一种利用超高效液相色谱法测定2-氯烟酰胺含量的方法

摘要

本发明涉及化学分析检测领域，具体涉及一种利用超高效液相色谱法测定2‑氯烟酰胺含量的方法，采用超高效液相色谱仪，紫外可见吸收检测器，以小粒径C18色谱柱为分离柱，甲醇和水为流动相，以2‑氯烟酰胺为标准样品，采用外标法绘制2‑氯烟酰胺浓度‑峰面积标准曲线，得线性回归方程，通过该回归方程计算得到2‑氯烟酰胺的含量，本发明能够实现对烟嘧磺隆中间体2‑氯烟酰胺的有效分离检测，分析时间极短，方法简单易行，方便可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种利用超高效液相色谱法测定2-氯烟酰胺含量的方法。

背景技术

烟嘧磺隆是一种玉米田磺酰脲类除草剂，具有环境相容性好、高效、低毒等优点，其化学名称为1-(4,6-二甲氧基嘧啶-2-基)-3-(3-二甲基氨基甲磺吡啶-2-基磺酰)脲。2-氯烟酰胺是烟嘧磺隆合成过程中重要的中间体，选用最佳的检测手段迅速分析其准确含量，对于生产的持续进行有着非常重要的意义。

目前，高效液相色谱法在药物及其中间体检测方面应用越来越多，烟嘧磺隆原药多采用高效液相色谱法进行定量分析，但其中间体2-氯烟酰胺的定量分析方法的报道鲜有，而在实际生产过程中，对烟嘧磺隆中间体2-氯烟酰胺的监测有着重要的指导意义。农药生产过程多为持续过程，因此对中间体的监测必须准确、及时、高效，超高效液相色谱仪对比普通液相色谱仪，虽然分离原理基本相同，但其基于减小颗粒度技术，比普通HPLC具有更高的分离能力，可以同时解决农药生产过程中检测速度和分离度不兼容的难题，其检测样品具有柱效高、分离时间短、分离度大、灵敏度高等优点。

因此如何结合超高效液相色谱法的优势，对2-氯烟酰胺进行定量分析成为亟待解决的问题之一。

发明内容

本发明提供了一种利用超高效液相色谱法测定2-氯烟酰胺含量的方法，采用超高效液相色谱仪，紫外可见吸收检测器，以小粒径C18色谱柱为分离柱，甲醇和水为流动相，以2-氯烟酰胺为标准样品，采用外标法绘制2-氯烟酰胺浓度-峰面积标准曲线，得线性回归方程，通过该回归方程计算得到2-氯烟酰胺的含量，本发明能够实现对烟嘧磺隆中间体2-氯烟酰胺的有效分离检测，分析时间极短，方法简单易行，方便可靠，为企业生产过程中所需把控的质量控制与质检机构质量检测提供参考依据。

本发明的发明人经多次试验得到2-氯烟酰胺的合适保留时间和有效分析参数，本方法不限于烟嘧磺隆工艺中2-氯烟酰胺的测定，凡是含有本发明中所述的2-氯烟酰胺样品均可以采用本方法进行定量测试。按照本方法进行检测2-氯烟酰胺含量精密度高，准确度高，重复性好，稳定性好，分析时间极短，柱效高、分离度大、灵敏度高，方法简单易行，方便可靠，能够实现对样品的直接定量，无需对样品进行复杂的前处理。

本发明所采用的具体技术方案如下：

一种利用UPLC色谱法测定烟嘧磺隆中间体2-氯烟酰胺含量的方法，具体步骤如下：

(1)配制2-氯烟酰胺标准溶液：分别准确称取2-氯烟酰胺标准样品15mg、25mg、35mg、45mg、55mg(精确至0.0002g)于100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到标准溶液I、II、III、IV、V，其浓度分别为150.0mg/L、250.0mg/L、350.0mg/L、450.0mg/L、550.0mg/L；

其中所采用的2-氯烟酰胺标准品：纯度为99％，购自上海迈瑞尔化学技术有限公司；甲醇：购自默克股份两合公司；水为去离子水，甲醇水混合溶液组成，按体积百分比：甲醇15-25％，水75-85％；

(3)配制2-氯烟酰胺样品溶液：根据样品中2-氯烟酰胺的大致含量范围，精确称取适量样品(精确至0.0002g)于100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到2-氯烟酰胺样品溶液，确保测定时2-氯烟酰胺浓度在150-550mg/L之间；

