一种基于浅层液体培养的麝香百合遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种基于浅层液体培养的麝香百合遗传转化方法，包括预培养、菌株活化、农杆菌侵染与共培养、脱菌与筛选培养、分化与抗性苗的获得、体视荧光显微镜观察检测等步骤；本发明以愈伤组织发生能力较强以及愈伤增殖速度较快的麝香百合‘雷山’试管鳞茎的鳞片为实验材料，采取植物细胞薄层切片法，以浅层液体培养为基础，利用根癌农杆菌介导法进行麝香百合遗传转化的研究，将绿色荧光蛋白基因(GFP)转入麝香百合，获得再生植株后采用正置体视式荧光显微镜观测，为百合的基因工程研究提供基础。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种基于浅层液体培养的麝香百合遗传转化方法。

技术背景

百合科百合属植物多为世界著名的观赏花卉，适宜盆栽、鲜切花和庭园绿化，还具有食用和药用价值，正日益成为提升生活质量的首选花卉。市场上主要的百合切花品种多为麝香百合、东方百合、亚洲百合。百合再生能力强，鳞片、茎尖、叶片、花梗、花托等均可作为外植体通过愈伤组织再分化或直接诱导小鳞茎或不定芽再生。而百合组织培养的研究多以快速繁殖为主，以遗传转化为目的的再生体系研究也有报道且不同品种间存有差异。与东方百合和亚洲百合相比，麝香百合具有较强的愈伤组织发生能力。植物转基因技术可打破物种界限、缩短育种周期、定向修饰目标性状，利用外源基因来改良植物的研究应用为提升植物品质和性状提供了新的途径。

百合病害严重且主要受到病毒及真菌感染，虽然部分品种对病害具有抗性，但采取传统杂交育种时往往伴随一些不良性状的遗传，不能定向改变其抗病害能力并使其保持原有品种的优良性状。百合基因工程的研究在国内外都有报道，但尚处于摸索阶段。基因枪法转化效率较低，容易产生嵌合体。农杆菌介导法成本低廉，转化效率较高，然而利用农杆菌介导法转化百合还处于探索阶段。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于浅层液体培养的麝香百合遗传转化方法，包括预培养、菌株活化、农杆菌侵染与共培养、脱菌与筛选培养、分化与抗性苗的获得、体视荧光显微镜观察检测等步骤。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种基于浅层液体培养的麝香百合遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)预培养：剥取百合‘雷山’中层鳞片，无菌条件下用解剖刀纵切成0.4-0.6mm厚度的薄切片，放入预培养基，于暗培养箱中25℃条件下暗培养4d，得到预培养后的外植体；

(2)菌株活化：从LB培养基平板上挑取根癌农杆菌的单菌落接种至含链霉素30.0mg/L和卡那霉素50.0mg/L的10mL LB液体培养基中，置于220r/min的摇床上，28℃条件下过夜培养19h，得到根癌农杆菌悬液，将根癌农杆菌悬液1mL添加到含链霉素30.0mg/L和卡那霉素50.0mg/L的LB液体培养基以1:50的比例在220r/min的摇床上，28℃震荡培养4h至OD₆₀₀为0.6，得到活化菌液，将活化菌液在4℃下以5000r/min的速度进行离心10min，抽弃上清，加入不含NH₄NO₃但添加毒莠定4.0mg/L和乙酰丁香酮100mg/L的液体MS₀培养基，在涡旋仪上以150r/min的速度旋涡，得到重悬菌液，重悬菌液的OD₆₀₀为0.4；

(3)农杆菌侵染与共培养：将预培养后的外植体放入OD₆₀₀为0.4的重悬菌液中进行侵染，时间为10min，侵染过程中轻轻摇晃，侵染后取出外植体放置于无菌滤纸吸干菌液，再将外植体放到共培养基上暗培养7d，得到共培养后的外植体；

(4)脱菌与筛选培养：共培养后的外植体放入含头孢霉素200mg/L的液体MS₀培养基的三角瓶中，轻轻摇晃1min后，取出外植体在无菌滤纸吸干液体后再放入含有毒莠定4.0mg/L、卡那霉素50mg/L和头孢霉素100mg/L的液体MS₀培养基中用手轻轻摇晃，取出薄切片在无菌滤纸上吸干液体，吸干液体后将薄切片放入筛选培养基中，在温度为25℃，湿度为50％～60％，光强为2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光照培养箱中进行筛选培养，24d为一个周期，进行两个周期的筛选，得到筛选后的外植体；

