一种库蠓近缘种的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法

摘要

本发明公开一种库蠓近缘种的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法，其特征在于采用分子生物学DNA测序的方法获取长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的COⅠ基因序列，再通过基因序列相似性比对，从而根据比对结果对该库蠓近缘种进行种类鉴定。本发明提供的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的分子鉴定方法，有利于实现上述三种库蠓的快速、准确的鉴定。

说明书

技术领域

本发明涉及昆虫物种鉴定领域，具体涉及长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法。

背景技术

库蠓（Culicoides>Culicoides、蠛蠓属Lasiohelea、细蠓属Leptoconops和澳蠓属Austroconops等。在库蠓属吸血蠓中，通过蠓媒传播的病原体有蓝舌病病毒(BTV)、家畜流行性出血热病毒（EHDV）、施马伦贝格病毒（SBV）、非洲马瘟病毒（AHSV）等诸多病原体。吸血蠓是家畜流行病传播过程中的重要一环，若控制不好将爆发流行并造成巨大的经济损失，故与医学和兽医学等领域息息相关。因此，准确鉴定疾病媒介是对蠓传疾病进行监测、防治的关键一步。

目前，蠓的传统形态学鉴定方法首先是以完整的成虫为研究对象，其易受蠓性别和发育阶段的限制导致分类鉴定困难，如蠓卵、幼虫和蛹等早期阶段的形态结构和肢体残缺的虫体均难以辩认且其仅对雄性非吸血蠓虫有较高的适用性，而针对雌性媒介吸血蠓却效果不佳。再者，其还存在操作繁琐、专业性强等不足之处。最后，蠓的表型可塑性和遗传可变性也容易导致误判，尤其是近缘、近似种的分类鉴定。长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等均属二囊亚属的近缘种，传统形态学鉴定极其困难。因此，亟需寻求一种快速、准确的方法，以弥补传统形态学分类方法的不足。

随着分子生物学和生物信息学的快速发展，以DNA序列分析为依据的分子鉴定已成为物种鉴定的常用技术手段，极大地弥补了传统分类学鉴定的缺陷。DNA条形码技术是指生物体内一段标准的、有足够变异和一定保守性的、且相对较短易扩增的DNA片段。因此，作为DNA 条形码的标准目的基因，其必须满足两个条件，一是必须具有一定的保守性，便于通用引物设计及进行大范围的PCR扩增；二是要有足够的变异性，以区分不同物种，尤其是近缘种。

昆虫线粒体DNA为双链闭环分子，由ND1-6、ND4L、CO I-CO III、ATPase6、ATPase8、Cytb等13个蛋白质基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因（16S rRNA和12S rRNA）共37个基因和包含复制启动子的非编码区段组成。线粒体基因中 CO I、CO II、Cytb、12S rRNA、16SrRNA、ND4、ND5是目前应用频率较多的分子标记，其中12S rRNA和16S rRNA因其存在大量的插入和缺失现象且基因高度保守、进化较慢，故不宜用做条形编码基因；ND4和ND5进化太快，难以设计出通用引物，限制了它们作为全面DNA 鉴定系统的目标基因。相较于其他基因，CO I基因大小和结构较为保守，包含信息量大，能够保证足够变异的同时又容易被通用引物扩增，在物种内不同个体之间只有1%-2%的差异，而近缘种间的差异大，且具有较多的系统发育信号，更适合解析亲缘关系密切的生物类群，是使用最广泛的分子标记。

迄今为止，COⅠ基因已用于绝大多数生物类群（如昆虫、鸟类、鱼类、线虫等）的分子鉴定，故可用于吸血蠓近缘种的分子鉴定。将分子鉴定与传统形态学分类方法相结合，实现吸血蠓近缘种的快速、准确鉴定，并有助于发现库蠓属中的隐存种或新种。目前，GenBank中尚无长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等二囊亚属近缘种的COⅠ基因序列。本发明提供了长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓的DNA条形码标准基因序列，有助于上述三种库蠓近缘种的快速、准确鉴定，缩短物种鉴定时间。

发明内容

本发明的目的在于提供一种库蠓近缘种的DNA条形码标准基因序列及其分子鉴定方法。通过分子生物学DNA测序的方法获取长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的DNA条形码标准基因—COⅠ基因序列，通过基因序列相似性的比对，实现长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的快速、准确鉴定。