(3)超高效液相色谱仪分析：超高效液相色谱仪分析：首先将2-氯烟酰胺标准溶液I、II、III、IV、V摇匀，按照设定好的色谱条件对其进行分析，并记录相应的峰面积，以2-氯烟酰胺标样的质量浓度为横坐标，与其对应的峰面积为纵坐标，作图得到相应的线性关系曲线和线性回归方程；然后对2-氯烟酰胺样品进行分析，记录样品中2-氯烟酰胺对应的峰面积，将峰面积带入线性回归方程，得到样品中2-氯烟酰胺的含量；

样品中2-氯烟酰胺的质量百分数计算公式如下：W％＝(C₁+C₂)V/2m；

式中：C₁为样品第一次进样计算浓度，mg/L；C₂为样品第二次进样计算浓度，mg/L；V为样品溶液体积，L；m为样品质量，mg；

检测条件为：流动相为甲醇水混合溶液，经0.22um孔径的滤膜过滤，并超声脱气15min；流速为0.2-0.4mL/min；

其中色谱柱为粒径小于3um的小粒径C18硅胶柱；柱温为30-40℃；检测波长为266nm；进样量为5uL；

在这样的色谱条件下对2-氯烟酰胺进行检测，柱效高、分离度大、灵敏度高，方法简单易行，方便可靠，可直接定量分析，无需复杂的前处理。

本发明与以往涉及药物中间体检测手段不同，本发明采用超高效液相(UPLC)，对比普通高效液相(HPLC)，有以下优点：(1)灵敏度高，可更好的监控药物生产过程中可能产生的杂质；(2)因其灵敏度高，检测过程中所需2-氯烟酰胺标样及样品称样量降低3倍以上，可节约成本，减少生产过程中的取样影响；(3)UPLC比普通液相管径细约1倍，所使用色谱柱粒径比常规5um粒径色谱柱小约2-3倍，因此UPLC检测样品分离度更高，保留时间更短，这对中间体的监测必须准确、及时、高效有重要意义；(4)UPLC流速只需0.1-0.5mL/min，本发明在0.2-0.4mL/min范围内均满足检测要求，HPLC流速通常在1.0-2.0mL/min范围，同时UPLC分析时间又短，因此使用UPLC可节约溶剂的使用量，降低成本；本发明流动相体积比例甲醇15-25％，水75-85％，流动相大部分为水，既降低检测成本，又减小有机溶剂对环境及人体的危害；

本发明的待测对象为2-氯烟酰胺，现有技术中没有相关的检测技术存在，本发明填补了现有技术中的技术空白，二是2-氯烟酰胺为烟嘧磺隆中间体，采用UPLC检测，比HPLC节约2-3倍的检测时间，能更好的适用于农药原药中间产品的质量控制，为后续步骤提供刚好的参考，保证装置持续稳定进行。

本发明选用266nm作为2-氯烟酰胺的最佳吸收波长原因在于：对样品进行全波长扫描分析，并经过多次波长调整对比，发现2-氯烟酰胺在266nm波长下，杂质吸收较小，主峰吸收较大，且主峰与溶剂峰、杂质峰分离效果较好。

本发明采用小于3um的小粒径C18硅胶柱为色谱柱，与其他大粒径(≥5um)色谱柱如HILIC、ZORBAX SB-C18、Inertsil ODS-SP、Extend-C18、ZORBAX ODS、LiChrosorb C18、Hypersil ODS、Hypersil BDS、SHIMADZU VP-ODS等相比，小粒径C18柱颗粒度减小到3.0um以下，比5um颗粒度柱的柱效提高了3倍，分离度提高了70％，能够实现分离效果好与检测时间短两重效果，且小的粒径，使色谱峰变得更窄，信噪比增大，灵敏度提高。将柱温定为30-40℃，降低溶剂及流动相的粘度，减少柱残留，提高样品的重现性。

本发明中选用甲醇、水溶液作为流动相，与乙腈有机流动相相比，甲醇作为有机相时，对样品选择性更好。经多次实验对比，确定上述体积比的甲醇水混合溶液做流动相，在流速为0.2-0.4mL/min条件下，样品保留时间适中，峰型尖锐，在分析时间短条件下还能实现主要成分与杂质的有效分离。本发明选择外标法便于操作，且计算简单。

本发明限定测定时2-氯烟酰胺浓度在150-550mg/L之间；主要原因在于这样可以使样品响应值在90000-400000微伏范围内，以保证结果更精准，避免称量误差及样品超载造成的影响。

