一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方法

摘要

本发明涉及一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方法，即葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量测定方法。其特征：以乙腈为A相、体积比1∶30的甲醇‑0.1％磷酸为B相，经4次比例变换梯度洗脱，流速1.0mL/min；柱温40℃；检测波长：263nm；同时测定补肾托毒颗粒中葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量。波峰保留时间：葛根素9.5分钟、金丝桃苷15.5分钟、淫羊藿苷28.5分钟，在30分钟内三种成分出峰完毕，且各波峰分离良好。方法简便、快捷、高效率、低成本，易于普及掌握。

说明书

技术领域

本发明属中药质量控制领域，涉及一种补肾托毒颗粒中三种黄酮成分的含量测定方 法，即葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量测定方法。

背景技术

补肾托毒颗粒由淫羊藿、补骨脂、菟丝子、枸杞子、地黄、蒲公英、虎杖、黄 芪、葛根、人参和三七，十一味药材组成，具有补肾填精，益气养血之功效，用于脾肾之虚， 气血不足之“虚劳”引起的头晕、心悸，气短乏力，面色唇甲淡白，皮肤粘膜出血，月经量 多，腰膝疲软等；再生障碍性贫血、缺铁性贫血、巨细胞贫血、溶血性贫血、白血病、骨髓 增生异常综合征、血小板减少性紫癜、多发性骨髓瘤、骨髓纤维化及癌症放化疗引起的骨髓 抑制等见上述证候者。其中淫羊藿和补骨脂为君药，菟丝子、枸杞子和地黄为臣药，人参、 黄芪、蒲公英、虎杖和三七为佐药，葛根为使药。诸药配合，补虚透邪，标本兼顾.共发挥阴阳 双补，填精益髓，补气养血，托毒透邪之功效。在治疗脾肾虚弱、气血不足引起的头晕、心悸， 气短乏力以及再生障碍性贫血等方面获得较好效果。为确保临床治疗效果，对其质量控制方 法进行了研究。获得同时测定君药淫羊藿中的淫羊藿苷，君药淫羊藿和臣药菟丝子中的金丝 桃苷，以及使药葛根中葛根素的一测多评测定方法。

补肾托毒颗粒剂重量比配方如下：

淫羊藿 16～46份 补骨脂 11～33份 菟丝子 13～35份 枸杞 10～30份

生地黄 10～30份 蒲公英 10～30份 虎杖 6～12份黄芪 10～30份

葛根 6～12份人参 3～10份三七 1～3份

上述配方中的十一味中药，人参、三七粉碎成细粉备用；淫羊藿、菟丝子、蒲公英、黄芪、虎杖，加10倍量70％乙醇提取二次，每次2.5小时，滤过，合并滤液，回收乙醇后， 备用；其余补骨脂、枸杞子等四味中药，加10倍量水，提取2次，每次2.5小时，滤过，合 并滤液，70℃减压浓缩至相对密度1.15-1.20(60℃)清膏，与醇提清膏合并，继续在70℃ 减压浓缩至相对密度1.25-1.30(60℃)稠膏，加入备用的药材细粉，搅拌均匀，在70℃减 压干燥，取干膏，加入200-240g糊精与适量甜菊素，混合粉碎，用适量浓度乙醇制粒，70℃ 减压干燥，制成颗粒1000g，即得。

按照国家规定的君、臣、佐、使各味药材在处方中作用顺序以及贵重中药、有毒中药 尽量增订定量检测标准的原则，拟采用一测多评的手段，对君药淫羊藿中的淫羊藿苷、金丝 桃苷，臣药菟丝子中的金丝桃苷以及使药葛根中葛根素进行同时定量测定。以实现高效率、 低成本、多指标控制制剂质量的目的。

