重组人源胶原蛋白在巴氏毕赤酵母中的表达、纯化、鉴定

摘要

胶原蛋白(Collagen)是细胞外基质(ECM)的主要成分,广泛地存在于动物骨、腱、软骨和皮肤及其它结缔组织中,约占动物体内胶原纤维固体物的85％,占体内蛋白质总量的25%～30%,具有支撑器官、保护机体的功能。本文通过毕赤酵母基因工程菌高密度发酵生产重组人源胶原蛋白(RHSC)。主要研究结果如下:
　　 1.采用3.7L自控式发酵罐进行补料-分批发酵条件优化,通过对发酵工艺的逐步改进使发酵上清液中RHSC最终浓度达到16.51 g·L-1。
　　 2.研究了补料-分批发酵动力学,得到诱导初期菌体比生长率为0.0083 h-1,产物产率为0.56 mg·g-1·h-1,甲醇消耗速率为0.0104 g·g-1·h-1,单位甲醇产菌体量为1.41g·g-1。在供氧速率达到最大值后,菌体比生长率为0.0008 h-1,甲醇消耗速率明显降低,而产物产率呈逐渐减小趋势。
　　 3.利用补料-分批发酵动力学数据进行半连续发酵,获得了较高的目的蛋白产率,为补料-分批发酵的1.31倍,并且节省了一定的原料成本。
　　 4.采用AKTA快速蛋白液相色谱探索RHSC纯化工艺,最终可使目的蛋白回收率达93.6%,通过凝胶电泳扫描分析纯度达99.5%。另外,发酵上清液通过30%饱和度硫酸铵沉淀,可实现了RHSC单体与二聚体的分离。
　　 5.采用紫外光谱、氨基酸组分分析、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱、红外光谱、圆二色谱对目的蛋白结构进行分析,证明其一级结构与所设计目的基因相符合,二级结构与动物体内提取的明胶极其相似。扫描电镜结果及成膜性实验显示其具有作为生物医学材料的良好性能。
　　 6.通过MTT实验对重组人源胶原蛋白细胞毒性进行分析,证明其具有一定的促细胞生长能力。