅拌，将1.3mmol溶解于四氢呋喃的N,N’-二环己基碳二亚胺加到反应液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应6h。过滤掉生成物1,3-二环己基脲，保留活化酯过滤液。将1mmol的苄氧羰基-色氨酸苯丙酯溶于10mL的绝对甲醇中，加入100mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到产物色氨酸苯丙酯，将其加入四氢呋喃溶解，之后加入到活化酯过滤液中，0℃搅拌反应30min，之后室温反应12h。减压蒸馏，余液用乙酸乙酯溶解，之后依次用5％柠檬酸溶液，饱和碳酸氢钠溶液和饱和氯化钠溶液洗涤三次。无水硫酸钠干燥有机相，减压蒸馏，得到白色固体产物苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯丙酯，产率为77％。

(4)酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯丙酯的合成

将0.5mmol的苄氧羰基-酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯丙酯溶于8mL的绝对甲醇中，加入80mg钯碳，通入氢气，室温反应3h。过滤掉钯碳，减压蒸馏，得到白色固体终产物酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯丙酯，产率为95％。

酪氨酸-脯氨酸-色氨酸苯丙酯的结构式如下：

以上实施例制备的内吗啡肽-1类似物的质谱和色谱分析检测结果如表1所示。

表1.内吗啡肽-1类似物1-3的质谱和色谱分析检测结果

表1的结果表明，以上实施例得到的类似物的检测值与理论值相符。

实施例1-3制备的C-末端芳香酯化修饰的内吗啡肽-1类似物的生物活性实验如下：

1、放射性标记亲和实验

通过制备大鼠脑膜蛋白获得阿片受体，实验分为总结合管、竞争结合管和非特异性结合管，每个反应管中依次加入放射配体，纳洛酮(Naloxone，Nx)/非放射性药物，Tris-HCl(pH＝7.4)和脑膜蛋白。其中，在总结合管中只加入[³H]DAMGO(0.5nM)或[³H]DPDPE(1nM)和脑膜蛋白，在非特异性结合管和竞争结合管中，分别另加入10μM>50值，根据公式Ki＝IC₅₀/(1+[L]/KD)计算K_i值。每个实验数据分别平行做3组实验求平均值。

实验结果见表2。表2的数据显示，C-末端苯甲酯和苯丙酯化修饰的内吗啡肽-1类似物1和3的μ-阿片受体的亲和性比母体内吗啡肽-1低约2到4倍左右，其δ-阿片受体的亲和性也低于母体。然而，C-末端苯乙酯化修饰的类似物2的μ-阿片受体的亲和性明显高于内吗啡肽-1，而其δ-阿片受体亲和性反而比母体低，即其选择性提高。这表明类似物2对μ-阿片受体具有高亲和性和选择性特征。

表2.内吗啡肽-1及类似物1-3的阿片受体亲和性

多肽K_i(μ)[nM]K_i(δ)[nM]K_i(δ)/K_i(μ)内吗啡肽-14.55±0.165093±6601119类似物18.2±1.1>10000>1220类似物22.46±0.81>10000>4065类似物321.3±4.17>10000>469

2、离体酶解稳定性实验

取10μ1多肽母液(10^-2M)，加入到190μL的100％小鼠血清或15％脑质膜中，立即振荡混匀，然后迅速取出20μL混合液，加入离心管中计时为0min，余者于37℃下继续孵育，并分别在5min，10min，15min，30min，60min，120min，240min取出20μL。酶解过程的终止：于取出的样品中加入90μL乙腈振荡混匀，样品置于冰上放置5min，再用90μL0.5％的冰冷乙酸稀释以确保酶解过程停止。13,000g离心15min，收集上清，-80℃冻存，直至RP-HPLC分析。

实验结果见表3。表3的结果显示，内吗啡肽-1的小鼠脑质膜和血清半衰期较短，而所有芳香酯化的类似物1-3的半衰期都显著长于母体内吗啡肽-1。其中，类似物2和3在两种离体组织标本中的酶解稳定性最高，而类似物1的稳定性比其它两个类似物略低。该结果表明C-末端芳香酯化修饰明显提高了类似物的抗酶解能力。

表3.内吗啡肽-1及类似物1-3的脑膜和血清半衰期

3、正辛醇/缓冲液分配系数测定

将等体积的正辛醇与0.05M HEPES/0.1M的NaCl缓冲液混合，室温下平衡12h。待混合液分层后，分离两相，4℃保存。试验时，将50μg多肽药物加入到500μL正辛醇饱和的HEPES缓冲液中，然后与等体积的正辛醇振荡涡旋2min。样品于4,000rpm离心1min，分离水层和正辛醇层。水层直接用于RP-HPLC分析。正辛醇层冻干，加等量甲醇溶解，RP-HPLC分析。正辛醇/缓冲液分配系数(D)用药物在正辛醇层与缓冲液层的含量比值表示。