查阅资料得知，在中国药典2015年版一部淫羊藿药材项下，收载了淫羊藿苷的两种 含量测定方法，即药材项下是用乙腈-水(30∶70)为流动相，以等度洗脱的方式，270nm为检测波长，测定药材中的淫羊藿苷；在其炙淫羊藿项下，则是以乙腈为A相、水为B相，以 梯度洗脱方式，即0～29min，25％A；29～30min，25％～41％A；30～55min，41％A；270nm 为检测波长，测定饮片中的淫羊藿苷和宝藿苷I。很明显炙淫羊藿的多成分测定，因黄酮类 的结构与性质差异，需要采用梯度洗脱的方式，才能将淫羊藿苷和宝藿苷I分离，运行一针 要花费近1小时。在淫羊藿药材项下未收载金丝桃苷的含量测定指标，但其含有一定量金丝 桃苷。在中国药典2015年版一部菟丝子和葛根药材项下，分别收载了用乙腈-0.1％磷酸(17∶83)和甲醇-水(25∶75)为流动相，以等度洗脱的方式，以360nm和250nm为检测波长，分 别测定菟丝子中的金丝桃苷和葛根中的葛根素含量方法。但未查阅到在中药制剂中同时测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的报道。

通过多种流动相的组合、配比、检测波长、以及梯度时间程序改变等研究，获得35分钟内测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷一测多评测定方法。

发明内容

以乙腈为A相、甲醇-0.1％磷酸(1∶30)为B相，采用梯度洗脱方式，即0～20min， 8～25％A；20～35min，25～42％A；35～35.1min，42～8％A；35.1～40mm，8％A；流速1.0mL/min； 柱温40℃；检测波长：263nm；在35分钟内测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷一测多评测 定方法。三成分的保留时间：葛根素9.5分钟、金丝桃苷15.5分钟、淫羊藿苷28.5分钟，波峰分离良好。

通过方法学考察，葛根素进样量在0.3656-3.656μg，与峰面积呈良好的线性关系(见 表1、图1)，回归方程为Y＝1550341.2X+27450，r＝0.99996；金丝桃苷进样量在0.0235-0.235μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表2、图2)，回归方程为Y＝1308624.9X+436，r＝0.99997；淫羊藿苷进样量在0.5038-5.038μg，与峰面积呈良好的线性关系(见表3、图3)，回归方程为Y＝953714.8X+37825，r＝0.9999。采用加样回收实验，结果表明：葛根素的平均回收率为100.54％，RSD为0.71％(n＝6，见表5)；金丝桃苷的平均回收率为100.86％， RSD为0.77％(n＝6，见表6)；淫羊藿苷的平均回收率为100.02％，RSD为0.16％(n＝6，见表7)； 精密度(见表8)、稳定性(见表9)、重复性(见表10)，均符合方法学要求。适用于补肾托毒 颗粒中葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的同时定量测定。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案为：

(1)色谱条件与系统适用性试验以乙腈为A相、甲醇-0.1％磷酸(1∶30)为B相， 采用梯度洗脱方式，即0～20min，8～25％A；20～35min，25～42％A；35～35.1min，42～8％A；35.1～40min，8％A；流速1.0mL/min；柱温40℃；检测波长：263nm；理论板数按葛根素 峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备精密称取葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml分别含葛根素0.09mg、金丝桃苷0.009mg和淫羊藿苷0.09mg 的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取本品，研细，取0.4g，精密称定，置锥形瓶中，精密加 入60％甲醇25ml，称定重量，以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟；放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液 作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量(见表12)。

本发明的原理如下：

葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷都属于黄酮类的化合物与糖结合成的苷；结构式如下：

从分子量大小与羟基多少分析，葛根素水溶性最大，其次是金丝桃苷，而水溶性最小、 分子量最大的是淫羊藿苷，但都能溶于含水醇中。从其紫外光谱图得知，葛根素在约248nm (图5)有最大吸收；金丝桃苷在约254和354nm有两个吸收峰(图6)，254nm处灵敏，且波峰谱带较宽，从250～264nm峰值变化不大；淫羊藿苷在约265nm(图7)有最大吸收。 依据三成分在制剂中的含量高低以及其最大吸收，选择在263nm作为检测波长，目的是平衡 三成分的波峰值，即，使含量低微的金丝桃苷处于较大的波峰面积值，使高含量的葛根素和淫羊藿苷的波峰面积值有所减小。直接以含水甲醇超声提取颗粒中的三种成分，滤过后，进样即可。无萃取、无蒸干、简便、快捷、实用。通过经时地调整A相和B相体积比，使三种 成分在30分钟内出峰完毕。再依据该三种成分的进样量在一定范围内，与其峰面积呈现良好 的线性关系，而用于定量测定。