与其他分析手段相比，本发明不限于烟嘧磺隆工艺中2-氯烟酰胺的测定，凡是含有本发明中所述的2-氯烟酰胺样品均可以采用本方法进行定量测试，采用超高效液相色谱仪，相比于HPLC技术，UPLC基于减小颗粒度技术，大幅度地改善了液相色谱的分离度、样品通量和灵敏度，可以同时解决农药持续生产过程中检测速度和分离度矛盾的难题，具有柱效高、分离时间短、分离度大、灵敏度高等优点，且检测过程中溶剂使用量少，降低消耗；该方法能够实现对样品的直接检测，无需对样品进行复杂的前处理，降低了大量的人力物力。

附图说明

图1为2-氯烟酰胺标准曲线；

图2为2-氯烟酰胺标准溶液液相色谱图；

图3为实施例1中试液样品的液相色谱图；

图4为实施例2中试液样品的液相色谱图；

图5为实施例3中试液样品的液相色谱图；

图中横坐标代表保留时间，纵坐标代表电压值。

具体实施方式

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围，除特殊说明外，下述实施例中均采用常规现有技术完成。

以下实施例中试剂来源均为：

2-氯烟酰胺标准品：纯度为99％，上海迈瑞尔化学技术有限公司；

进口甲醇：默克股份两合公司；

屈臣氏水：广州屈臣氏食品饮料有限公司。

实施例1

现有一批未知浓度的2-氯烟酰胺样品，大约含量95％，需要对其进行测定，采用超高效液相色谱仪进行检测、外标法定量分析，具体步骤包括：

(1)配制2-氯烟酰胺标准溶液：分别准确称取2-氯烟酰胺标准样品15mg、25mg、35mg、45mg、55mg(精确至0.0002g)于100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到标准溶液I、II、III、IV、V，其浓度分别为150.0mg/L、250.0mg/L、350.0mg/L、450.0mg/L、550.0mg/L；

(2)配制2-氯烟酰胺样品溶液：分别精确称取2-氯烟酰胺样品35mg(精确至0.0002g)3份于3个100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到2-氯烟酰胺样品溶液；

(3)超高效液相色谱仪分析：首先将2-氯烟酰胺标准溶液I、II、III、IV、V摇匀，按照设定好的色谱条件对其进行分析，并记录其相应的峰面积，采用外标法绘制目标物质的浓度-峰面积标准曲线，得到线性回归方程；然后对2-氯烟酰胺样品进行分析，分别记录3份样品中2-氯烟酰胺对应的峰面积，根据标准曲线回归方程计算其相应的含量，再通过公式计算即得2-氯烟酰胺的质量分数，取三次测定结果平均值(如图3所示)，得到最终结果：2-氯烟酰胺含量为：95.27％；该步骤的分析条件为：流动相为甲醇水混合溶液，经0.22um孔径的滤膜过滤，并超声脱气15min；流速为0.2-0.4mL/min；色谱柱为粒径小于3um的小粒径C18硅胶柱；柱温为30-40℃；检测波长为266nm；进样量为5uL。

实施例2

现有一批未知浓度的2-氯烟酰胺样品，大约含量95％，需要对其进行测定，采用超高效液相色谱仪进行检测、外标法定量分析，具体步骤包括：

(1)配制2-氯烟酰胺标准溶液：分别准确称取2-氯烟酰胺标准样品15mg、25mg、35mg、45mg、55mg(精确至0.0002g)于100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到标准溶液I、II、III、IV、V，其浓度分别为150.0mg/L、250.0mg/L、350.0mg/L、450.0mg/L、550.0mg/L；

(2)配制2-氯烟酰胺样品溶液：分别精确称取2-氯烟酰胺样品35mg(精确至0.0002g)3份于3个100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到2-氯烟酰胺样品溶液；

(3)超高效液相色谱仪分析：首先将2-氯烟酰胺标准溶液I、II、III、IV、V摇匀，按照设定好的色谱条件对其进行分析，并记录其相应的峰面积，采用外标法绘制目标物质的浓度-峰面积标准曲线，得到线性回归方程；然后对2-氯烟酰胺样品进行分析，分别记录3份样品中2-氯烟酰胺对应的峰面积，根据标准曲线回归方程计算其相应的含量，再通过公式计算即得2-氯烟酰胺的质量分数，取三次测定结果平均值(如图4所示)，得到最终结果：2-氯烟酰胺含量为：94.70％；该步骤的分析条件为：流动相为甲醇水混合溶液，经0.22um孔径的滤膜过滤，并超声脱气15min；流速为0.2-0.4mL/min；色谱柱为粒径小于3um的小粒径C18硅胶柱；柱温为30-40℃；检测波长为266nm；进样量为5uL。

