基于脂溶性量子点的微藻含油量快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于脂溶性量子点的微藻含油量快速检测方法，包括藻的培养使用、吸光度与藻细胞密度的线性关系的确定、二甲基亚砜与量子点荧光的测定、含有二甲基亚砜与量子点的藻液荧光测定、最佳量子点浓度的测定、最佳藻液密度的测定、优势藻种的筛选、最佳藻液密度的确定、最佳产油藻种的确定等步骤。方法可精准、简便、迅速筛选出优势产油藻种及其培养条件，为后续工业化生产奠定了工艺基础。

说明书

技术领域

本发明涉及一种微藻含油量快速检测方法。

背景技术

脂含量高、单位体积生长量高、生长繁殖迅速、易大量培养、占地小等众多得天独厚的优势使得微藻迅速被锁定为第二代生物柴油的制造者。科研过程中往往会改变培养条件驯化微藻以达到生长速度与总脂含量的共同增长。在批量化生产前筛选出产油量高的藻种将会创造极大的商业价值。因此精准、简便、迅速的总脂含量检测方法势必成为全球能源市场的需求。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便、效果好的基于脂溶性量子点的微藻含油量快速检测方法。

本发明的技术解决方案是：

一种基于脂溶性量子点的微藻含油量快速检测方法，其特征是：包括下列步骤：

（1）藻的培养使用：将小球藻利用BG11培养基扩大培养后，又按三种不同条件分类培养藻种，各培养条件如下：A培养于光照培养箱中，光照时间是14h/d，光暗比7：5，光照强度是10000lx，恒温25℃，用BG11液体培养基培养；B处于摇床中，摇床转速是1500r/min，光照时间为12h/d，光暗比是1:1，光照强度为6000lx，有光照时温度为25℃，无光照时为室温，用80%体积分数的BG11培养基和20%体积分数的水混合培养；C培养于普通室内环境，通过BG11培养基提供营养，由碘钨灯提供光源和热源，光照时间为24h/d，温度控制在28—32℃范围内；

使用藻液时取对数生长末期藻液，用离心机3500转/分钟离心8分钟后弃上清液，加入PBS缓冲液重悬，3500转/分钟离心8分钟，重复三次洗净藻种后，用PBS缓冲液冲洗出藻种配制成相应浓度藻液待用；

（2）吸光度与藻细胞密度的线性关系的确定：

利用血球计数板和显微镜数数方法测定藻液细胞密度，同时测定藻液在600nm的光吸收值OD₆₀₀，得到吸光度与藻细胞密度的线性关系；

（3）二甲基亚砜与量子点荧光的测定：

取量子点母液2ml、丙酮8ml稀释为6mg/ml的溶液10ml。给四个洗净烘干的锥形瓶依次编号，向其中分别加入①10mlPBS缓冲液、②8mlPBS缓冲液+2ml二甲亚砜、③9mlPBS缓冲液+1ml量子点溶液、④7mlPBS缓冲液+2ml二甲亚砜+1ml量子点溶液；反应五分钟后在380nm激发波长处依次测定四组样品荧光光谱；

（4）含有二甲基亚砜与量子点的藻液荧光测定

取 OD₆₀₀值为0.445的藻液，向四个洗净烘干的锥形瓶中依次加入①10ml藻液、②9ml藻液+1ml量子点溶液、③8ml藻液+2ml二甲亚砜溶液、④7ml藻液+2ml二甲亚砜+1ml量子点溶液；反应五分钟后，依次于380nm激发波长处扫描测定500nm—710nm发射波长范围内的荧光谱峰，绘制曲线比较分析二甲亚砜和量子点对藻液荧光的影响；

（5）最佳量子点浓度的测定

取量子点母液，分别稀释为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml浓度待用。取 OD₆₀₀值为0.445的A类藻液；向编号为1—7的锥形瓶中都加入7ml藻液、2ml二甲亚砜；并对应编号分别添加1ml量子点溶液，浓度分别为0>

（6）最佳藻液密度的测定

取藻液适量，配制成OD₆₀₀值分别为0.132、0.224、0.354、0.445、0.519、0.635的藻液待用，依次编号为1—6；向①—⑥号锥形瓶中依次对应编号加入以上藻液各7ml，再分别加入二甲亚砜2ml、8mg/ml量子点溶液1ml，反应五分钟后检测荧光；