(5)分化与抗性苗的获得：将筛选后的外植体转移至装有固体增殖培养基的培养皿中，在温度为25℃，湿度为50％～60％，光强为2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光照培养箱中培养，每1个月换一次新的MS₀培养基同时剔除已经褐化的外植体，转化进行至4-6个月会有小苗形成，将小苗转移至分化培养基中，在温度25℃，湿度为50％～60％，光强为2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光照培养箱中进行培养，去除褐化小苗，得到转化植株；

(6)体视荧光显微镜观察检测：将转化植株的叶片置于体视荧光显微镜进行观察，发现抗性植株在紫外条件下有绿色荧光。

所述步骤(1)中预培养基为液体MS₀培养基+毒莠定4.0mg/L，pH为5.8。

所述步骤(2)中根癌农杆菌的菌株为EHA105，质粒pBI121，载体中含有NptⅡ选择基因，GFP报告基因。

所述步骤(2)中LB培养基的配方：胰蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+氯化钠10g/L+琼脂11.5g/L，pH为7.0。

所述步骤(3)中共培养基为不含NH₄NO₃的液体MS₀培养基+毒莠定4.0mg/L+乙酰丁香酮100mg/L，pH为5.8。

所述步骤(4)中筛选培养基为液体MS₀培养基+毒莠定4.0mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢霉素100mg/L，pH为5.8。

所述步骤(5)中增殖培养基为固体MS₀培养基，pH为5.8。

所述步骤(5)中分化培养基为瓶装固体MS₀培养基+卡那霉素50mg/L+头孢霉素100mg/L，pH为5.8。

本发明具有有益效果：

(1)本发明以愈伤组织发生能力较强以及愈伤增殖速度较快的麝香百合为实验材料，鳞片为外植体，采取植物细胞薄层切片法，以浅层液体培养为基础，利用根癌农杆菌介导法进行麝香百合遗传转化的研究，将绿色荧光蛋白基因(GFP)转入麝香百合，获得再生植株后采取正置体视式荧光显微镜观测，为百合的基因工程研究奠定基础；

(2)本发明采用薄层细胞培养进行遗传转化扩大了外植体与农杆菌接触的表面积，增加了农杆菌感染的细胞数量，在筛选时可以使更多的细胞接触到筛选培养基，提高了转化效率；本发明采用浅层液体培养，预培养基、共培养基、筛选培养基等均为液体培养基，采取浅层液体培养进行农杆菌介导的百合鳞片薄层切片遗传转化可降低假阳性的存在，各时期外植体均与培养基充分接触，形成愈伤速度快，长出的愈伤状态良好更易分化形成抗性芽，缩短了周期，有利于百合鳞片薄层切片的愈伤诱导，且操作过程较为方便；

(3)植物转化过程中影响转化效率的因素很多，预培养可以促进细胞分裂，而处于分裂状态的细胞比较容使外源DNA整合到植物基因组中，预培养对提高转化效率有所帮助；乙酰丁香酮能有效促进Vir基因的活化，所以在侵染液中加入适当浓度的乙酰丁香酮能大大提高转化效率；

(4)进行植物转基因时通常在载体中加入筛选标记，对于GUS报告基因在检测时需逐个取样，再经保温、脱色、固定等繁琐步骤，工作量大且建立在对植物组织破坏性的基础上，不能跟踪检测，本发明利用报告基因GFP进行了百合遗传转化研究，只需荧光照射外植体，转化成功的再生植株就会发出绿色荧光，从而与未转化植株区别开来。

附图说明

图1为本发明技术路线示意图；

图2为鳞片薄切片接种于预培养基中示意图；

图3为外植体表面形成愈伤突起示意图；

图4为再生的转化植株示意图；

图5为转GFP基因植株的表达情况(1：转化植株与非转化植株叶柄在体视荧光显微镜白光下拍摄，2：转化植株与非转化植株叶柄在紫外条件下拍摄，3：转化植株与非转化植株叶片在体视荧光显微镜白光下拍摄，4：转化植株与非转化植株叶片在紫外条件下所拍。)

