一种多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒及其检测方法，所述试剂盒包括多肽抗原、包被液、多肽抗原包被的酶标板、抗体稀释液、PBST洗涤液、阳性血清、阴性血清、封闭液、用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗、底物显色液TMB、终止液，所述特异性多肽抗原为：TEp1，序列为：SWDEVFDEAHTKRKKGGGGSGGGGSFDEAHTKRKKFYPTPGGGGSGGGGTKRKKFYPTPHSSIKGQGQGQGFYPTPHSSIKIPMMT。本发明设计的多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒，其操作方法简单，检测速度快，利用TEp1多肽抗原作为包被抗原，与目标抗体的结合效率高，特异性好，TEp1多肽抗原制备方法和成分简单，降低了猪旋毛虫检测的成本。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒及其检测方法。

背景技术

猪旋毛虫病诊断方法主要包括镜检法、集样消化法和基于旋毛虫ES抗原的间接ELISA。肌肉消化法是OIE规定的检测猪旋毛虫病的金标准，但操作费时费力且敏感性差，只适合用于实验室检测。间接ELISA检测方法是目前最为敏感的免疫学检测方法，但由于采用的旋毛虫ES抗原制备困难，增加了旋毛虫检测的成本。且由于ES抗原成分复杂，特异性不强，因此，筛选特异性及敏感性的抗原以建立快速及特异检测方法、减小抗原制备难度、降低猪旋毛虫检测成本等已成为国内外众多学者的研究焦点。

发明内容

为克服现有技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种特异性强的多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒及其检测方法。

本发明是这样实现的，一种多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒，包括多肽抗原、包被液、多肽抗原包被的酶标板、抗体稀释液、PBST洗涤液、阳性血清、阴性血清、封闭液、用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗、底物显色液TMB、终止液，所述多肽抗原为：TEp1，序列为：SWDEVFDEAHTKRKKGGGGSGGGGSFDEAHTKRKKFYPTPGGGGSGGGGTKRKKFYPTPHSSIKGQGQGQGFYPTPHSSIKIPMMT。

优选地，所述多肽抗原TEp1按照酶标板每孔1μg抗原包被。

优选地，所述包被液为pH＝9.6，浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液，所述碳酸盐缓冲液由Na₂CO₃和NaHCO₃按质量比为16:29混合而成。

优选地，所述阳性血清为抗体稀释液与旋毛虫感染猪阳性血清按体积比1：100的比例稀释而成。

优选地，所述阴性血清为抗体稀释液与旋毛虫阴性血清按体积比1：100的比例稀释而成。

优选地，所述PBST洗涤液包括NaCl 8g/L，KCl 0.2g/L，Na₂HPO₄>2PO₄0.2g/L，Tween-20体积分数0.05％，溶剂为蒸馏水，所述PBST洗涤液的pH值为7.4。

优选地，所述封闭液为含50g/L脱脂奶粉的TBST溶液。

优选地，所述用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗是PBST溶液与兔抗猪二抗按体积比1：8000的比例稀释而成。

优选地，所述终止液是浓度为2M的H₂SO₄。

本发明进一步提供了一种多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的检测方法，该方法利用上述多肽抗原检测旋毛虫抗体的试剂盒进行检测，包括以下步骤：

(1)将TEp1用包被液稀释后滴在酶标板上，4℃过夜包被；

(2)甩去包被液，用PBST洗涤液振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(3)将包被有TEp1的酶标板于封闭液中37℃封闭1h；

(4)甩去封闭液，用PBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(5)将酶标板加入阳性血清中，湿盒内37℃孵育30min；所述阳性血清中旋毛虫感染猪血清为20000条肌幼虫经口感染160d；

(6)甩去血清，用PBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(7)加入用辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗，湿盒内37℃孵育30min；

(8)甩去残留的酶结合物溶液，用PBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(9)加入TMB底物显色液，置入湿盒内37℃恒温箱中静置10min；