（7）优势藻种的筛选

取OD₆₀₀为0.519的>

（8）最佳藻液密度的确定：

绘制各藻液密度条件下荧光光谱图；藻液密度从0.629×10⁶个/ml增加到4.208×10⁶个/ml时，555nm处相对荧光强度伴随着细胞密度的变化先增后减；藻液密度达到3.284×106个/ml时，相对荧光强度最高，达到969.8；

（9）最佳产油藻种的确定：

绘制三组藻液的荧光谱峰；C类藻液相对荧光强度最高；A类次之，B类最低；这说明BG11培养基提供营养，碘钨灯提供光源和热源,光照时间为24h/d，温度在28—32℃范围内的培养条件最有利于小球藻的油脂积累。

所述量子点为CdSe/CdS量子点。所述量子点由以下方法制成：

（1）首先，三颈烧瓶中加入1 mmol硒粉与50 mL液体石蜡，在磁力搅拌下加热至220℃，待硒粉全溶得到硒溶液；与此同时，另一三颈烧瓶中加入20 mmol氧化镉、9.6 mL油酸和40mL液体石蜡，在磁力搅拌下加热至170℃，氧化镉粉末逐渐溶解生成镉溶液；然后，取10 mL镉溶液注入磁力搅拌下的硒溶液中，反应生成CdSe量子点；继续加热保持温度220℃回流30min，使CdSe量子点进一步熟化生长；

（2）CdSe量子点合成完成后，将量子点溶液降温至170℃；随后将硫化氢气体导入三颈烧瓶以进一步合成核壳结构的CdSe/CdS量子点；硫化氢气体的产生是通过蠕动泵将10mmol L⁻¹的硫化钠溶液和20>−1的硫酸溶液同时以4.8>

所述反应管为聚四氟乙烯管，内径为0.7 mm，长度为50 cm。

本发明利用CdSe/CdS量子点染色微藻中油脂，根据荧光强度快速检测其总脂含量。利用藻液细胞密度与吸光度的线性关系标定藻液密度，在380nm的激发波长下，测定藻液的荧光光谱。该方法可精准、简便、迅速筛选出优势产油藻种及其培养条件，为后续工业化生产奠定了工艺基础。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1是藻细胞密度与OD₆₀₀线性关系示意图。

图2是二甲亚砜和量子点荧光光谱图。

图3是含二甲亚砜与量子点的藻液荧光光谱图。

图4是不同浓度量子点作用下藻液荧光光谱图。

图5是不同藻液密度荧光光谱图。

图6是不同藻液密度荧光光谱图。

图7是A、B、C三类藻液荧光光谱图。

图8是CdSe和CdSe/CdS量子点合成装置示意图。

图8中GLS为气液分离器。

图9是CdSe量子点和CdSe/CdS量子点的紫外可见吸收光谱及荧光光谱图。

图10是CdSe/CdS量子点的TEM图。

图11是CdSe/CdS量子点的XRD谱图。

具体实施方式

1.量子点的合成

一种核壳结构CdSe/CdS量子点的合成方法，以氧化镉和硒粉为前驱体，油酸为配体，液体石蜡为有机溶剂，将镉源快速注入硒源中合成得到CdSe量子点。然后将硫化钠溶液和稀硫酸反应在线生成硫化氢气体为前驱体，并可控导入所合成的CdSe量子点溶液中，在CdSe表面进一步包覆CdS壳形成核壳结构的CdSe/CdS量子点。

合成装置示意图如图8所示。具体合成过程如下所述。首先，三颈烧瓶中加入1mmol硒粉与50 mL液体石蜡，在磁力搅拌下加热至220 ℃，待硒粉全溶得到硒溶液。与此同时，另一三颈烧瓶中加入20 mmol氧化镉、9.6 mL油酸和40 mL液体石蜡，在磁力搅拌下加热至170 ℃，氧化镉粉末逐渐溶解生成镉溶液。然后，取10 mL镉溶液快速注入磁力搅拌下的硒溶液中，反应生成CdSe量子点。继续加热保持温度220 ℃回流30 min，使CdSe量子点进一步熟化生长。

