一种酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

摘要

本发明属医学检验技术领域，具体涉及一种测定血清糖化白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒。所述试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3、试剂R4。其中，试剂I含有蛋白变性剂、羟基烷基胺、胰蛋白酶、抗干扰剂、防腐剂、缓冲液；试剂II含有果糖氨基酸氧化酶、海藻糖、缓冲液；试剂III含有氨基酸氧化酶、海藻糖、缓冲液；试剂IIII为发光底物1,2‑二氧杂环丁烷硼酸。本发明提供的试剂盒与现有的酶法检测试剂盒的检测原理类似，但成本较低，抗干扰性强，检测准确，性质稳定，便于广泛应用。

说明书

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种酶化学发光法测定糖化血清白蛋白与白蛋白浓度比值的试剂盒。

背景技术

人体中葡萄糖与蛋白质发生非酶糖化反应即形成糖化蛋白。果糖胺(GSP)是血清蛋白(主要是白蛋白)与葡萄糖发生非酶促反应的产物，由于白蛋白的半衰期为17～19天，故其值能反映测定前2～3周血糖的平均水平，是目前临床上用来判断短期血糖控制的指标。但由于血清中非特异性还原物质也可发生此反应，加之不同蛋白组分的非酶糖化反应率不同，故GSP检测法特异性差。而糖化血清白蛋白(GA)检测是在GSP的基础上对GA进行的定量测定，利用血清糖化白蛋白与血清白蛋白的百分比表示GA的水平，从而去除了血清白蛋白水平对检测结果的影响，如何精确地测定出人血清中的糖化白蛋白量成为临床检测糖化白蛋白的关键。

目前市场上采用酶法检测人血清中的糖化白蛋白相关产品的反应原理为：首先使用蛋白酶将糖化蛋白消化成低分子量的糖化多肽，随后使用果糖氨基酸酶催化糖化多肽发生氧化反应生成多肽(或氨基酸)、葡萄糖醛酮和H₂O₂，释放的H₂O₂通过终点反应比色法来测定，其在600nm处的吸收值与糖化白蛋白的浓度成比例。由于酶法测定是基于H₂O₂与发色底物的氧化还原反应而进行测定，血液中存在的还原性物质如抗坏血酸、尿素、胆红素、乳糜等均会产生一定的干扰，导致检测的准确性降低，因此，大部分的酶法检测试剂盒的检测试剂通常含有抗坏血酸酶、胆红素酶和尿素酶等，不仅增加成本，也给试剂使用的稳定性增加难度。

另一方面，由于糖化白蛋白的特征在于赖氨酸残基的ε-氨基的糖化，因此，需要果糖氨基酸酶高效地作用于被糖化的赖氨酸残基。但通常情况下果糖氨基酸酶难以直接作用于蛋白质，需预先通过蛋白酶处理来制备白蛋白的分解物，然后使果糖氨基酸酶作用于该分解物。然而血液样本中的白蛋白与经过精制的试剂水平的白蛋白不同，结合了胆红素或脂蛋白等各种物质，因此，难以通过蛋白酶获得果糖氨基酸酶易于作用的片断。因而，在测定血清或血浆等试样中的白蛋白时，有必要在试样中添加大量的蛋白酶来提高反应性，但由此会产生以下问题：成本高，并且由于存在大量的蛋白酶，导致在糖化白蛋白的测定体系中所用的其它酶如：过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶等失活。

公开号为CN 102565420 A的专利申请“人血清糖化白蛋白检测试剂盒”包含试剂1和试剂2，其中试剂1由蛋白酶共表达体、缓冲液、过氧化物酶、4-氨基安替比林、防腐剂、稳定剂组成；试剂2由缓冲液、果糖赖氨酸酶、N,N-双(4-磺丁基)-3-甲基苯胺、防腐剂和稳定剂组成，该试剂盒可提高蛋白酶对白蛋白的特定性，减少球蛋白的干扰，降低蛋白酶对抗坏血酸酶的影响。但试剂中的蛋白酶共表达体构建比较复杂，且成本较高，不利于推广。