(10)取出酶标板，每孔加浓度为2M H₂SO₄终止液，终止反应。

相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：

本发明通过筛选强反应原性的抗原表位，组合成多肽抗原，设计了多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒，并建立猪旋毛虫病检测方法；本发明多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的试剂盒的操作方法简单，检测速度快，利用本发明设计的TEp1多肽抗原作为包被抗原，与目标抗体的结合效率高，特异性好，TEp1多肽抗原制备方法和成分简单，降低了猪旋毛虫检测的成本。

附图说明

图1是本发明实施例提供的诱导与未经诱导阳性菌株全菌蛋白SDS-PAGE电泳图；图A中：1-蛋白分子量标准，2-未转化全菌蛋白；3-Ser3IPTG诱导全菌蛋白；4-Ser5IPTG诱导全菌蛋白；图B中：1-蛋白分子量标准，2-未转化全菌蛋白；3-Ser1IPTG诱导全菌蛋白；4-Ser2IPTG诱导全菌蛋白；5-Ser6IPTG诱导全菌蛋白；图C中：1-蛋白分子量标准，2-Ser4诱导表达破碎后的上清蛋白；3-Ser4诱导表达破碎后的不溶蛋白。

图2是本发明实施例提供的纯化Serpin蛋白及分段蛋白SDS-PAGE电泳图；图中：1-蛋白分子量标准；2-Ser4蛋白；3-Ser3蛋白；4-Ser2蛋白；5-Ser1蛋白；6-标签蛋白；7-Serpin全长蛋白；8-Ser5蛋白；9-Ser6蛋白。

图3是本发明实施例提供的纯化后蛋白质免疫印迹结果图；图中：1-蛋白分子量标准；2-Ser4蛋白；3-Ser2蛋白；4-Serpin全长蛋白；5-Ser5蛋白；6-Ser1蛋白；7-Ser3蛋白；8-Ser6蛋白；9-标签蛋白。

图4是本发明实施例提供的Jameson-Wolf模块对Serpin全长蛋白序列进行抗原表位分析结果图。

图5是本发明实施例提供的候选短多肽点杂交实验结果图；图中：1-S₁₆₉WDEVFDEAHTKRKK；2-F₁₇₄DEAHTKRKKFYPTP；3-T₁₇₉KRKKFYPTPHSSIK；4-S₁₉₀SIKIPMMTQTNGYSY；5-F₁₈₄YPTPHSSIKIPMMT；6-A₁₅₄NTRLIAVNAIYFKA；7-S₁₄₉GTVEANTRLIAVNA；8-I₁₅₉AVNAIYFKASWDEV；9-I₁₆₄YFKASWDEVFDEAH。

图6是本发明实施例提供的串联多肽序列点杂交实验结果图；图中：a-TEp1，b-TEp2；c-TEp3，1-2mg/mL；2-0.2mg/mL；3-0.04mg/mL。

图7是本发明实施例提供的抗原包被试验板每孔1μg多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的结果图。

图8是本发明实施例提供的抗原包被试验板每孔5μg多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的结果图。

图9是本发明实施例提供的抗原包被试验板每孔10μg多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的结果图。

图10是本发明实施例提供的多肽抗原的特异性检测实验结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

一、多肽抗原的制备

1、Tsserpin蛋白序列及蛋白分段序列：

(1)Tsserpin蛋白全长序列：

METEIAKPLADFAYSLYQLEEAGNVFFSPVSIFLALAMVFFGSNGNTNTQLLNVMFKAGWKKNRTKKAMRSFVSSLTIDEYYDASLKLANRLYANDQYPILHPFLKDVKRYLSSDLVSVNFADTEAARLQINKWVSDQTNHKINDLLQSGTVEANTRLIAVNAIYFKASWDEVFDEAHTKRKKFYPTPHSSIKIPMMTQTNGYSYYETEDYQFLGMDYYPEYLKMFILLPKSGKTLSELQQKFNGETLLNLVSKVSGAEVKVTIPKMKFEKQMNLVEALKKLGIEDLFIPGKADLSGICVKEKLYVSDIVHKAYLEFNEEGTEAAAATADRIVPMSGVMYEDSFEFVADHPFLFFIFDSRSKAILFIGRFSGN

