毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺

摘要

本发明公开了一种毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺。所述工艺将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，培养至甲醇流加诱导阶段，甲醇流加诱导的0～32h的前期阶段，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h，33h～96h的中期阶段，甲醇流加速度为6.75±0.25L/h，97h～发酵结束的后期阶段，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h。本发明将甲醇诱导阶段时改成分阶段恒速流加，可以保证毕赤酵母在不同代谢时期对碳源的需求。本发明工艺确定，可操作性强，易形成规范化文件，减少因技术失误而导致的产量下降，适合重组人源胶原蛋白的大规模工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺。

背景技术

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种外源蛋白表达系统，既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点。

美国Invitrogen公司构建开发了巴斯德毕赤酵母表达系统，并己成功地表达了几百种外源蛋白，成为目前常用的表达体系。其开发的发酵工艺，工业化分为一级、二级种子培养、甘油培养阶段、甘油流加阶段及甲醇诱导阶段。该工艺是目前巴斯德毕赤酵母表达生产外源蛋白，较为通用的发酵工艺(中国专利201010602114.5，201110327865.5)。毕赤酵母诱导表达阶段，甲醇不仅是诱导剂，且是细胞生长或维持代谢的唯一碳源和能源，故无论重组毕赤酵母的甲醇利用表型如何，甲醇浓度在毕赤酵母表达外源蛋白过程中的控制均十分关键。甲醇浓度太低，无法有效诱导醇氧化酶(AOX)的转录，进而影响外源蛋白表达效率，甲醇浓度太高，则会导致菌体中毒，降低目的蛋白表达量。

甲醇流加量普遍是根据溶氧值、培养时间等综合反馈达到调节甲醇添加量，该工艺技术性强，普通工人难以掌握，且不易形成规范化文件。实际的毕赤酵母表达重组蛋白的工业化生产中，主要操作人员以普通工人为主，过于复杂的操作容易导致较高的出错率，发生技术失误事件进而导致发酵工艺的最终失败。因此，简化现有的发酵工艺中复杂的甲醇流加工艺，使之形成可操作性强的规范化文件，能为普通生产工人所掌握，从而减少因技术失误而导致的产量下降，更适合大规模工业化生产，为重组蛋白的工业化生产带来便利和极大的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于简化现有的毕赤酵母表达重组蛋白的甲醇流加工艺，提供一种工艺简单、操作方便可行、重组蛋白量高、适于工业化大规模生产的毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺。

本发明的技术方案如下：

毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺，包括以下步骤：将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，培养至甲醇流加诱导阶段，甲醇流加诱导的0～32h的前期阶段，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h，33h～96h的中期阶段，甲醇流加速度为6.75±0.25L/h，97h～发酵结束的后期阶段，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h。

本发明所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5021，并在中国专利201110327865.5中充分公开。

本发明所述的毕赤酵母发酵培养基采用现有配方，可以是：85％H₃PO₄6.6～26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O>2SO₄>4·7H₂O>

本发明的发酵工艺中，前期阶段的空气流速为30m³/h，中期阶段的空气流速为40m³/h，后期阶段的空气流速为45m³/h。

本发明的发酵工艺中，毕赤酵母菌种液的接种量为8～12％，发酵温度为28～30℃，溶氧不低于20％，甲醇诱导时间为100～120小时。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明的毕赤酵母甲醇流加工艺，不再需要根据溶氧值、培养时间等综合反馈达到调节甲醇添加量，从技术角度，更适合工业化生产；

(2)本发明的毕赤酵母甲醇流加工艺，不同阶段流加甲醇的量相对固定，便于形成规范化文件，有利于生产管理；

(3)本发明的毕赤酵母甲醇流加工艺，简便易行，减少了出错几率，便于生产人员实施。

与原工艺相比，本发明工艺简单，虽回收率与纯度与原工艺相当，但目的蛋白产率提高5％左右，且该工艺更适合于工业化大规模生产重组人源胶原蛋白。

具体实施方式

本发明的毕赤酵母表达重组蛋白的甲醇流加工艺，待巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris培养至甲醇流加阶段，前期(0～32h)菌浓相对较小，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h，空气流速30m³/h；中期(33h～96h)菌体浓度大、代谢旺盛，甲醇流加速度为6.75±0.25L/h，空气流速40m³/h；后期(97h～发酵结束)代谢能力减弱，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h，空气流速45m³/h。

现有的毕赤酵母表达重组蛋白的甲醇流加工艺，根据溶氧值、培养时间等综合反馈调节甲醇添加量，具体：设定甲醇补料与溶氧联动，当溶氧高于20％开始流加甲醇，溶氧低于20％停止流加甲醇，诱导112h后达到平台期，诱导120h后出罐。