实验结果见表4。表4的结果显示，内吗啡肽-1的正辛醇/缓冲液分配系数(D)为11.2±0.57，而类似物1-3的分配系数(D)明显大于内吗啡肽-1，约为母体的20倍左右。该结果表明C-末端芳香酯化修饰明显提高了类似物的脂溶性。

表4.内吗啡肽-1及类似物1-3的正辛醇/缓冲液分配系数

4、镇痛实验

采用昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃，水浴温度：50±0.5℃。给药前先测定小鼠的基础痛阈(control latency，CL)，将小鼠鼠尾的1/3-1/2浸入水浴，记录鼠尾从刚浸入水浴至发生收缩的时间。过于敏感(<3s)或迟钝的(>5s)小鼠弃去不用，截止时间10s，以防止小鼠烫伤。侧脑室给药后第5,10,15,20,25,30,40and 50min各测一次甩尾潜伏期(test latency，TL)，皮下给药后第5,10,15,20,25,30,45,60and 90min各测一次TL，0.9％生理盐水作为空白对照。结果以最大可能效应百分比(maximum possibleeffect，％MPE)表示：％MPE＝100×(TL-CL)/(10-CL)。

实验结果如图1、2和3所示(其中图1和图2中■表示注射剂量10nmol，●表示注射剂量3nmol，▲表示注射剂量1nmol，▼表示注射剂量0.3nmol，◆表示注射生理盐水；图3中■表示类似物1(注射剂量μmol/kg)，●表示类似物2(注射剂量μmol/kg)，▲表示生理盐水)，中枢侧脑室注射0.3-10nmol剂量的类似物1和2产生明显的中枢镇痛效果，具有浓度依赖型的特点。在注射药物5min后产生最大的镇痛作用，且镇痛持续时间较长，可持续30-40min左右，这表明这些类似物具有高效的中枢镇痛活性。此外，通过外周皮下注射10μmol/kg的类似物1和2，结果发现类似物仍然具有高效的镇痛活性，在注射药物10min后产生最大的镇痛作用，且镇痛持续时间较长，类似物1和2的镇痛％MPE在给药后60min测定，分别为13.07％和19.24％，表明类似物1和2通过外周给药持续时间可以达到60min以上。以上结果证明对内吗啡肽-1的C-末端进行芳香化修饰增强了药物的镇痛活性及作用时间。

本发明中将内吗啡肽-1的4位苯丙氨酸去除，减小C-末端的空间位阻，目的为了提高内吗啡肽的μ-阿片受体亲和性。同时对C-末端进行不同的芳香酯化修饰，提高类似物的酶解稳定性和脂溶性。通过外周给予类似物，增强药物向中枢系统的运输能力，提高药物的利用率和镇痛效能。

综上所述，本发明对内吗啡肽-1的C-末端进行芳香酯化修饰，通过放射性标记亲和实验，离体酶解稳定性，正辛醇/缓冲液分配系数测定及镇痛实验，对本发明合成的类似物进行药理学活性鉴定。其中，C-末端苯乙酯化修饰的类似物2具有比母体内吗啡肽-1更高的μ-阿片受体亲和性、生物稳定性和脂溶性，及外周给药的镇痛活性等优点，在制备新型高效的多肽镇痛药物方面具有潜在的应用价值。

5、急性耐受实验

选取昆明系雄性小鼠，18-22g，环境温度：20℃。利用PE-10插管对小鼠侧脑室埋管，手术后3天给药。根据内吗啡肽-1类似物的镇痛活性，确定药物剂量，测定急性镇痛耐受。小鼠提前1小时侧脑室注射药物或生理盐水1次，之后分别注射不同剂量的药物，测定疼痛阈值变化，进而对内吗啡肽-1及类似物1和2进行镇痛耐受评估。

内吗啡肽-1及类似物1和2的镇痛耐受结果如图4、5和6所示(图4中■表示生理盐水+内吗啡肽-1，●表示内吗啡肽-1(10nmol)+内吗啡肽-1；图5中■表示生理盐水+类似物1，●表示类似物1(10nmol)+类似物1；图6中■表示生理盐水+类似物2，●表示类似物2(10nmol)+类似物2)，提前1小时对小鼠侧脑室注射生理盐水，之后侧脑室注射0.3-10nmol剂量的内吗啡肽-1及其类似物1和2均产生显著的浓度依赖型的镇痛作用，表明提前注射生理盐水对内吗啡肽-1及类似物镇痛作用的发挥没有显著影响。但是，通过提前1小时对小鼠侧脑室注射10nmol剂量的内吗啡肽-1，之后再注射不同剂量的内吗啡肽-1，其镇痛剂量曲线明显右移，镇痛效果显著降低，即内吗啡肽-1产生了镇痛耐受。然而，提前1小时侧脑室注射10nmol剂量的类似物1，再注射不同剂量的类似物1，其镇痛耐受剂量曲线右移程度较小，表明类似物1的镇痛耐受明显降低。此外，提前1小时侧脑室注射10nmol剂量的类似物2，再注射不同剂量的类似物2，其镇痛剂量曲线与提前注射生理盐水的剂量曲线几乎重合，曲线右移不明显。该结果表明类似物1和2的镇痛耐受副作用明显降低，尤其类似物2具有无耐受的高效镇痛活性。