(2)Tsserpin蛋白分段序列：

Ser1：

METEIAKPLADFAYSLYQLEEAGNVFFSPVSIFLALAMVFFGSNGNTNTQLLNVMFKAGWKKNRTKKAMRSFVSSLTIDEYYDASLKLANRLYANDQYPILHPFLKDVKRYLSSDLVSVNFADTEAARLQINKWVSDQTNHKINDLLQSGTVEANTRLI

Ser2：

AVNAIYFKASWDEVFDEAHTKRKKFYPTPHSSIKIPMMTQTNGYSYYETEDYQFLGMDYYPEYLKMFILLPKSGKTLSELQQKFNGETLLNLVSKVSGAEVKVTIPKMKFEKQMNLVEALKKLGIEDLFIPGKADLSGICVKEKLYVSDIVHKAYLEFNEEGTEAAAATADRIVPMSGVMYEDSFEFVADHPFLFFIFDSRSKAILFIGRFSGN

Ser3：

FILLPKSGKTLSELQQKFNGETLLNLVSKVSGAEVKVTIPKMKFEKQMNLVEALKKLGIEDLFIPGKADLSGICVKEKLYVSDIVHKAYLEFNEEGTEAAAATADRIVPMSGVMYEDSFEFVADHPFLFFIFDSRSKAILFIGRFSGN

Ser4：

VHKAYLEFNEEGTEAAAATADRIVPMSGVMYEDSFEFVADHPFLFFIFDSRSKAILFIGRFSGN

Ser5：

AVNAIYFKASWDEVFDEAHTKRKKFYPTPHSSIKIPMMTQTNGYSYYETEDYQFLGMDYYPEYLKMFILLPKSGKTLSELQQKFNGETLLNLVSKVSGAEVKVTIPKMKFEKQMNLVEALKKLGIEDLFIPGKADLSGICVKEKLYVSDIVHKAYLEFN

Ser6：

PTPHSSIKIPMMTQTNGYSYYETEDYQFLGMDYYPEYLKMFILLPKSGKTLSELQQKFNGETLLNLVSKVSGAEVKVTIPKMKFEKQMNLVEALKKLGIEDLFIPGKADLSGICVKEKLYVSDIVHKAYLEFNEEGTEAAAATADRIVPMSGVMYEDSFEF

2、Serpin蛋白分段表达与鉴定

(1)挑选含重组质粒的单菌落至3mL LB液体培养基(卡那抗性)中，37℃培养过夜后-20℃保种；

(2)分别挑选含重组质粒的多个单菌落至3mL LB液体培养基(卡那抗性)中，37℃震荡培养至OD600约0.6；

(3)取部分菌液作为对照组，余下菌液加入IPTG诱导剂，终浓度为1mM，37℃震荡培养3h；

(4)分别取两组菌液0.15mL，12000×g离心2min，菌体沉淀以40μL1×loading bμffer重悬，取上清进行SDS-PAGE检测，结果如图1所示。

3、包涵体蛋白纯化

(1)沉淀菌体，以50mL NTA-0缓冲液重悬，NTA-0缓冲液的pH＝8.0，NTA-0缓冲液为Tris base和NaCl；

(2)超声裂解菌体，参数设置为功率200W、工作3s、暂停3s、99个循环；

(3)8000rpm 4℃离心10min，去上清；

(4)沉淀以PBS重悬，超声，参数设置为功率200W、工作3s、暂停3s、40个循环；

(5)16000rpm 4℃离心10min，去上清；

(6)以3mL 6M盐酸胍重悬包涵体；

(7)220rpm 37℃震荡3h至包涵体全部溶解；

(8)10000rpm 4℃离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，检测结果如图2所示。

4、蛋白质免疫印迹(Western blotting)

(1)将SDS-PAGE电泳后的样品在200V电压条件下对硝酸纤维素膜转移1.5h；

(2)电转移后将硝酸纤维素膜于含50g/L脱脂奶粉的TBST溶液中4℃过夜封闭；

(3)再用TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(4)将硝酸纤维素膜浸于用抗体稀释液与旋毛虫感染猪血清按体积比1：100的比例稀释而成的溶液中，每孔加100μL，37℃孵育1h；所述旋毛虫感染猪血清为20000条肌幼虫经口感染160d。

