一种催化效率提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体

摘要

本发明公开了一种催化效率提高的D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明提供的一种Dorea sp.DPEase的突变体酶A38E/G105A，其最适催化条件没有发生改变，在最适催化条件下，酶催化底物D‑果糖生成D‑阿洛酮糖的相对酶活则提高了38.6％，这一发现对于工业化制备D‑阿洛酮糖具有重要的研究价值。

说明书

技术领域

本发明涉及一种催化效率提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术

近年来我国营养保健品行业发展迅速，增长速度可保持12％至15％，目前已超过日本成为保健品第二大市场。随着我国经济的持续发展，人们的饮食结构也将发生重大变化，逐渐向更安全、更合理、更健康的方向发展。当前，由过度摄入高糖食品导致的慢性病急剧增长，例如肥胖症、糖尿病、高血压和高血脂等。因此，低能量的稀有糖逐渐引起了国际社会的普遍关注。

D-阿洛酮糖是D-果糖的C-3差向异构体，是一种天然的稀有单糖，在自然界中的存在量极少。D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的70％。但能量值却极低，因此是一种理想的甜味剂和蔗糖替代品。此外，D-阿洛酮糖还有独特的生理功能和潜在的保健功能，受到了广泛的关注，包括减少脂肪堆积、降低餐后血糖水平、抑制肝脂肪酶活性、清除活性氧簇、治疗动脉粥样硬化疾病、增强胰岛素抗性和保护神经等。D-阿洛酮糖的吸收率远低于其他甜味剂，特别是D-葡萄糖。此外，通过竞争吸收和排泄转运糖蛋白，D-阿洛酮糖还可以抑制D-果糖和D-葡萄糖的吸收。通过竞争性抑制，D-阿洛酮糖可以减少D-果糖和D-葡萄糖的摄入量，进而增强胰岛素抵抗性，减少体内脂肪积累和降低潜在的糖尿病风险等作用。D-阿洛酮糖还具有其他一些生理功能：通过抑制促炎细胞因子活性，起到抗炎作用；提高细胞内谷胱甘肽水平，达到神经保护作用。

在D-阿洛酮糖的生物转化中，酮糖3-差向异构酶起着不可或缺的作用。近年来，研究学者多关注酮糖3-差向异构酶的催化过程调控及稀有糖生物转化。基于基因工程和蛋白质工程的分子改造技术已广泛应用于L-阿拉伯糖异构酶和D-葡萄糖异构酶的研究当中，并已经获得了一些性能优良的突变体。然而，关于酮糖3-差向异构酶的分子改造的研究还很少。

发明内容

本发明的目的是为了获得更适合的生物催化剂。本发明通过定点突变的办法，对来自微生物Dorea sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行分子改造，以进一步提高其催化活性以得到更适合于工业应用的D-阿洛酮糖3-差向异构酶，对D-阿洛酮糖的合成具有重要的现实意义。

本发明首先提供了一种催化效率提高的D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶A38E/G105A，是将来源于微生物Dorea sp.的D-阿洛酮糖3-差向异构酶进行突变得到的单突变体酶；即将原来Dorea sp.DPEase酶中的A38位的丙氨酸Ala替换成谷氨酸Glu，G105位的甘氨酸Gly替换为丙氨酸Ala，获得双点突变体酶，命名为A38E/G105A。

与野生酶Dorea sp.DPEase相比，所述Dorea sp.DPEase的突变体酶A38E/G105A的最适催化条件没有发生改变，但在最适催化条件下，酶催化底物D-果糖生成D-阿洛酮糖的相对酶活则提高了38.6％。因此，突变体酶A38E/G105A对于工业化制备D-阿洛酮糖具有重要的价值。

编码所述野生酶Dorea sp.DPEase基因在GenBank的编号为CDD46341.1，基因全长870个核苷酸，见序列表中SEQ ID No:1，编码289个氨基酸，见序列表中SEQ ID No:2。

编码所述D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶A38E/G105A的基因序列见序列表中SEQ ID No:3，A38E/G105A的氨基酸序列见SEQ ID No:4。

本发明还提供一种携带编码所述突变体酶A38E/G105A的基因的重组表达质粒pET-22b(+)-A38E/G105A。

本发明还提供一种表达所述突变体酶A38E/G105A的重组大肠杆菌BL21(DE3)，含有转化入的重组表达质粒pET-22b(+)-A38E/G105A。

本发明还提供D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶A38E/G105A的制备方法，其具体步骤为：

(1)在Dorea sp.DPEase酶模拟结构的基础上确定突变位点；

(2)以重组质粒pET22b-dore-dpe为模板，设计正向和反向引物，使用两步法对Dorea sp.DPEase进行定点突变。

突变引物如下所示，下划线为突变点：

A38E-F：5’-GAAATCGGTGCTGAACCATTACCGG-3’

G105A-F：5’-CCATTTGATCGCCGGCGCTCTCTATG-3’

dore-R：5’-GGTGTGTTTCCAATCCAACATATATTTC-3’