6、大鼠整体血压实验

Wistar大鼠，200-300g，用20％的氨基甲酸乙酯麻醉(l.2g/kg,i.p.)，为了保持麻醉状态良好，可能需要临时补加麻醉药物。切开大鼠的气管，清除管内粘液，动物能自主呼吸。PE-50导管插入到颈外静脉以备静脉给药，PE-50导管插入颈大动脉，并与YP-100压力传感器相连，记录给药后血压的变化。系统动脉压和心率数据主要通过成都泰盟BL-420F生物记录系统平均化处理获得。药物静脉每次注射100μL，10～15秒内注射完成。

内吗啡肽-1及类似物1和2对大鼠心血管作用的实验结果如图7和8所示(其中■表示内吗啡肽-1，表示类似物1，表示类似物2)，静脉注射1-10nmol剂量的内吗啡肽-1及类似物1和2显著降低大鼠系统动脉血压，并且呈剂量依赖型。但是类似物1和2对动脉血压降低的效果明显低于母体内吗啡肽-1。此外，静脉注射1-10nmol剂量的内吗啡肽-1及类似物1和2剂量依赖的降低大鼠的心率。同样，类似物1和2对心率降低的百分率明显低于内吗啡肽-1。该结果表明，类似物1和2对心血管系统的作用效果明显低于内吗啡肽-1，因此具有较低的心血管副作用。

7、大鼠离体支气管实验

Wistar大鼠，体重200-300，处死后放血，快速取出肺、气管及支气管。在持续通入95％O₂和5％CO₂混合气的Kreb’s液[NaCl>2>41.2mM；NaHCO₃>2PO₄>-6M；茚甲薪(indomethacin)10^-6M]中分离左右支气管，剪成5mm左右长的环。两个不锈钢钩将支气管环悬挂在盛有10ml>2和5％CO₂混合气，恒温37.0±0.5℃，支气管环处于平行的两个铂金电极的中间。用零号丝线连接到JZ-100型肌肉张力传感器上。预张力为0.5g，每15min换一次营养液，平衡1小时后开始试验。对样本给予电刺激，刺激参数：电压40V，波宽0.5ms，频率4Hz，刺激时间15s，刺激之间间隔4min。记录电刺激基础收缩强度，然后分别给予不同剂量的待试药物，药物提前10min加入，记录给药后收缩强度。药物对电刺激引起的支气管收缩的抑制百分率＝(基础收缩强度-给药后收缩强度)/基础收缩强度×100％。

内吗啡肽-1及类似物1和2对4Hz频率的电刺激引起的大鼠支气管收缩的抑制作用如图9所示(其中■表示内吗啡肽-1，表示类似物1，表示类似物2)，内吗啡肽-1及类似物1和2对电刺激引起的大鼠支气管收缩具有浓度依赖型的抑制作用。但是类似物1和2对支气管收缩的抑制作用跟母体内吗啡肽-1相比明显减弱。在4Hz频率的电刺激下，10μmol/L的类似物1和2对支气管收缩的抑制率为30％-35％左右，明显低于内吗啡肽-1对支气管收缩的抑制率。该结果表明类似物1和2对呼吸支气管的作用较低，有利于降低阿片药物引起的呼吸抑制的副作用。

综上所述，本发明对内吗啡肽-1的C-末端进行芳香酯化修饰，通过放射性标记亲和实验，离体酶解稳定性，正辛醇/缓冲液分配系数测定，镇痛与耐受实验，以及整体血压和离体支气管实验，对本发明合成的类似物进行药理学活性鉴定。结果表明，本发明的内吗啡肽-1类似物的生物稳定性和脂溶性均显著提高，而且C-末端苯乙酯化修饰的类似物2具有比母体内吗啡肽-1更高的μ-阿片受体亲和性。此外，类似物1和2具有中枢和外周给药的高效镇痛活性，并且镇痛耐受副作用明显降低，尤其类似物2具有无耐受的镇痛特性，且类似物1和2对心血管和呼吸系统的副作用也明显降低。因此，本发明的内吗啡肽-1类似物在制备高效、低副作用的多肽镇痛药物方面具有很高的应用价值。