为实现上述目的，本发明通过如下技术方案实现：

通过DNA模板制备和PCR反应，由合成的引物扩增长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的COⅠ基因，经扩增后PCR产物可用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并将特异性扩增出大小约为650bp的条带序列送生物公司测序。测序结果通过手工校对、序列拼接，并在NCBI中进行Blast相似性搜索，确保所得序列为目标基因序列，同时长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的种类鉴定依靠形态学鉴定所实现，并经权威专家复核，从而保证了结果的可靠性。本发明所述的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的DNA条形码标准基因为COⅠ基因，所述长喙库蠓的COⅠ基因序列如SEQ ID No .1 所示：

gatctgagca ggtatggtag gaacatctct tagaatacta attcgattag aattaggaca 60

tccaggatca ttaattggta atgaccaaat ttataatgta attgttacag ctcacgcatt 120

tattataatt ttttttatag taataccaat tataattgga gggtttggaa attgattagt 180

ccctttaata ttaggagccc ctgatatagc ctttcctcgt ataaataata taagtttttg 240

gatactaccc ccttccatta ctttattatt aattagaagt cttgtagaaa atggagcagg 300

aactggttga acagtttatc cacctctttc tactaatatt tctcattcag gagcatctgt 360

agatttagct attttttctc ttcatttagc tggtattagt tctattctag gagcagtaaa 420

ttttattaca acaattataa atatgcgacc taaaggtata actatagatc gaataccatt 480

atttgtctga tcagttttaa ttacagcaat tcttttatta ctatctttac cagtattagc 540

tggagctatt actatacttc taacagatcg taatatcaat acttcttttt ttgacccgtc 600

agggggagga gacccaattc tttaccaaca tttattttga ttttttggtc650

所述新竹库蠓的COⅠ基因序列如SEQ ID No .2 所示：

tttgagcagg tattattggg gcaaccttaa gattattaat tcgaatcgaa ttaagttacc 60

ctggaaatct ttttaataat gatcaattat ataatgtaat tgttacatct catgctttta 120

ttataatttt ttttatggtt atgccaatca taattggtgg atttggtaat tgattagtac 180

ccctgatatt aggggcccca gatatagctt tcccacggat aaataattta agattttgaa 240

tattaccccc ttctctttct cttttaatta taagaaattt tattgactct ggcccaggaa 300

ctggatgaac tgtatacccc ccactttcat cttatatggc ccaccctaat gcttcagtag 360

acttaactat tttttcatta catctagctg gaatttcttc cattctagga gctgtaaatt 420

ttattacaac aattataaat atacgacctg ctgggatagc aatagataat atacctttat 480

ttgtttgatc aatttttatt acaacaattc ttcttcttct atctttgcca gtattagcag 540

gcgcaattac tatactttta acagatcgta atattaatac ctcatttttt gaccccacag 600

gagggggaga ccctatccta tatcaacatt tattttgatt ttttggacat650

所述白带库蠓的COⅠ基因序列如SEQ ID No .3 所示：

tgtctgagca ggaatagtag gtacttcttt aagaatacta attcgaaccg aattaggaca 60

cccaggggct ttaattggaa acgaccaaat ttataatgtt attgttacag cccatgcttt 120

tattataatt ttttttatag taataccaat tataattgga gggtttggaa attgattagt 180

gcctttaata ttaggtgctc ctgatatggc atttccacga ataaataata taagattttg 240

aatactaccc ccttctatta ctttattatt aattagaagc ttagttgaaa atggagcagg 300

aactggttga actgtttacc ctcctctttc ttctaatatc tctcatgctg gagcttcagt 360

tgatttagca attttttcat tacatttagc aggtattaga tctattttag gagcagtaaa 420

ttttattact actattatta acatacgatc aaatgggata acttttgatc gaatgccttt 480

atttgtttga tctgtattaa ttactgctat tttacttctt ttatctttac cagtattagc 540

tggagctatc acaatacttt taacagatcg aaatattaat acatcatttt ttgatcctgc 600

tggaggagga gatcctattc tttatcaaca tttattttga ttttttggtc65

所述的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的DNA条形码标准基因序列的PCR引物，其特征在于PCR引物序列分别为：

正向引物：5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3’；

反向引物：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3’。

本发明的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的分子鉴定方法，步骤包括：

1）从待测的蠓组织中分离提取DNA；

2）以该DNA为模板，采用的引物为：正向引物： 5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3’；反向引物： 5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3’，通过聚合酶链式反应扩增出库蠓近缘种的COⅠ基因；

