一种提高防风愈伤组织中亥茅酚苷含量的培养方法

摘要

本发明公开了一种提高防风愈伤组织中亥茅酚苷含量的培养方法，将防风愈伤组织均匀切成若干小堆，接种于盛有琼脂培养基的容器中，培养28‑32d后，收集培养物并干燥，其中：1L所述琼脂培养基还添加有2‑4g酵母提取物。本发明提供的培养方法可以显著提高防风愈伤组织中的亥茅酚苷含量；本发明提供的防风愈伤组织富含亥茅酚苷，可以用作制备亥茅酚的原料；以组织培养的方法制备得到的防风愈伤组织成本低，可以规模化制备，且质量可控，可以克服现有技术中防风药材越来越紧张的不足。

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，涉及一种提高防风愈伤组织中亥茅酚苷的培养方法。

背景技术

亥茅酚是一种苯并吡喃酮类化合物，目前常作为合成其它活性物质的原料，具有很高的经济价值(参考文献：中国专利公开号CN104072510A)。

申请人研究发现，如下结构的亥茅酚及其衍生物具有为马兜铃酸及含马兜铃酸的中药减毒的作用，可以降低马兜铃酸的肾毒性。其中，亥茅酚-3’-乙酸酯、3’-O-当归酰基亥茅酚、防风色原酮、防风色酮醇都可以以亥茅酚作为原料经过简单的步骤即可合成制备。

因此，亥茅酚的制备工艺具有很高的产业价值。公开号为CN104072510A的中国专利提供了一种从胀果芹中提取亥茅酚的方法，但是该方法反复使用多种柱层析，无法工业化生产。防风是为伞形科植物防风的干燥根，其中含有如下化学结构的亥茅酚苷，可以以防风为原料先炮制使亥茅酚苷水解成亥茅酚，再提取分离纯化得到亥茅酚。

但是，受草原开荒、掠夺式采挖影响，野生防风资源逐年减少，价格也与日俱增。采用组织培养技术具有速度快、成本低，能在短期内繁殖大量种苗，对于保存防风的种质资源，合理开发利用这一药源，满足市场对防风的大量需求具有现实意义。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提高防风愈伤组织中亥茅酚苷的培养方法，该愈伤组织采用组织培养技术可以产业化大量制备，且该愈伤组织中含有较高含量的亥茅酚苷，以该愈伤组织为原料提取制备亥茅酚可以极大降低成本。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

一种提高防风愈伤组织中亥茅酚苷含量的培养方法，将防风愈伤组织均匀切成若干小堆，接种于盛有琼脂培养基的容器中，培养28-32d后，收集培养物并干燥，其中：1L所述琼脂培养基还添加有2-4g酵母提取物。

优选地，将切成小堆的防风愈伤组织接种于盛有25mL琼脂培养基的50mL三角瓶中，每瓶接种愈伤组织1.5g。

优选地，取继代培养至5-7代的愈伤组织。

优选地，所述防风愈伤组织诱导方法包括：

步骤S1，无菌苗的制备：取饱满的防风种子在无菌水中浸泡，剥去种皮，0.1％氯化汞溶液浸泡10-14min，用无菌水冲洗，吸干种子表面水分，接种到MS培养基上，获得无菌苗，待苗长至3-4cm时备用；

步骤S2，愈伤组织诱导：将无菌苗的叶片剪成小片，接种于灭菌诱导培养基，于pH 5.8-6.0、24-26℃条件培养，每天连续光照11-13h，光强1200-1600Lx，每24-26d继代培养一次。

优选地，所述小片优选0.5cm×0.5cm大小。

优选地，诱导培养基配方优选MS+BA0.5mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖25mg/L+0.7％琼脂。

一种采用任一上述培养方法制备的防风愈伤组织。

上述防风愈伤组织在制备亥茅酚中的应用。

优选地，以防风愈伤组织为原料制备亥茅酚的方法包括如下步骤：

步骤S1，将防风愈伤组织喷洒pH值为5.5-6.5的酸水过夜，90-110℃高温蒸制2-4h；

步骤S2，将蒸制品用70-80％乙醇水溶液提取，收集提取液，过滤，收集滤液；

步骤S3，滤液上大孔树脂柱富集，大孔树脂型号为AB-8，先用45％乙醇水溶液洗脱8个柱体积，再用55％乙醇水溶液洗脱，收集第4和第5个柱体积洗脱液，浓缩得亥茅酚粗品；

步骤S4，第一次精制：将粗品用pH为7.6-7.8的氢氧化钠溶液搅拌混悬，过滤，滤液用盐酸调节pH至6.4-6.6后立即过滤得二滤液，将该二滤液置于4℃低温过夜；

步骤S5，第二次精制：将低温过夜的溶液过滤，收集滤饼，甲醇-丙酮溶液重结晶即得。

优选地，重结晶溶剂为体积比3:2的甲醇-丙酮溶液，先用甲醇-丙酮溶液将滤饼超声溶解，再于通风橱中静置析晶，收集析出物。

本发明的优点：

1、本发明提供的培养方法可以显著提高防风愈伤组织中的亥茅酚苷含量；

2、本发明提供的防风愈伤组织富含亥茅酚苷，可以用作制备亥茅酚的原料；以组织培养的方法制备得到的防风愈伤组织成本低，可以规模化制备，且质量可控，可以克服现有技术中防风药材越来越紧张的不足。

附图说明

图1为实施例1-4制备防风愈伤组织干燥品中亥茅酚苷的含量(％)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