诱导表达后，对发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、超滤和纳滤脱色脱盐，得到重组人源胶原蛋白。

除特殊说明外，本发明的实施例和对比例中使用的菌种及各培养基基本如下：

1、菌种：巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris，保藏编号：CGMCCNo.5021，已于2011年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，并在中国专利201110327865.5中充分公开。

2、培养基：

(1)一级种子培养基为BMGY培养基，组成为：

(2)二级种子培养基组成为：

(3)发酵培养基包括以下组分：

其中PTM1组成为：

甲醇流加前发酵工艺，步骤如下：

(1)一级种子培养

将甘油保存的菌种接种至含有200mL种子培养基的摇瓶中，30℃，250rpm培养24h～36h，培养至菌体湿重达到20±2g/L；

(2)二级种子培养

将一级种子液全部转接入含有60L发酵培养基的100L发酵罐中，30℃培养，用氨水调节并控制pH值为5.0，溶氧控制在20％～30％，培养至菌体湿重达到120±10g/L；

(3)发酵罐培养

将二级种子液转入含有60L发酵培养基的1000L发酵罐中，添加60g/L的甘油，30℃培养，用氨水调节并控制pH值为5.0，通气量为30m³/h，搅拌速率为300～500rpm，当溶氧陡然上升时，饥饿1h使甘油耗尽；

实施例1

甲醇流加阶段，前期(0～32h)，甲醇流加速度为5L/h，空气流速30m³/h；中期(33h～96h)，甲醇流加速度为6.5L/h，空气流速40m³/h；后期(97h～发酵结束)，甲醇流加速度为5L/h，空气流速45m³/h。甲醇诱导结束后出罐，对诱导表达后的发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、超滤和纳滤脱色脱盐，得到重组人源胶原蛋白。

实施例2

本实施例与实施例1不同的是前期甲醇流加速度为5.25L/h，中期甲醇流加速度为6.75L/h，后期甲醇流加速度为5.25L/h，其他步骤与实施例1相同。

实施例3

本实施例与实施例1不同的是前期甲醇流加速度为5.5L/h，中期甲醇流加速度为7L/h，后期甲醇流加速度为5.5L/h，其他步骤与实施例1相同。

对比例1

本实施例与实施例1不同的是前期甲醇流加速度为4.75L/h，中期甲醇流加速度为6.25L/h，后期甲醇流加速度为4.75L/h，其他步骤与实施例1相同。

对比例2

本实施例与实施例1不同的是前期甲醇流加速度为5.75L/h，中期甲醇流加速度为7.25L/h，后期甲醇流加速度为5.75L/h，其他步骤与实施例1相同。

对比例3

甲醇诱导，诱导阶段温度为30℃，pH值控制在5.0，设定甲醇补料与溶氧联动，当溶氧高于20％开始流加甲醇，溶氧低于20％停止流加甲醇，诱导112h后达到平台期，诱导120h后出罐；对诱导表达后的发酵液进行离心，收集离心后的上清液依次进行浓缩、超滤和纳滤脱色脱盐，得到重组人源胶原蛋白。

表1各实施例和对比例的发酵结果

甲醇用量胶原蛋白产量蛋白回收率蛋白纯度对比例166619.32g/L72.7％95.7％对比例278620.16g/L71.8％96.2％对比例364217.42g/L72.3％94.7％实施例169620.65g/L75.7％96.8％实施例272621.14g/L76.3％98.1％实施例375620.87g/L76.8％97.9％

从表中可以看出，采用本发明甲醇流加工艺，胶原蛋白产量均超过20g/L，产量提高5％以上，重组人源胶原蛋白的回收率达到75％以上，优于对比例。利用HPLC测定纯化之后胶原蛋白浓度和纯度，蛋白表达量显著提高，蛋白回收率也有相应提高，纯度与对比例相当。本发明将甲醇诱导阶段时，将原来通过溶氧值与甲醇泵的联动来控制甲醇的流加，改成分阶段恒速流加。原工艺使得毕赤酵母在表达目的蛋白阶段一直处于碳源供应不足的状态，对目的产物的产量必定有影响且原工艺技术性较强，需根据培养时间控制甲醇流加量，普通工人难以掌握，且不易形成规范化文件。改成甲醇分阶段恒速流加后可以保证毕赤酵母在不同代谢时期对碳源的需求。同时本发明的工艺确定，可操作性强，易形成规范化文件，减少因技术失误而导致的产量下降，更适合大规模工业化生产，为重组蛋白的工业化生产带来便利和极大的经济价值。