D-阿洛酮糖3-差向异构酶的表达及其固定化转化D-阿洛酮糖的研究

摘要

D-阿洛酮糖是一种新型低热量的功能性因子，D-果糖的差向异构体，在自然界存在极少，可以应用于食品、医药和保健等领域。D-阿洛酮糖3-差向异构酶(D-psicose3-epimerase，缩写为DPE)是一种可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖进行可逆反应的胞内异构化酶。鉴于D-阿洛酮糖多应用于食品领域，本文选用食品级微生物枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)作为表达宿主。本文构建了高效表达来源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因(CCDPE)以及来源于Ruminococcussp.的DPE基因(RDPE)的重组枯草芽孢杆菌工程菌株。研究了CCDPE在重组枯草芽孢杆菌中的表达与纯化、酶学性质、酶的固定化以及与两种重组酶的理化性质比较等方面的内容。
　　来源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因片段大小约为882bp，蛋白分子量约为33kDa。用LB-Kana培养基（Kana含量50μg/mL）在37℃、200rpm条件下培养重组菌株，收获菌体后经超声波细胞破碎仪破碎、离心收集上清液，用Ni-NTA亲和层析柱和Source15Q阴离子交换柱提纯目的蛋白。SDS-PAGE结果表明，目的蛋白为可溶性表达，条带特异性强，纯化效果较为理想，纯度可以达到90％以上。纯化的CCDPE酶酶学性质研究表明，其最适温度50℃、最适pH8.0，其活性不依赖金属离子，但Co2+对其有强烈的促进作用，酶促动力学反应结果表明，该酶对D-阿洛酮糖具有较高的底物特异性。
　　本文还采用了不同载体材料和固定方法对CCDPE粗酶固定化工艺影响的研究，综合得出，以壳聚糖为载体固定CCDPE粗酶效果比较好，在对固定化工艺条件优化后得出当固定时间为3h，[酶]∶[载体]=15∶1(U/g)时酶活回收率最高为45％。另外，本文也采用此固定化方法对枯草芽孢杆菌中表达的Ruminococcussp.的DPE粗酶进行固定化研究。对CCDPE自由酶、CCDPE固定化酶、RDPE自由酶和RDPE固定化酶的最适pH、最适温度以及金属离子等酶学性质进行比较，结果表明，对CCDPE而言，其固定化酶的最适温度(55℃)和pH(8.5)都高于自由酶(50℃、8.0);对RDPE而言，其固定化酶的最适温度较自由酶相比没有明显改变，均为60℃，但其固定化酶的pH(9.0)高于自由酶(8.0);Ni2+、Cu2+和Zn2+均对CCDPE自由酶与固定化酶以及RDPE自由酶与固定化酶酶活性有抑制作用，Co2+和Mn2+对CCDPE自由酶酶活性有强烈的促进作用，Mn2+和Fe3+还对RDPE自由酶酶活性有强烈的促进作用。
　　将CCDPE固定化装入填充床反应器进行连续转化反应，并研究流速对反应产率和转化率影响。在最佳流速为2.5mL/min时，转化率为19％，相关产率为6.7g/L·h。当固定化酶连续反应168h，转化率能保持在13％以上。

目录

声明

摘要

1 前言

1．1 食品级微生物

1．1．1 食品级微生物的简介与应用

1．1．2 枯草芽孢杆菌及其表达系统

1．2 功能性稀少糖

1．3 D-阿洛酮糖的介绍

1．3．1 D-阿洛酮糖的结构来源与理化性质

1．3．2 D-阿洛酮糖的功能

1．3．3 D-阿洛酮糖的生产方法

1．4 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶

1．4．1 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的微生物来源

1．4．2 微生物来源 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的性质

1．4．3 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶的固定化

1．5 本课题立题背景及研究意义

1．5．1 构建含DPE基因载体的食品级重组枯草芽孢杆菌研究价值

1．5．2 D-阿洛酮糖研究方面意义

1．6 论文研究的主要内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌种及载体

2．1．2 化学试剂

2．1．2 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 培养基的选择及制备

2．2．2 D-阿洛酮糖 3-差向异构酶酶活检测

2．2．3 C．cellulolyticum H10 DPE与Ruminococcus sp．DPE基因序列扩增

2．2．4 C．cellulolyticum H10 DPE与Ruminococcus sp．DPE基因表达质粒的构建

2．2．5 C．cellulolyticum H10 DPE基因在B．subtilis WB600中的表达

2．2．6 C．cellulolyticum H10 DPE的纯化

2．2．7 C．cellulolyticum H10 DPE酶学性质研究

2．2．8 C．cellulolyticum H10 DPE的固定化工艺研究

2．2．9 C．cellulolyticum H10 DPE固定化酶与Ruminococcus sp．DPE固定化酶之间理化性质对比

3 结果与讨论

3．1 CCDPE基因的克隆

3．1．1 CCDPE基因的扩增

3．1．2 CCDPE的C端含有组氨酸标签的重组质粒的构建

3．2 CCDPE基因在重组B．subtilis中的表达

3．3 CCDPE蛋白的纯化

3．4 CCDPE的酶学性质

3．4．1 温度对酶反应的影响

3．4．2 pH值对酶反应的影响

3．4．3 金属离子对酶反应的影响

3．4．4 底物特异性研究

3．4．5 酶反应动力学研究

3．5 CCDPEase固定化工艺研究

3．5．1 不同固定化方法对酶活回收率的影响

3．5．2 固定化工艺条件的优化

3．5．3 CCDPE固定化酶理化性质

3．6 Ruminococcus sp．DPE基因的克隆表达

3．6．1 Ruminococcus sp．DPE基因的扩增

3．6．2 含RDPE基因的重组质粒的构建(不含组氨酸标签)

3．6．3 RDPE基因在重组B．subtilis 168中的表达以及与含CCDPE基因的在重组B．subtilis WB600的表达的情况之间的对比

3．7 RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶理化性质之间的比较

3．7．1 温度对RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶酶活的影响

3．7．2 pH对RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶酶活的影响

3．7．3 金属离子对RDPE固定化酶与CCDPE固定化酶酶活的影响

3．7．4 RDPE固定化酶的热稳定性

4 结论

5 展望

参考文献

7 攻读硕士学位期间发表论文情况

致谢