实施例3

现有一批未知浓度的2-氯烟酰胺样品，大约含量95％，需要对其进行测定，采用超高效液相色谱仪进行检测、外标法定量分析，具体步骤包括：

(1)配制2-氯烟酰胺标准溶液：分别准确称取2-氯烟酰胺标准样品15mg、25mg、35mg、45mg、55mg(精确至0.0002g)于100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到标准溶液I、II、III、IV、V，其浓度分别为150.0mg/L、250.0mg/L、350.0mg/L、450.0mg/L、550.0mg/L；

(2)配制2-氯烟酰胺样品溶液：分别精确称取2-氯烟酰胺样品35mg(精确至0.0002g)3份于3个100mL容量瓶中，用甲醇水混合溶液超声溶解10min，待冷却至室温后，定容至刻度，得到2-氯烟酰胺样品溶液；

(3)超高效液相色谱仪分析：首先将2-氯烟酰胺标准溶液I、II、III、IV、V摇匀，按照设定好的色谱条件对其进行分析，并记录其相应的峰面积，采用外标法绘制目标物质的浓度-峰面积标准曲线，得到线性回归方程；然后对2-氯烟酰胺样品进行分析，分别记录3份样品中2-氯烟酰胺对应的峰面积，根据标准曲线回归方程计算其相应的含量，再通过公式计算即得2-氯烟酰胺的质量分数，取三次测定结果平均值(如图5所示)，得到最终结果：2-氯烟酰胺含量为：96.03％；该步骤的分析条件为：流动相为甲醇水混合溶液，经0.22um孔径的滤膜过滤，并超声脱气15min；流速为0.2-0.4mL/min；色谱柱为粒径小于3um的小粒径C18硅胶柱；柱温为30-40℃；检测波长为266nm；进样量为5uL。

试验例

1、精密度实验

取实施例1中试液为考察对象，混合均匀后按照设定好的色谱检测方法，利用高效液相色谱仪上的50μL定量环精确连续进样7次，分别记录其相应的峰面积，计算其相对标准偏差RSD，得RSD小于0.5％，表明本发明所述的检测方法精密度良好。

表1精密度实验结果

2、重复性实验

以实施例2中样品为考察对象，取同一批样品适量，重复制备7份样品溶液，按照设定好的色谱检测方法，利用高效液相色谱仪上的50μL定量环分别精确进样测试，并同时记录各自对应的峰面积，计算其相对标准偏差RSD，结果显示RSD小于0.5％，表明本发明所述检测方法的重复性良好。

表2重现性实验结果

3、稳定性实验

取实施例3中试液为考察对象，于6℃放置，按照设定好的色谱检测方法，分别于0h，2h，6h，12h，24h，48h，72h取样测试，并分别记录其相对应的峰面积，计算其相对标准偏差RSD，结果显示RSD小于0.5％，表明样品溶液的稳定性良好，因此本发明所述样品检测方法的稳定性高。

表3稳定性实验结果

4、加标回收实验

准确称取已知浓度的2-氯烟酰胺样品25mg(准确至0.0002g)5份，于5个100mL容量瓶中，每份样品中添加已知量的2-氯烟酰胺标样，甲醇水混合溶液超声溶解并定容至刻度，标记为试液1、2、3、4、5，摇匀后利用超高效液相色谱仪上的50μL定量环精确进样分析，并分别记录行对应的峰面积，计算其加标回收率，其结果为2-氯烟酰胺的平均回收率为99.4％。

表4加标回收率

由表4可以看出，目标物回收率测量值均在95％-105％之间，满足日常分析检测要求，表明可以用超高效液相色谱法作为2-氯烟酰胺含量测定的分析方法。

通过以上精密度、稳定性、重复性及加标回收试验可以看出，本发明所述的利用超高效液相色谱法检测烟嘧磺隆中间体2-氯烟酰胺含量的方法是方便可行的，该方法精密度高、重复性好、稳定性好，准确度高、且检测时间极短、分离度高、灵敏度高，能够实现对样品的直接检测，无需对样品进行特殊前处理，溶剂消耗少，后续处理简单，可以实现农药中间体的快速准确分析。