3）然后取适量步骤2）的聚合酶链式反应产物分别用琼脂糖凝胶电泳分离，根据电泳条带判断是否为目的条带，如果能特异性扩增出大小约为650bp的条带，则将PCR产物切胶纯化，送生物公司测序；

4）通过测序结果的比对分析，如果相应的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的COⅠ基因序列与SEQ ID No .1、SEQ ID No .2和SEQ ID No .3的相似性分别在98%以上，即可判断所述的库蠓近缘种待测组织分别为长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓。

采用上述技术方案的有益效果是：

1）本发明联合了传统的形态学鉴定与分子鉴定方法，对所述库蠓进行鉴定，可确保物种鉴定的准确性和可靠性。

2）本发明与传统的形态学鉴定方法相比，所建立的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓的分子鉴定方法可大大缩短长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓的鉴定时间。

3）本发明与传统的形态学库蠓近缘种鉴定方法相比，对所述库蠓近缘种的鉴定更快速、更准确且更可靠。

4）本发明填补了长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓的COⅠ基因序列在GenBank数据库中的空白。

附图说明

图1 为本发明的技术流程图。

图2为长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓的COⅠ基因PCR扩增结果的电泳图谱。编号说明如下：泳道1为阴性对照，泳道2-4分别为长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为650bp的条带。M为250bp DNA Ladder Marker。

图3为未知库蠓雌虫COⅠ基因PCR扩增结果的电泳图谱。编号说明如下：泳道1为阴性对照，泳道2、3、4均为未知库蠓雌虫的COⅠ基因，检出大小约为650bp的条带。M为250bpDNA Ladder Marker。

具体实施方式

实施例1 长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的COⅠ基因序列的获取

1、长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种标本的采集与保存

长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种标本均通过网扫法和灯诱法采集于云南、四川等省的野外栖息地，并保存于95%酒精中。用解剖针在体视镜下进行解剖，除胸部外其余均制成永久装片，经权威专家鉴定，确保鉴定结果的准确性。将长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等近缘种的胸部单独标号后进行分子实验。

2、基因组DNA提取

将保存的长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的胸部分别研磨后，按照QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit说明书进行单只库蠓基因组DNA提取，并保存至-20℃备用。

3、引物合成

本实施例所用引物如下：

正向引物：5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3’。

反向引物：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3’。

4、PCR扩增

本实施例的PCR反应体系如下：

DNA模板1.5uL

上游引物（10uM） 1uL

下游引物（10uM） 1uL

2×PCR MasterMix 12.5uL

ddH2O9uL

总体系 25uL

PCR反应条件为94 ℃预变性5 min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸5min。

5、PCR产物鉴定与回收

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断是否为目的条带，电泳图谱参见附图2。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR产物切胶纯化，纯化后的产物送至生物公司进行双向测序。

6、CO I基因序列测定

通过人工校对及生物信息学软件对长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓等库蠓近缘种的COI基因序列进行比对、编辑和拼接后即为SEQ ID No .1、SEQ ID No .2和SEQ ID No .3。

实施例2 未知库蠓的鉴定

1、蠓标本的采集与保存

蠓标本通过网扫法和灯诱法采集于野外栖息地，并保存于95%酒精中。用解剖针在体视镜下进行解剖，除胸部外其余均制成永久装片用于形态鉴定。将蠓胸部单独标号后进行分子实验。

2、基因组DNA提取

将保存的蠓胸部研磨后，按照QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit说明书进行单只未知蠓基因组DNA提取，并保存至-20℃备用。

3、引物合成

本实施例所用引物如下：

正向引物：5’TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 3’。

反向引物：5’GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 3’。

4、PCR扩增

本实施例的PCR反应体系如下：

DNA模板1.5uL

上游引物（10uM） 1uL

下游引物（10uM） 1uL

2×PCR MasterMix 12.5uL

ddH2O9uL

总体系 25uL

PCR反应条件为94℃预变性5 min；94℃变性1min，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；最后72℃延伸5min。

5、PCR产物鉴定与回收

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带判断是否为目的条带，电泳图谱参见附图3。附图3显示实施例2的未知库蠓也能通过PCR特异性扩增出大小约为650bp的产物。按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR产物切胶纯化，纯化后的产物送至生物公司进行双向测序。