(5)用PBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min。

(6)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗100μL，室温轻摇1h，其中辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗是PBST溶液与兔抗猪二抗按体积比1：8000的比例稀释而成；

(7)用TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(8)加入DAB显色液，室温下避光显色，最后用蒸馏水终止反应。

纯化后蛋白质免疫印迹结果如图3所示。

5、抗原表位的分析及鉴定

将Serpin全长蛋白序列利用DNA Star中Jameson-Wolf模块进行抗原表位分析，结果如图4所示；蛋白质免疫印迹结果结合抗原表位分析结果预测强反应原性多肽主要集中在：

S₁₄₉GTVEANTRLIAVNAIYFKASWDEVFDEAHTKRKKFYPTPHSSIKIPMMTQTNGYSY₂₀₅之间，候选短肽序列及位置则如下：

S₁₄₉GTVEANTRLIAVNA；A₁₅₄NTRLIAVNAIYFKA；I₁₅₉AVNAIYFKASWDEV；I₁₆₄YFKASWDEVFDEAH；S₁₆₉WDEVFDEAHTKRKK；F₁₇₄DEAHTKRKKFYPTP；T₁₇₉KRKKFYPTPHSSIK；F₁₈₄YPTPHSSIKIPMMT；S₁₉₀SIKIPMMTQTNGYSY

6、候选短多肽点杂交

(1)将1μL候选短多肽样品(0.5mg/mL)分别滴在硝酸纤维素膜上；

(2)将硝酸纤维素膜于含50g/L脱脂奶粉的TBST溶液中4℃过夜封闭；

(3)用TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(4)将硝酸纤维素膜浸于用抗体稀释液与旋毛虫感染猪血清按体积比1：100的比例稀释而成的溶液中，37℃孵育1h；所述旋毛虫感染猪血清为20000条肌幼虫经口感染160d；同时用健康猪血清作对照。

(5)用TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(6)加辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗100μL，室温轻摇1h，其中辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗是PBST溶液与兔抗猪二抗按体积比1：8000的比例稀释而成，室温轻摇1h；

(7)TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

(8)加入DAB显色液，室温下避光显色，最后用蒸馏水终止反应。

候选短多肽点杂交实验结果如图5所示，可知具有反应原性的多肽序列及位置为：S₁₆₉WDEVFDEAHTKRKK，F₁₇₄DEAHTKRKKFYPTP，T₁₇₉KRKKFYPTPHSSIK和F₁₈₄YPTPHSSIKIPMMT。

7、串联多肽序列

由候选短多肽点杂交实验结果获得如下3种串联多肽序列：

TEp1(多肽序列1)：

SWDEVFDEAHTKRKKGGGGSGGGGSFDEAHTKRKKFYPTPGGGGSGGGGTKRKKFYPTPHSSIKGQGQGQGFYPTPHSSIKIPMMT

TEp2(多肽序列2)：

SWDEVFDEAHTKRKKGGGGSGGGGSFDEAHTKRKKFYPTPGGGGSGGGGTKRKKFYPTPHSSIKGQGQGQGRPTSPSSGSRPTYP

TEp3(多肽序列3)：

SWDEVFDEAHTKRKKGGGGSGGGGTKRKKFYPTPHSSIKGGGGSGGGGTKRKKFYPTPHSSIKGQGQGQGRPTSPSSGSRPTYP

二、多肽抗原的筛选

对串联多肽序列进行点杂交实验，具体方法如下：

1、将TEp1、TEp2和TEp3样品各取1μL分别滴在硝酸纤维素膜上，每种样品浓度选择3种进行实验，分别为2mg/ml、0.2mg/ml和0.04mg/ml；

2、将硝酸纤维素膜于含50g/L脱脂奶粉的TBST溶液中4℃过夜封闭；

3、用TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

4、将硝酸纤维素膜浸于用抗体稀释液与旋毛虫感染猪血清按体积比1：100的比例稀释而成的溶液中，湿盒内37℃孵育1h；所述旋毛虫感染猪血清为20000条肌幼虫经口感染160d；同时用健康猪血清作对照。