CdSe量子点合成完成后，将量子点溶液降温至170 ℃。随后将硫化氢气体导入三颈烧瓶以进一步合成核壳结构的CdSe/CdS量子点（图8）。硫化氢气体的产生是通过蠕动泵将10>−1的硫化钠溶液和20>−1的硫酸溶液同时以4.8>

上述合成过程均在较低温度条件下进行，由一台蠕动泵精确控制导入气态硫源的进样量及进样速度。该方法的整个合成过程绿色、简单、可控、易于重复且更加自动化，采用无毒或低毒的化学试剂作为前驱体，所用到的仪器设备都很简单且操作方便，反应中通入硫化氢气体使得混合更均匀，反应更完全，且不用担心会引入杂质离子，得到更加纯净的量子点产物。

合成的CdSe量子点和CdSe/CdS量子点的紫外可见吸收光谱及荧光光谱如图2所示。包覆CdS壳后得到的CdSe/CdS核壳结构量子点比CdSe量子点的荧光强度有了显著增强。本实验有机相合成的CdSe量子点和CdSe/CdS量子点荧光量子产率分别达到21%和53%，远远高于水相合成的量子点。所合成的量子点具有较高的稳定性，能够稳定长达数月，荧光强度未见明显降低。因此，这些量子点极有潜力被应用于化学分析以及生物标记等领域。

所合成的CdSe/CdS核壳结构量子点的TEM图如图10所示。图中显示CdSe/CdS量子点呈单分散，且近似球形，具有狭窄的尺寸分布，平均直径为3.1 nm。

图11显示了由所合成的CdSe/CdS核壳结构量子点粉末测得的pXRD谱图。在CdSe/CdS量子点的XRD谱图中，2θ = 25.4°、41.8° 和49.2° 三个可清楚辨认的特征衍射峰分别代表了CdSe/CdS立方相闪锌矿晶体结构的(111)、(220)和(311)三个晶面的衍射。

2.藻种来源与培养使用

本实验所用藻种是从南通淡水水域筛选所得，具备生长迅速、生命力强等特质。经实验室扩大培养后，生长迅猛，显微镜下观察其形态为球形单细胞绿藻。为小球藻。

利用BG11培养基扩大培养后又按三种不同条件分类培养藻种。各培养条件如下：A培养于光照培养箱中，光照时间是14h/d，光暗比7：5，光照强度是10000lx，恒温25℃，用BG11液体培养基培养；B处于摇床中，摇床转速是1500r/min，光照时间为12h/d，光暗比是1:1，光照强度为6000lx，有光照时温度为25℃，无光照时为室温，用80%体积分数的BG11培养基和20%体积分数的养殖废水混合培养；C培养于普通室内环境，通过BG11培养基提供营养，由碘钨灯提供光源和热源。光照时间为24h/d，温度控制在28—32℃范围内。

探索最佳染色条件时所用藻种均为A类。B、C两类主要用于研究出最适染色条件后的的应用，即筛选出产油量最高的藻种。使用藻液时取对数生长末期藻液适量，用离心机3500转/分钟离心8分钟后弃上清液，加入PBS缓冲液重悬，3500转/分钟离心8分钟，重复三次洗净藻种后，用PBS缓冲液冲洗出藻种配制成相应浓度藻液待用。

3. 吸光度与藻细胞密度的线性关系的确定

利用血球计数板和显微镜数数方法测定藻液细胞密度，同时测定藻液在600nm的光吸收值OD₆₀₀，得到吸光度与藻细胞密度的线性关系。

得线性回归方程为Y=7.9721X－0.8539，R²=0.9074。说明藻液密度和OD₆₀₀显著相关，并且藻液密度可以通过OD₆₀₀的值进行标定。

4.二甲基亚砜与量子点荧光的测定

取量子点母液2ml、丙酮8ml稀释为6mg/ml的溶液10ml。给四个洗净烘干的锥形瓶依次编号，向其中分别加入①10mlPBS缓冲液、②8mlPBS缓冲液+2ml二甲亚砜、③9mlPBS缓冲液+1ml量子点溶液、④7mlPBS缓冲液+2ml二甲亚砜+1ml量子点溶液。反应五分钟后在380nm激发波长处依次测定四组样品荧光光谱。