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

如图所示，一种基于浅层液体培养的麝香百合遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)预培养：预培养基为液体MS₀培养基+毒莠定4.0mg/L，pH为5.8，预培养基配制定容完毕，分装于在高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20min的培养皿(直径9厘米)中，在超净工作台中将液体培养基分装约为6mL每皿，以刚好浸没鳞片薄层切片为佳；麝香百合‘雷山’组培苗为实验材料，实验材料保存在温度为25℃，湿度为50％～60％，光强为2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的环境中，培养在含100g蔗糖的MS₀固体培养基上每2个月进行继代培养，麝香百合‘雷山’中层鳞片愈伤诱导率及愈伤再生芽能力较强，组培苗鳞茎长至直径为2.2-2.8cm时，在超净工作台中无菌滤纸上取百合中层鳞片，用纵切的方式切成0.5mm厚度的鳞片薄层切片，每培养皿接种数量为25个左右的外植体，每次各接种3皿(图2)，于暗培养箱中25℃条件下暗培养4d，目的使外植体恢复生长，得到预培养后的外植体；

(2)菌株活化：菌株为根癌农杆菌菌株EHA105，质粒pBI121，载体中含有NptⅡ选择基因，GFP报告基因；LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L+酵母提取物5g/L+氯化钠10g/L+琼脂11.5g/L，pH为7.0；从LB培养基平板上挑取单菌落接种至含链霉素30.0mg/L和卡那霉素50.0mg/L的10mL LB液体培养基中，置于220r/min的摇床上，28℃条件下过夜培养19h，得到根癌农杆菌悬液，将根癌农杆菌悬液1mL添加到含链霉素30.0mg/L和卡那霉素50.0mg/L的LB液体培养基以1:50的比例在220r/min的摇床上，28℃震荡培养4h至OD₆₀₀约为0.6，得到活化菌液，将活化菌液在4℃下以5000r/min的速度进行离心10min，抽弃上清，加入不含NH₄NO₃但添加毒莠定4.0mg/L、乙酰丁香酮100mg/L的液体MS₀培养基，在涡旋仪上以150r/min的速度涡旋，得到重悬液，重悬液的OD₆₀₀为0.4；

(3)农杆菌侵染与共培养：将预培养后的外植体收集于一起放置于重悬菌液OD₆₀₀为0.4的重悬液中进行侵染，时长为10min，侵染过程中轻轻摇晃，促进外植体与菌的接触，但速度不宜过快，侵染后取出外植体放置于无菌滤纸吸干菌液，吸掉多余菌液后，再将植物材料放到加入不含NH₄NO₃但添加毒莠定4.0mg/L+乙酰丁香酮100mg/L的液体MS₀培养基暗培养7d，促进转化载体T-DNA的转化，得到共培养后的外植体；

(4)脱菌与筛选培养：将共培养后的外植体接种到装有头孢霉素200mg/L的液体MS₀培养基的三角瓶中，轻轻摇晃，取出外植体在无菌滤纸吸干液体后再接种至添加有毒莠定4.0mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢霉素100mg/L的液体MS₀培养基中用手轻轻摇晃，取出外植体在无菌滤纸上吸除多余液体，吸干多余的液体后将外植体转移至添加毒莠定4.0mg/L+卡那霉素50mg/L+头孢霉素100mg/L的固体MS₀培养基中，在温度为25℃，湿度为50％～60％，光强为2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光照培养箱中进行筛选，24d为一个周期，进行两个周期的筛选，第一个周期结束后取出外植体再接种于新鲜的筛选培养基中进行筛选培养，在第一个筛选培养周期内转化外植体会表面部分形成愈伤组织突起(图3)，得到筛选后的外植体；

(5)分化与抗性苗的获得：将筛选后的外植体转至装有MS₀的培养皿中，放置于温度为25℃，湿度为50％～60％，光强为2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光照培养箱中，每1个月转换一次新鲜的培养基同时剔除已经褐化的外植体，减少其分泌的有害物质对其余外植体的影响，不定期观察，在转化进行至4-6个月会陆续有小苗形成；将分化所得的小苗转移至添加卡那霉素50mg/L+头孢霉素100mg/L的瓶装固体MS₀培养基中，在温度为25℃，湿度为50％～60％，光强为2000lx，光照/黑暗＝16h/8h的光培养箱中进行培养，培养基中添加抗生素用于去除假阳性小苗，得到转化植株(图4)；

(6)体视荧光显微镜观察检测：检测时取转化植株叶片及叶柄进行观察，转基因成功且GFP基因表达的植株，其叶柄及叶片会在紫外光源的照射下发出明显的绿色荧光，而对照未转基因植株的叶柄及叶片没有绿色荧光发出。