公开号为CN 105223192 A的专利申请“一种糖化血清蛋白检测试剂及其应用”公开了一种由试剂R1和试剂R2以体积比为3:1组成的检测试剂，其中，试剂R1含有磷酸钾缓冲液、尿酸酶、抗坏血酸氧化酶、烷基醇酰、胺聚氧乙烯醚、多元醇、氯化钙和防腐剂，试剂R2含有MES缓冲液、烷基聚葡萄糖苷、2-(4-碘苯)-3-(2,4-二硝基苯1)-5-(2,4-二磺基苯1)-2H-四氮唑和防腐剂，该检测试剂中的2-(4-碘苯)-3-(2,4-二硝基苯1)-5-(2,4-二磺基苯1)-2H-四氮唑在碱性环境中可以与糖化血清蛋白直接反应形成有色底物，通过检测吸光度而进行测定，与酶法检测的原理不同，具有抗干扰能力强、测定灵敏度高、检测结果精密度高和重复性好的优点，而且该试剂稳定性高、水溶性好，是一种理想的糖化血清蛋白检测试剂，有利于该试剂的推广和应用。

综上所述，仍需要提供一种检测结果准确、重复性高、抗干扰能力强的酶法检测试剂盒，以满足市场需求。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒，该试剂盒成本较低，抗干扰性强，检测准确，性质稳定，便于广泛应用。

本发明的技术方案如下：

一种酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒包括试剂R1、试剂R2、试剂R3和试剂4，其中所述的试剂R1包含以下组分：

所述的试剂R2包含以下组分：

果糖胺氧化酶1～50U/mL

海藻糖10～50g/L

pH6.0～8.5磷酸缓冲液5～100mmol/L；

所述的试剂R3包含以下组分：

氨基酸氧化酶1～100U/mL

海藻糖10～50g/L

pH6.0～8.5磷酸缓冲液5～100mmol/L

所述的试剂R4为市售产品发光底物1,2-二氧杂环丁烷硼酸。

优选地，所述的试剂盒中试剂R1包含以下组分：

所述的试剂R2包含以下组分：

果糖胺氧化酶1～20U/mL

海藻糖10～30g/L

pH6.0～8.5磷酸缓冲液5～50mmol/L；

所述的试剂R3包含以下组分：

氨基酸氧化酶1～50U/mL

海藻糖10～30g/L

pH6.0～8.5磷酸缓冲液5～50mmol/L；

所述的试剂R4为市售产品发光底物1,2-二氧杂环丁烷硼酸。

更优选地，所述的试剂盒中试剂R1包含以下组分：

所述的试剂R2包含以下组分：

果糖胺氧化酶 8U/mL

海藻糖 10g/L

pH6.0～8.5磷酸缓冲液 10mmol/L；

所述的试剂R3包含以下组分：

氨基酸氧化酶 20U/mL

海藻糖 10g/L

pH6.0～8.5磷酸缓冲液 10mmol/L；

所述的试剂R4为市售产品发光底物1,2-二氧杂环丁烷硼酸。

进一步地，所述的蛋白变性剂为磷酸脲。

进一步地，所述的羟基烷基胺为一乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、羟乙基乙二胺、羟甲基乙二胺、二羟乙基乙二胺中的任意一种。

优选地，所述的羟基烷基胺为三乙醇胺。

进一步地，所述的抗干扰剂为氯乙酰氯和N-卤代酰胺以1:0.3～0.6质量比组成。

优选地，所述的抗干扰剂为氯乙酰氯和N-卤代酰胺以1:0.5的质量比组成。

优选地，所述的N-卤代酰胺为N-氯代乙酰胺。

进一步地，所述的防腐剂为proclin 300、KY100或叠氮钠。

进一步地，所述试剂盒中还包含糖化白蛋白标准液和白蛋白标准液，糖化白蛋白标准液用纯化水稀释为2.5g/dL，白蛋白浓度为4.5g/dL。

本发明提供的试剂盒使用的化学发光底物为市售产品1,2-二氧杂环丁烷硼酸，购自美国Lumigen Inc.，商品名HyPerBlu，其检测用量为20μL。

本发明试剂盒的检测原理在于，白蛋白及糖化白蛋白在蛋白变性剂及蛋白酶的作用下水解成氨基酸和糖化氨基酸，两者在不同氧化酶的作用下产生过氧化氢，过氧化氢直接与底物反应产生光信号，光信号的大小与两者的浓度呈正相关，即两者的浓度越大发出的光信号越强；用已知浓度的白蛋白和糖化白蛋白测出的光信号，作出剂量-反应曲线；未知样品的白蛋白和糖化白蛋白含量可从该曲线推算出来。