6、CO I基因序列测定

通过人工校对及生物信息学软件对未知库蠓CO I基因序列进行比对、编辑和拼接后分别与SEQ ID No .1、SEQ ID No .2和SEQ ID No .3进行相似性比对，结果显示2号、3号、4号泳道的未知库蠓CO I基因序列分别与基因序列SEQ ID NO . 1、SEQ ID No .2和SEQ ID No.3的相似性均大于98%，因而可判定2号、3号、4号泳道的未知库蠓分别对应长喙库蠓、新竹库蠓和白带库蠓。

序列表

<110>遵义医学院

<120>一种库蠓近缘种的DNA条形码标准序列及其分子鉴定方法

<160>5

<170>SIPOSequenceListing 1.0

<210>1

<211>650

<212>DNA

<213>长喙库蠓COⅠ基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400>1

gatctgagca ggtatggtag gaacatctct tagaatacta attcgattag aattaggaca60

tccaggatca ttaattggta atgaccaaat ttataatgta attgttacag ctcacgcatt 120

tattataatt ttttttatag taataccaat tataattgga gggtttggaa attgattagt 180

ccctttaata ttaggagccc ctgatatagc ctttcctcgt ataaataata taagtttttg 240

gatactaccc ccttccatta ctttattatt aattagaagt cttgtagaaa atggagcagg 300

aactggttga acagtttatc cacctctttc tactaatatt tctcattcag gagcatctgt 360

agatttagct attttttctc ttcatttagc tggtattagt tctattctag gagcagtaaa 420

ttttattaca acaattataa atatgcgacc taaaggtata actatagatc gaataccatt 480

atttgtctga tcagttttaa ttacagcaat tcttttatta ctatctttac cagtattagc 540

tggagctatt actatacttc taacagatcg taatatcaat acttcttttt ttgacccgtc 600

agggggagga gacccaattc tttaccaaca tttattttga ttttttggtc650

<210>2

<211>650

<212>DNA

<213>新竹库蠓COⅠ基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400>2

tttgagcagg tattattggg gcaaccttaa gattattaat tcgaatcgaa ttaagttacc60

ctggaaatct ttttaataat gatcaattat ataatgtaat tgttacatct catgctttta 120

ttataatttt ttttatggtt atgccaatca taattggtgg atttggtaat tgattagtac 180

ccctgatatt aggggcccca gatatagctt tcccacggat aaataattta agattttgaa 240

tattaccccc ttctctttct cttttaatta taagaaattt tattgactct ggcccaggaa 300

ctggatgaac tgtatacccc ccactttcat cttatatggc ccaccctaat gcttcagtag 360

acttaactat tttttcatta catctagctg gaatttcttc cattctagga gctgtaaatt 420

ttattacaac aattataaat atacgacctg ctgggatagc aatagataat atacctttat 480

ttgtttgatc aatttttatt acaacaattc ttcttcttct atctttgcca gtattagcag 540

gcgcaattac tatactttta acagatcgta atattaatac ctcatttttt gaccccacag 600

gagggggaga ccctatccta tatcaacatt tattttgatt ttttggacat650

<210>3

<211>650

<212>DNA

<213>白带库蠓COⅠ基因(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400>3

tgtctgagca ggaatagtag gtacttcttt aagaatacta attcgaaccg aattaggaca60

cccaggggct ttaattggaa acgaccaaat ttataatgtt attgttacag cccatgcttt 120

tattataatt ttttttatag taataccaat tataattgga gggtttggaa attgattagt 180

gcctttaata ttaggtgctc ctgatatggc atttccacga ataaataata taagattttg 240

aatactaccc ccttctatta ctttattatt aattagaagc ttagttgaaa atggagcagg 300

aactggttga actgtttacc ctcctctttc ttctaatatc tctcatgctg gagcttcagt 360

tgatttagca attttttcat tacatttagc aggtattaga tctattttag gagcagtaaa 420

ttttattact actattatta acatacgatc aaatgggata acttttgatc gaatgccttt 480

atttgtttga tctgtattaa ttactgctat tttacttctt ttatctttac cagtattagc 540

tggagctatc acaatacttt taacagatcg aaatattaat acatcatttt ttgatcctgc 600

tggaggagga gatcctattc tttatcaaca tttattttga ttttttggtc650

<210>4

<211>26

<212>DNA

<213>正向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400>4

taaacttcag ggtgaccaaa aaatca 26

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>反向引物(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)

<400>5

ggtcaacaaa tcataaagat attgg25