本发明的创新点及有益效果如下：

(1)以乙腈为A相、甲醇-0.1％磷酸(1∶30)为B相，采用梯度洗脱方式，即0～20min，8～25％A；20～35min，25～42％A；35～35.1min，42～8％A；35.1～40min，8％A；流速1.0mL/min； 柱温40℃；检测波长：263nm；在35分钟内测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷一测多评测 定方法，为首次报道。

(2)淫羊藿药材主含黄酮类，代表性成分有淫羊藿苷、宝藿苷I、金丝桃苷等，中 国药典2015年版一部淫羊藿药材项下，未收载金丝桃苷的含量测定方法，也未查阅到其他文献有关淫羊藿中金丝桃苷含量测定的报道。本申请在11味药材组成的复方制剂中，同时测定 君药淫羊藿中的淫羊藿苷，臣药菟丝子和君药淫羊藿都含有的金丝桃苷以及使药葛根中的葛 根素。方法简便、快捷、易于普及实施，并为药材淫羊藿中的淫羊藿苷和金丝桃苷同时定量 测定，提供了方法与参考数据。

附图说明

图1葛根素的线性关系图

图2金丝桃苷的线性关系图

图3淫羊藿苷的线性关系图

图4葛根素的光谱扫描图

图5金丝桃苷的光谱扫描图

图6淫羊藿苷的光谱扫描图

图7为葛根素、金丝桃苷、淫羊藿苷对照品HPLC色谱图

图8为补肾托毒颗粒HPLC色谱图

图9为缺少葛根的阴性样品HPLC色谱图

图10为缺少淫羊藿和菟丝子的阴性样品HPLC色谱图

图11为缺少淫羊藿的阴性样品HPLC色谱图

图1、图2、图3纵坐标为峰面积；横坐标为进样量(μg)

图4、图5、图6纵坐标为吸收强度(mAU)；横坐标为吸收波长(nm)

图7、图8、图9、图10、图11中，1.葛根素2.金丝桃苷3.淫羊藿苷

本发明具体实施方式

实施例1：

(1)色谱条件与系统适用性试验乙腈为A相、甲醇-0.1％磷酸(1∶30)为B相， 采用梯度洗脱方式，即0～20min，8～25％A；20～35min，25～42％A；35～35.1min，42～8％A；35.1～40min，8％A；流速1.0mL/min；柱温40℃；检测波长：263nm；理论板数按葛根素 峰计算应不低于3000；

(2)对照品溶液的制备精密称取葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1ml分别含葛根素0.09mg、金丝桃苷0.009mg和淫羊藿苷0.09mg 的混合对照品溶液；

(3)供试品溶液的制备取本品，研细，取0.4g，精密称定，置锥形瓶中，精密加 入60％甲醇25ml，称定重量，以功率250W，频率33kHz超声处理10分钟；放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，用0.45μm的微孔滤膜滤过，续滤液 作为供试品溶液；

(4)测定法分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定葛根素、金丝桃苷和淫羊藿苷的含量。

表1葛根素进样量与峰面积

表2金丝桃苷进样量与峰面积

表3淫羊藿苷进样量与峰面积

表5样品中葛根素的回收率试验结果

表6样品中金丝桃苷的回收率试验结果

表7样品中淫羊藿苷的回收率试验结果

表9精密度实验结果(峰面积)

表10稳定性实验结果(峰面积)

表11重复性试验结果(mg/g)

表12补肾托毒颗粒的含量测定结果(mg/g)