具体地，本发明试剂盒的使用包括糖化白蛋白和白蛋白检测步骤，其中，糖化白蛋白检测：

第一反应(加入R1试剂)：通过蛋白变性剂，主要为磷酸脲。在蛋白变性剂存在的情况下，利用蛋白酶分解样本中的白蛋白和糖化白蛋白，获得果糖胺氧化酶特异性作用的糖化氨基酸片断。同时，在除干扰剂的作用下，除去样本中的抗坏血酸、胆红素等内源性干扰；第二反应(加入R2试剂)：糖化血清白蛋白水解生成的糖化氨基酸在果糖胺氧化酶的作用下，生产过氧化氢；第三反应(加入R4试剂)：以上产生的过氧化氢与发光底物反应形成一种持续稳定的化学信号，最后通过检测发光强度(RLU)，即可检测分析出糖化白蛋白的含量。

白蛋白检测：

第一反应(加入R1试剂)：通过蛋白变性剂，主要为磷酸脲。在蛋白变性剂存在的情况下，利用蛋白酶分解样本中的白蛋白和糖化白蛋白，获得氨基酸氧化酶均有作用的糖化氨基酸和氨基酸混合物片断。同时，在除干扰剂的作用下，除去样本中的抗坏血酸、胆红素等内源性干扰；第二反应(加入R3试剂)：水解生成糖化氨基酸和氨基酸混合物在氨基酸氧化酶的作用下，生产过氧化氢；第四反应(加入R4试剂)：以上产生的过氧化氢与发光底物反应形成一种持续稳定的化学信号，最后通过检测发光强度(RLU)，即可检测分析出白蛋白的含量。

本发明检测试剂盒中，以磷酸脲作为蛋白变性剂，相对于常规使用的盐酸胍、SDS以及季铵盐等蛋白变性剂，具有更佳蛋白变性能力，其与羟基烷基胺相互作用，可提高糖化白蛋白变性的特异性，增强蛋白变性能力，在两者存在的条件下，只需要加入很少量的蛋白酶进行处理，即可进行高效的白蛋白分解。因此可以避免如以往那样大量使用蛋白酶所产生的问题。所述磷酸脲溶于水后容易分解为尿素和磷酸，尿素具有一定的蛋白变性作用，磷酸进一步与羟基烷基胺发生反应，生成的磷酸醇胺类物质可进一步增强蛋白变性作用，只需要添加少量的蛋白变性剂以及少量的蛋白酶即可获得较大量的果糖氨基酸酶作用底物，从而提高检测的准确度，并避免大量使用蛋白变性剂和蛋白酶对其他杂蛋白的作用而带来的干扰。

另一方面，与常规使用的酶检测试剂中添加一定量的过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶或胆红素氧化酶进行抗干扰试验比较，本发明使用氯乙酰氯和N-卤代酰胺作为抗干扰剂，价格便宜，稳定性高，显著提高检测的灵敏度和特异性。所述的氯乙酰氯可与胆红素结构中的四吡咯结构进行反应，抑制四吡咯结构与过氧化氢相互作用，避免胆红素产生假阴性反应，另一方面，氯乙酰氯分解出的氯化氢还可与胆红素结构中的碳碳双键发生加成反应，进一步抑制胆红素产生假阴性作用。所述的N-卤代酰胺为N-氯代乙酰胺，可与抗坏血酸结构中的烯二醇羟基反应，抑制抗坏血酸与过氧化氢相互作用，避免抗坏血酸产生假阴性反应。本发明使用氯乙酰氯和N-卤代酰胺作为抗干扰剂，抗干扰性特异性强，可避免使用常规酶类抗干扰剂被蛋白酶分解的风险，大大提高检测的重复性和准确性。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

(1)与现有的基于酶法检测糖化血清白蛋白的试剂盒比较，本发明提供的酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒具有抗干扰能力强、测定灵敏度高、检测结果精密度高和重复性好的优点，而且稳定性高、水溶性好，是一种理想的糖化血清蛋白检测试剂，有利于该试剂的推广和应用。

