麝香百合胚性愈伤诱导及农杆菌介导的遗传转化体系的优化

摘要

百合花大而美丽，寓意百年好合，可用于鲜切花、盆栽以及花境的布置。虽然百合应用广泛，但百合也有很多性状需要改良，如花粉污染，某些品种抗性较差等。由于百合远源杂交不亲和，传统的杂交育种方法很难对百合的品种进行快速改良，而分子育种的手段如转基因的方法为百合性状的改良提供了可行的方法。但百合在遗传转化方面也存在一些问题。如百合转化效率较低，PCR检测假阳性率高等。本研究以麝香百合为实验材料，进行了胚性愈伤的诱导和遗传转化的研究，为提高百合的转化效率打下基础。主要研究结果如下：
　　 ⑴以麝香百合鳞片薄层切片为材料，诱导愈伤组织的最佳培养基为MS+60 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂+0.5 mg/L NAA+0.4 mg/L TDZ，诱导率可达到95.25％。诱导胚性愈伤组织的最佳培养基为:MS+60 g/L蔗糖+7.5 g/L琼脂+2.0 mg/L PIC+0.1mg/L TDZ，诱导率可达到94.36％。对诱导的四种不同形态的愈伤组织进行石蜡切片，观察到PIC诱导的愈伤组织中存在较多的胚性细胞，因此PIC为诱导胚性愈伤的良好试剂。
　　 ⑵通过对鳞片薄层切片、鳞茎盘和愈伤组织三种不同受体材料的比较，得出最佳的转化受体材料为麝香百合愈伤组织;通过对不同类型的农杆菌菌株EHA105、AGL0、GV3101的比较得出，菌株EHA105的侵染能力最强，AGL0和GV3101侵染能力较弱;通过对卡那霉素抗性标记基因和潮霉素抗性标记基因的比较得出，用潮霉素筛选的百合愈伤组织转化率明显高于用卡那霉素筛选的愈伤组织，因此在构建载体时尽量选用潮霉素抗性标记基因。通过对百合鳞片薄层切片的不同处理（划伤/不划伤）比较，得出筛选后划伤处理的鳞片薄层切片出芽率仅为1.5％，而未划伤处理的鳞片出芽率为25.2％，划伤处理对鳞片细胞造成了一定损害，不利于筛选过程中植株的生长。
　　 ⑶在遗传转化体系优化的基础上，以麝香百合愈伤组织为受体材料， EHA105为侵染菌株，潮霉素抗性基因为选择标记，进行了目的基因LlDREB1的转化，筛选后共得到12株抗性苗，经过PCR检测，其中3株呈阳性，转化效率为3.4％。

目录

声明

摘要

缩略表

第一部分 文献综述

1．百合概述

2．百合愈伤诱导研究进展

2．1 基因型和外植体类型

2．2 培养方式

2．3 培养基成分

3．百合遗传转化研究进展

3．1 受体来源及发育状态

3．2 受体材料基因型和农杆菌菌株类型

3．3 Vir基因活化物

3．4 遗传转化过程中的培养条件和培养方法

3．5 外源基因的表达情况

第二部分 麝香百合愈伤组织诱导

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验所用药品

1．3 培养条件

1．4 试验方法

2．结果分析

2．1 不同激素水平对麝香百合愈伤诱导率的影响

2．3 愈伤组织形态学观察

2．4 叶片诱导愈伤形态观察及生长情况

3．讨论

第三部分 麝香百合遗传转化体系优化

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 转化所用的农杆菌

1．3 转化过程植株培养环境

1．4 实验所用药品和试剂

1．5 实验方法

2．结果与分析

2．1 麝香百合抗生素选择压的确定

2．2 侵染麝香百合愈伤组织的农杆菌菌株活力比较

2．3 不同处理方法(划伤／不划伤)对鳞片转化效率的影响

2．4 抗性标记基因对麝香百合转化效率的比较

2．5 不同受体材料对麝香百合转化效率的比较

3．讨论

第四部分 目的基因的LIDREB1的遗传转化

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 转化过程的培养环境

1．3 实验所用试剂及培养基

1．4 实验方法

2．结果与分析

3．讨论

参考文献

致谢