(3)将构建成功的突变体质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；

(4)离心菌体，重悬后超声破碎，镍离子亲和层析纯化得到突变体酶A38E/G105A。

本发明提供的突变体酶A38E/G105A的应用：应用于化学、食品和制药领域，催化效率发生显著提升，为进一步工业应用D-阿洛酮糖3-差向异构酶Dorea sp.DPEase提供了有利保障。

本发明的有益效果：本发明提供的一种Dorea sp.DPEase的突变体酶A38E/G105A，其最适催化条件没有发生改变，在最适催化条件下，酶催化底物D-果糖生成D-阿洛酮糖的相对酶活则提高了38.6％，这一发现对于工业化制备D-阿洛酮糖具有重要的研究价值。

具体实施方式

D-阿洛酮糖3-差向异构酶活测定方法：

以50g/L的D-果糖为底物，加入0.3μmol/L的纯酶，1mmol/L CoCl₂，在70℃，pH>

酶活定义(U)：标准反应条件下，单位时间(min)催化合成1μmol D-阿洛酮糖所需的酶量。

实施例1:Dorea sp.DPEase酶突变体制备方法

重组质粒pET22b-dore-dpe构建：根据Dorea sp.CAG:317(登录号：CBGJ010000047.1)，合成其D-阿洛酮糖3-差向异构酶基因片段BN605_00564，并连接至pET-22b(+)的酶切位点Nde I和Xho I之间，获得重组质粒pET22b-dore-dpe。

pET-22b(+)-A38E/G105A突变质粒的构建：以pET22b-dore-dpe质粒为模板，经PCR，引入A38E/G105A定点突变，测序验证结果表明除了所需突变位点外，没有出现随机突变，因此突变质粒pET-A38E/G105A构建成功。

突变引物如下所示：(下划线为突变点)

A38E-F：5’-GAAATCGGTGCTGAACCATTACCGG-3’

G105A-F：5’-CCATTTGATCGCCGGCGCTCTCTATG-3’

dore-R：5’-GGTGTGTTTCCAATCCAACATATATTTC-3’

Short PCR反应过程：95℃预变性2min；95℃解链20s，55℃退火10s，70℃延伸45s，共30个循环；70℃延伸5min；20℃保温。Short PCR反应体系参照表。

表1Short PCR反应体系(10μL)

Short PCR反应结束后，取2μL的short PCR产物进行核酸凝胶检测。确认shortPCR成功后，以short PCR为megaprimer进行long PCR。Long PCR反应过程如下：95℃预变性2min；95℃解链20s，55℃退火10s，70℃延伸3min，共30个循环；70℃延伸5min；20℃保温。Long PCR反应体系参照表。

表2Long PCR反应体系(50μL)

Long PCR反应结束后，取2μL的long PCR产物进行核酸凝胶检测。确认long PCR成功后，加入2μL Dpn I、6μLNEB cut-smart buffer和2μL水，进行Dpn I酶切反应，37℃保温2h。酶切反应结束后，使用PCR快速纯化试剂盒进行产物纯化。最后将5μL纯化后的PCR产物转化至E.coli DH5α感受态细胞。然后挑取阳性克隆子进行质粒抽提和DNA测序。将测序成功的突变体质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，构建突变体基因重组菌，用于突变体酶的诱导表达。

实施例2:Dorea sp.DPEase的突变体酶的表达纯化方法。

将测序验证后的突变质粒pET-22b(+)-A38E/G105A转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，挑取阳性转化子在LB培养基中37℃、200rpm摇培过夜，后接入LB培养基37℃培养3-4h至OD值为0.6～0.8，降温至30℃，加入IPTG终浓度为0.6mM诱导6h。

发酵液于4℃、l0000rpm离心20min，取菌体。加入20mL缓冲液(50mM PBS，200mMNaCl，调节pH至6.0)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间l s，停止时间2s，共计18min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、10000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用低盐浓度的缓冲液(500mmol/LNaCl，50mM PBS调节pH至6.0)平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液pH值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用含有低浓度咪唑的缓冲液(500mmol/LNaCl，50mmol/L咪唑，50mM PBS调节pH至6.0)冲洗杂蛋白至基线平衡，再用含有高浓度咪唑的洗脱液(500mmol/L NaCl，500mmol/L咪唑，50mM PBS调节pH至6.0)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得目的蛋白。纯化后D-阿洛酮糖3-差向异构酶的突变体酶A38E/G105A达到电泳纯。

实施例3：Dorea sp.DPEase的突变体酶的催化效率测定。

本发明参照D-阿洛酮糖3-差向异构酶活测定方法，将突变体纯酶在标准反条件下进行催化反应，使用HPLC检测D-阿洛酮糖的合成量，计算突变体酶活。将野生型Doreasp.DPEase的酶活定义为相对酶活100％。发现，突变体A38E/G105A比酶活为1113.7U/mg，相较于原始酶比酶活803.5U/mg，相对酶活则提高了38.6％。