(2)与现有的基于酶法检测糖化血清白蛋白的试剂盒比较，本发明提供的试剂盒仅需少量的蛋白酶，并且不含过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶或胆红素氧化酶等抗干扰剂，成本较低，以氯乙酰氯和N-卤代酰胺作为抗干扰剂，适用于各类样本，具有检测多样性。

(3)本发明提供的试剂盒是通过化学发光的方法实现检测，所选用的化学发光底物能产生恒定的辉光，比一般的测量方法线性更宽，测量更准确。此外，所制备的试剂盒可用于全自动测量，也可用于手工或半自动测量，适宜大，中，小各层次的医疗和研究机构。

具体实施方式

以下通过具体实施方式进一步描述本发明，但本发明不仅仅限于以下实施例。

实施例1酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

实施例1酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，其中，所述的试剂R1包含以下组分：磷酸脲10mmol/L、三乙醇胺1mmol/L、胰蛋白酶1U/mL、抗干扰剂0.02％、proclin 300 0.05％、pH 7.5MES缓冲液10mmol/L，所述的抗干扰剂为氯乙酰氯和N-氯代乙酰胺以1:0.5的质量比组成。

所述的试剂R2包含以下组分：果糖胺氧化酶8U/mL、海藻糖10g/L和pH7.5磷酸缓冲液10mmol/L。

所述的试剂R3包含以下组分：氨基酸氧化酶20U/mL、海藻糖10g/L和pH7.5磷酸缓冲液10mmol/L。

所述的试剂R4为市售产品发光底物1,2-二氧杂环丁烷硼酸。

实施例2酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

实施例2酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，其中，所述的试剂R1包含以下组分：磷酸脲30mmol/L、三乙醇胺3mmol/L、胰蛋白酶1U/mL、抗干扰剂0.01％、proclin 300 0.06％、pH 8.0MES缓冲液30mmol/L，所述的抗干扰剂为氯乙酰氯和N-氯代乙酰胺以1:0.6的质量比组成。

所述的试剂R2包含以下组分：果糖胺氧化酶10U/mL、海藻糖20g/L和pH8.0磷酸缓冲液20mmol/L。

所述的试剂R3包含以下组分：氨基酸氧化酶30U/mL、海藻糖20g/L和pH8.0磷酸缓冲液20mmol/L。

所述的试剂R4为市售产品发光底物1,2-二氧杂环丁烷硼酸。

实施例3酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

实施例3酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒包括试剂R1、试剂R2和试剂R3，其中，所述的试剂R1包含以下组分：磷酸脲40mmol/L、三乙醇胺4mmol/L、胰蛋白酶1U/mL、抗干扰剂0.03％、proclin 300 0.04％、pH 8.5MES缓冲液40mmol/L，所述的抗干扰剂为氯乙酰氯和N-氯代乙酰胺以1:0.6的质量比组成。

所述的试剂R2包含以下组分：果糖胺氧化酶20U/mL、海藻糖20g/L和pH8.5磷酸缓冲液40mmol/L。

所述的试剂R3包含以下组分：氨基酸氧化酶50U/mL、海藻糖20g/L和pH8.5磷酸缓冲液20mmol/L。

所述的试剂R4为市售产品发光底物1,2-二氧杂环丁烷硼酸。

对比例1酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

对比例1酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒的试剂组成与实施例1基本相同，区别在于，所述的蛋白变性剂以季铵盐作为变性剂，具体为以氯化十二烷基三甲基铵替换磷酸脲作为蛋白变性剂，其余组分及其组成均与实施例1相同。

对比例2酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

对比例2酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒的试剂组成与实施例1基本相同，区别在于，以氯化十二烷基三甲基铵替换磷酸脲作为蛋白变性剂，并以吐温-20替换三乙醇胺，其余组分及其组成均与实施例1相同。

对比例3酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

对比例3酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒的试剂组成与实施例1基本相同，区别在于，以盐酸胍替换磷酸脲作为蛋白变性剂，其余组分及其组成均与实施例1相同。

对比例4酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

对比例4酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒的试剂组成与实施例1基本相同，区别在于，所述的抗干扰剂仅含氯乙酰氯。

对比例5酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

对比例5酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒的试剂组成与实施例1基本相同，区别在于，所述的抗干扰剂仅含N-氯代乙酰胺。