依图可知，未添加量子点的①②两组发射光谱几乎是一条趋零直线，这表示PBS缓冲液与二甲基亚砜其本身不会自发产生荧光。量子点的荧光发射峰显示在555nm处。分析谱线，④的荧光峰值高于③，这说明脂溶性量子点易溶于二甲基亚砜而不易溶于水，在常态下水与二甲基亚砜可互溶，故与二甲基亚砜混溶的量子点将在水溶液中分散的更加充分，使得相对荧光强度增强。

5.含有二甲基亚砜与量子点的藻液荧光测定

取 OD₆₀₀值为0.445的藻液适量。向四个洗净烘干的锥形瓶中依次加入①10ml藻液、②9ml藻液+1ml量子点溶液、③8ml藻液+2ml二甲亚砜溶液、④7ml藻液+2ml二甲亚砜+1ml量子点溶液。反应五分钟后，依次于380nm激发波长处扫描测定500nm—710nm发射波长范围内的荧光谱峰，绘制曲线比较分析二甲亚砜和量子点对藻液荧光的影响。

由图可知，藻液中加入量子点的②④号藻液在555nm处具有一个荧光发射峰。并且加入了二甲基亚砜的④号藻液比不含二甲基亚砜的②号藻液荧光峰值更高。对比图2与图3，发现量子点与藻液作用后荧光强度增加，说明量子点进入藻细胞与油脂互溶并相互结合，使得量子点分散更加均匀。在683nm发射波长处4组藻液均有一发射峰，此为叶绿素自发产生的荧光。鉴于555nm与683nm两发射峰波长相距远达128nm，故可断定叶绿素荧光不影响藻细胞总脂荧光的测定。

6.最佳量子点浓度的测定

取量子点母液，分别稀释为2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml、10mg/ml、12mg/ml浓度待用。取 OD600值为0.445的A类藻液适量。向编号为1—7的锥形瓶中都加入7ml藻液、2ml二甲亚砜，并对应编号分别添加1ml量子点溶液（浓度分别为0 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、6 mg/ml、8 mg/ml、10 mg/ml、12 mg/ml），反应五分钟，测定各样品荧光值。

根据荧光数据绘制各量子点浓度下藻液的荧光谱峰如图4所示。

由图可知，在0—12mg/ml量子点浓度范围内，藻液在量子点作用下，荧光峰值随量子点浓度的增加而不断升高。由于随着量子点浓度的增加相对荧光强度的增幅逐渐减弱，同时考虑到提高灵敏度与降低实验成本等诸多因素相互综合影响的结果，选择8mg/ml质量浓度的量子点溶液为最佳条件。

7.最佳藻液密度的测定

取藻液适量，配制成OD600值分别为0.132、0.224、0.354、0.445、0.519、0.635的藻液待用，依次编号为1—6。向①—⑥号锥形瓶中依次对应编号加入以上藻液各7ml，再分别加入二甲亚砜2ml、8mg/ml量子点溶液1ml，反应五分钟后检测荧光。

绘制各藻液密度条件下荧光光谱如图5。

由图可知，藻液密度从0.629×10⁶个/ml增加到4.208×10⁶个/ml时，555nm处相对荧光强度伴随着细胞密度的变化先增后减。藻液密度达到3.284×10⁶个/ml时，相对荧光强度最高，达到969.8。远远高于用尼罗红测定的57.9^[22]。本实验量子点染色的最佳藻液密度是3.284×10⁶个/ml。

8.优势藻种的筛选

取OD₆₀₀为0.519的>

9.最佳藻液密度的确定

绘制各藻液密度条件下荧光光谱如图6。

由图可知，藻液密度从0.629×10⁶个/ml增加到4.208×10⁶个/ml时，555nm处相对荧光强度伴随着细胞密度的变化先增后减。藻液密度达到3.284×10⁶个/ml时，相对荧光强度最高，达到969.8。远远高于用尼罗红测定的57.9。本实验量子点染色的最佳藻液密度是3.284×10⁶个/ml。

10.最佳产油藻种的确定

绘制三组藻液的荧光谱峰。

由图7可知，C类藻液相对荧光强度最高（982.0），A类（969.8）次之，B类（927.9）最低。这说明就实验室三种培养条件而言,BG11培养基提供营养，碘钨灯提供光源和热源,光照时间为24h/d，温度在28—32℃范围内的培养条件最有利于小球藻的油脂积累。

由此表明，将量子点应用于藻细胞油脂含量的检测具备精准、简便、迅速的特点。