表3最适反应条件下野生酶和突变体酶的相对酶活比较

实施例4：突变前后酶的最适pH比较

本发明研究pH对突变体酶催化活性的影响，分别在70℃不同的pH缓冲液(pH 6.0-7.0)中进行酶反应。当Dorea sp.DPEase野生型酶突变为双点突变体A38E/G105A后，最适pH仍为6.0，与野生型酶最适pH相比并没有发生变化。在pH 5.5-7.0的弱酸性范围内，突变体酶的催化活性较高，相对酶活高于80％。比较突变体酶的pH稳定性，可以发现突变体酶的pH稳定性与原始酶相一致，没有发生十分明显的变化。

实施例5：突变前后酶的最适温度比较

本发明研究温度对突变体酶催化活性的影响，分别在pH 6.0不同温度(40-80℃)下进行酶反应。突变体A38E/G105A的最适温度仍为70℃，与野生型酶相比并没有发生变化。然而与Dorea sp.DPEase野生型酶相比，A38E/G105A突变体对温度的变化更加敏感，相同温度下突变体酶的相对酶活普遍要低于野生型酶的相对酶活。

实施例6：突变前后酶的热稳定性比较

本发明研究突变体A38E/G105A的热稳定性和结构稳定性，突变体A38E/G105A的催化效率在一定程度上得到提高，但与野生型酶相比其热稳定与结构稳定性有一定的下降。50℃时，A38E/G105A的半衰期(t_1/2)由野生型酶的3.20h下降到2.42h；60℃时t_1/2值由野生型酶的0.6h下降到0.35h；Tm值也由野生型酶的56.64℃下降到55.41℃。

表4野生酶和突变体酶的t_1/2和T_m值比较

表5野生酶和突变体酶的反应动力学常数

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种催化效率提高的D-阿洛酮糖 3-差向异构酶突变体

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 870

<212> DNA

<213> Dorea sp.

<400> 1

atgaaacacg gaatttacta tgcctattgg gaaaaagaat gggctgcgga ctacttgtat 60

tatgttgaaa aagtcgcacg tttaggcttt gatcttctgg aaatcggtgc tgcaccatta 120

ccggaatata gcacagatca gattaaagca ctccgcgatt gtgcctctca gaacggaatt 180

cagttgactg ccggatatgg tcctacttac gaccataaca tgggctcttc agatgcgggt 240

attcgcgccg gtgcattaga atggtacaaa cgtctctttg atgttatgga acagcttgat 300

atccatttga tcggcggcgc tctctatgga tattggccgg tagactttag caacatcaac 360

aaagaagagg attggaagcg aagcgttgaa ggaatgcatc ttcttgctcc tatcgccaaa 420

gaacatgata tcaatctcgg aatggaagta ctgaaccgct ttgaatccca cattttaaat 480

actgccgaag aaggtgttgc cttcgtaaaa gaggtcggac aggaaaatgt gaaagtaatg 540

ttagacacct tccatatgaa catcgaggag gaaagtatcg gtgatgcaat ccgcactgcc 600

ggcaatcttc tcggtcactt ccacaccggt gaatgtaacc gtatggttcc gggaaaagga 660

cgcacccctt ggagagagat cggaaatgct ctccgcgata ttgaatacga tggaactgtt 720

gtcatggaac catttgtcag catgggcggt caggttggtc gagatattca tatctggcgc 780

gacatcagcc gcggtgcatc tgaagcagaa ttagataaag acgcgaaaaa tgcagttgca 840

ttccagaaat atatgttgga ttggaaataa 870

<210> 2

<211> 289

<212> PRT

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1 5 1015

Asp Tyr Leu Tyr Tyr Val Glu Lys Val Ala Arg Leu Gly Phe Asp Leu

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Leu Glu Ile Gly Ala Ala Pro Leu Pro Glu Tyr Ser Thr Asp Gln Ile

354045

Lys Ala Leu Arg Asp Cys Ala Ser Gln Asn Gly Ile Gln Leu Thr Ala

505560

Gly Tyr Gly Pro Thr Tyr Asp His Asn Met Gly Ser Ser Asp Ala Gly

65707580

Ile Arg Ala Gly Ala Leu Glu Trp Tyr Lys Arg Leu Phe Asp Val Met

859095

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100 105 110

Pro Val Asp Phe Ser Asn Ile Asn Lys Glu Glu Asp Trp Lys Arg Ser

115 120 125

Val Glu Gly Met His Leu Leu Ala Pro Ile Ala Lys Glu His Asp Ile

130 135 140

Asn Leu Gly Met Glu Val Leu Asn Arg Phe Glu Ser His Ile Leu Asn

145 150 155 160

Thr Ala Glu Glu Gly Val Ala Phe Val Lys Glu Val Gly Gln Glu Asn

165 170 175

Val Lys Val Met Leu Asp Thr Phe His Met Asn Ile Glu Glu Glu Ser

180 185 190

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Val Met Glu Pro Phe Val Ser Met Gly Gly Gln Val Gly Arg Asp Ile

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