5、用TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

6、加辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗100μL，室温轻摇1h，其中辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗是PBST溶液与兔抗猪二抗按体积比1：8000的比例稀释而成，湿盒内37℃孵育30min；

7、TBST振荡洗涤4次，每次洗涤5min；

8、加入DAB显色液，室温下避光显色，最后用蒸馏水终止反应；

串联多肽点杂交实验结果如图6所示，从图6中可以看出，串联多肽TEp1和TEp2有反应原性，且TEp1的反应原性强于TEp2，而TEp3没有反应原性。

三、多肽抗原检测猪旋毛虫抗体的条件优化

1、抗原包被：将TEp1、TEp2、Serpin全长和ESAs四种抗原各自进行4种抗原包被，分别是按照酶标板每孔1μg、2μg、5μg和10μg抗原包被，设置对照组加PBS，4℃包被过夜。

2、洗涤：甩去包被液，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

3、封闭：将包被有TEp1的酶标板于封闭液中37℃封闭1h。

4、洗涤：甩去封闭液，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

5、加样：用抗体稀释液对旋毛虫感染猪阳性血清分别作体积比为1：10，1：20，1：50，1：100和1：200的稀释，酶标板每孔加100μL，湿盒内37℃恒温箱中孵育30min。

6、洗涤：甩去血清，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

7、加酶结合物：每孔加100μL用PBST溶液与兔抗猪二抗按体积比1：8000的比例稀释而成的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗，置湿盒内37℃恒温箱中孵育30min。

8、洗涤：甩去残留的酶结合物溶液，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

9、显色：每孔加0.10mL TMB底物显色液，置入湿盒内37℃恒温箱中静置10min。

10、终止反应：取出酶标板，每孔加2M H₂SO₄终止液0.10mL。

检测结果如图7-9所示，由图7-9可知，四种抗原中，TEp1、Serpin全长和ESAs抗原反应原性显著强于TEp2抗原，其中反应原性强弱排序为ESAs抗原>Serpin全长>TEp1；多肽抗原最优检测条件为：抗原包被酶标板每孔1μg，抗体稀释液与旋毛虫感染猪阳性血清体积比例为1：100，辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG二抗为PBST溶液与兔抗猪二抗按体积比1:8000稀释而成。

四、多肽抗原的特异性检测实验

1、抗原包被：分别将TEp1、Serpin全长和ESAs抗原用包被液稀释，按照每孔1μgTEp1、1μg Serpin全长和1μg ESAs抗原滴在酶标板上，设置对照组加PBS，4℃包被过夜。

2、洗涤：甩去包被液，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

3、封闭：将包被有TEp1的酶标板于封闭液中37℃封闭1h。

4、洗涤：甩去封闭液，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

5、加样：用抗体稀释液分别对旋毛虫感染猪阳性血清、旋毛虫阴性血清(记作Negative)、弓形虫阳性猪血清和猪囊虫阳性猪血清按体积比作1：100的稀释，每孔加100μL，湿盒内37℃恒温箱中孵育30min。

6、洗涤：甩去血清，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

7、加酶结合物：每孔加入PBST溶液与兔抗猪二抗按体积比1：8000的比例稀释而成的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG二抗100μL，置湿盒内37℃恒温箱中孵育30min。

8、洗涤：甩去残留的酶结合物溶液，用PBST洗涤4次，每次洗涤5min。

9、显色：每孔加0.10mL TMB底物显色液，置入湿盒内37℃恒温箱中静置10min。

10、终止反应：取出酶标板，每孔加终止液2M H₂SO₄终止液0.10mL。

检测结果如图10所示，由图10中可知，ESAs和Serpin抗原检测旋毛虫猪阳性血清的OD值高于TEp1抗原，但ESAs和Serpin抗原与弓形虫和猪囊虫阳性血清的交叉反应值高于TEp1抗原。TEp1抗原的特异性好于ESAs和Serpin抗原。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。