对比例6酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒

对比例6酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒的试剂组成与实施例1基本相同，区别在于，所述的抗干扰剂为混合酶，该混合酶含过氧化物酶2U/ml和胆红素氧化酶1U/mL。

试验例一、相关性检测

分别以本发明实施例1制得的酶化学发光法测定糖化血清白蛋白的试剂盒测定25例血清样本的糖化血清白蛋白浓度C_GA1和白蛋白(ALB)浓度C_ALB1。同时用市售的对比试剂盒(旭化成制药株式会，批号：1603A)测定以上25例血清样本的糖化血清白蛋白浓度C_GA2和白蛋白浓度C_ALB2。用实施例1制得的试剂盒测定的糖化血清白蛋白与白蛋白比值C_GA1/C_ALB1(％)，用市售的试剂盒测定的糖化血清白蛋白与白蛋白比值C_GA2/C_ALB2(％)，以检测本发明提供的试剂盒的可靠性，结果如下表1所示：

表1试剂盒相关性检测结果

结果显示，本发明提供的试剂盒与市售对比试剂盒检测的相关系数R为0.9954，具有良好的相关性，检测结果可靠。

同理，采用实施例2和3制得的试剂盒与市售对比试剂盒进行相关性检测，相关系数R为分别为0.9987和0.9921，同样具有良好的相关性，检测结果可靠。

试验例二、精密度考察

取糖化白蛋白标准品及白蛋白标准品，按照一定的比例分别配制低值质控样本(C_GA/C_ALB为5％)和高值质控样本(C_GA/C_ALB为15％)，同一天内采用本发明实施例1-3、对比例1-6制得的试剂盒、市售对比试剂盒重复检测20次，计算批内CV，然后采用相同的样本连续测定20天，计算批间CV，结果如下表2所示。

表2试剂盒精密度检测结果

结果显示，本发明实施例1-3制得的检测试剂盒精密度较佳，对低值质控样品和高值质控品的检测值与市售对比试剂盒的检测结果接近，检测结果可靠，但其检测的批内、批间的变异系数均低于市售对比试剂盒，检测性能更优，以实施例1制得的试剂盒最优。由对比例1-3可知，以常规的蛋白变性剂如季铵盐、盐酸脲替换本发明的磷酸脲，或以季铵盐+吐温-20替换本发明的磷酸脲+羟基烷基胺，会降低C_GA/C_ALB的检测比值，表明本发明提供的蛋白变性剂与羟基烷基胺相互作用，可获得较强的蛋白变性作用，只需要添加极少量的蛋白酶即可获得较大量的果糖氨基酸酶作用底物，从而提高糖化白蛋白检测量。由对比例4-6可知，本发明提供的抗干扰剂可显著降低试剂盒检测的批内、批间的变异系数，当抗干扰剂仅为氯乙酰氯或仅为N-卤代酰胺或为常规使用的混合酶，抗干扰能力降低，批内、批间的变异系数均明显增加。

试验例三、稳定性考察

将本发明的实施例1-3制备的试剂盒在2-8℃环境下放置12个月，然后按照试验例二的方法测定C_GA/C_ALB，并与市售对比试剂盒进行对比，结果如下表3所示。

表3试剂盒稳定性考察结果

结果显示，本发明实施例1-3制得的检测试剂盒在低温条件下放置12月后进行C_GA/C_ALB比值检测，其检测结果以及批内、批间检测的变异系数均没有发生明显变化，具有较佳的稳定性。

试验例四、干扰试验

在一份糖化血清白蛋白含量为0.513g/dL，白蛋白浓度为3.506g/dL的血清样品中，加入不同含量的胆红素、抗坏血酸、尿酸，同时以样品中加入等体积的生理盐水作为基础样品。采用本发明实施例1和对比例4-6制备的试剂盒，同时用市售的对比试剂盒(北京九强生物技术股份有限公司，批号：17-0428)进行检测，结果如下表4所示。

表4干扰试验检测结果

结果显示，本发明提供的试剂盒具有较佳的抗干扰能力，胆红素含量少于20mg/dL、抗坏血酸含量少于50mg/dL、尿酸含量少于35mg/dL时测定结果的偏差在±5％以内，证明本发明提供的糖化血清蛋白检测试剂抗干扰能力强，优于对比例4-6制得的试剂盒和市售对比试剂盒。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。