实施例1：防风愈伤组织培养

包括如下步骤：

步骤S1，无菌苗的制备：取饱满的防风种子在无菌水中浸泡，剥去种皮，0.1％氯化汞溶液浸泡12min，用无菌水冲洗，吸干种子表面水分，接种到MS培养基上，获得无菌苗，待苗长至3-4cm时备用；

步骤S2，愈伤组织诱导：将无菌苗的叶片剪成0.5cm×0.5cm大小的小片，接种于灭菌诱导培养基(MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+0.7％琼脂)，于pH 5.9、25℃条件培养，每天连续光照12h，光强1400Lx，每25d继代培养一次；

步骤S3，愈伤组织培养：取继代培养至6代的愈伤组织均匀切成若干小堆，将切成小堆的防风愈伤组织接种于盛有25mL琼脂培养基的50mL三角瓶中，每瓶接种愈伤组织1.5g，培养30d后，收集培养物并干燥，其中：1L琼脂培养基添加2g酵母提取物。

实施例2：防风愈伤组织培养

包括如下步骤：

步骤S1，无菌苗的制备：取饱满的防风种子在无菌水中浸泡，剥去种皮，0.1％氯化汞溶液浸泡10min，用无菌水冲洗，吸干种子表面水分，接种到MS培养基上，获得无菌苗，待苗长至3-4cm时备用；

步骤S2，愈伤组织诱导：将无菌苗的叶片剪成0.5cm×0.5cm大小的小片，接种于灭菌诱导培养基(MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+0.7％琼脂)，于pH 5.8、24℃条件培养，每天连续光照11h，光强1600Lx，每24d继代培养一次；

步骤S3，愈伤组织培养：取继代培养至5代的愈伤组织均匀切成若干小堆，将切成小堆的防风愈伤组织接种于盛有25mL琼脂培养基的50mL三角瓶中，每瓶接种愈伤组织1.5g，培养28d后，收集培养物并干燥，其中：1L琼脂培养基添加3g酵母提取物。

实施例3：防风愈伤组织培养

包括如下步骤：

步骤S1，无菌苗的制备：取饱满的防风种子在无菌水中浸泡，剥去种皮，0.1％氯化汞溶液浸泡14min，用无菌水冲洗，吸干种子表面水分，接种到MS培养基上，获得无菌苗，待苗长至3-4cm时备用；

步骤S2，愈伤组织诱导：将无菌苗的叶片剪成0.5cm×0.5cm大小的小片，接种于灭菌诱导培养基(MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+0.7％琼脂)，于pH 6.0、26℃条件培养，每天连续光照13h，光强1200Lx，每26d继代培养一次；

步骤S3，愈伤组织培养：取继代培养至7代的愈伤组织均匀切成若干小堆，将切成小堆的防风愈伤组织接种于盛有25mL琼脂培养基的50mL三角瓶中，每瓶接种愈伤组织1.5g，培养32d后，收集培养物并干燥，其中：1L琼脂培养基添加4g酵母提取物。

实施例4：防风愈伤组织培养，与实施例1对比，不添加酵母提取物

包括如下步骤：

步骤S1，无菌苗的制备：取饱满的防风种子在无菌水中浸泡，剥去种皮，0.1％氯化汞溶液浸泡12min，用无菌水冲洗，吸干种子表面水分，接种到MS培养基上，获得无菌苗，待苗长至3-4cm时备用；

步骤S2，愈伤组织诱导：将无菌苗的叶片剪成0.5cm×0.5cm大小的小片，接种于灭菌诱导培养基(MS+BA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+0.7％琼脂)，于pH 5.9、25℃条件培养，每天连续光照12h，光强1400Lx，每25d继代培养一次；

步骤S3，愈伤组织培养：取继代培养至6代的愈伤组织均匀切成若干小堆，将切成小堆的防风愈伤组织接种于盛有25mL琼脂培养基的50mL三角瓶中，每瓶接种愈伤组织1.5g，培养30d后，收集培养物并干燥。

实施例5：以防风愈伤组织为原料制备亥茅酚

一种亥茅酚的制备方法，包括如下步骤：

步骤S1，将防风愈伤组织干燥品喷洒pH值为6.0的酸水过夜(不少于8h，下同)，105℃高温蒸制3h；酸水为盐酸水溶液；1kg粗粉均匀喷洒15mLpH值为6.0的盐酸水溶液；

步骤S2，将蒸制品用75％乙醇溶液提取，收集提取液，过滤，收集滤液；

步骤S3，滤液上大孔树脂柱富集，大孔树脂型号为AB-8，先用45％乙醇水溶液洗脱8个柱体积，再用55％乙醇水溶液洗脱，收集第4和第5个柱体积洗脱液，浓缩得亥茅酚粗品；

步骤S4，第一次精制：将粗品用pH为7.7的氢氧化钠水溶液搅拌混悬，过滤，滤液调节pH至6.5后立即过滤得二滤液，将该二滤液置于4℃低温过夜(不少于8h，下同)；

步骤S5，第二次精制：将低温过夜的溶液过滤，收集滤饼，用体积比3:2的甲醇-丙酮溶液重结晶，先用甲醇-丙酮溶液将滤饼超声溶解，再于通风橱静置析晶，析出物洗涤干燥即得，HPLC法测定该析出物中亥茅酚的含量为95.5％。

实施例6：效果实施例

用高效液相色谱法分别测定实施例1-4制备防风愈伤组织干燥品中亥茅酚苷的含量，结果表1和图1所示：

表1实施例1-4制备防风愈伤组织干燥品中亥茅酚苷的含量(％)

实施例1实施例2实施例3实施例4亥茅酚苷含量(％)0.732±0.0310.775±0.0360.804±0.0330.053±0.011

综上可见，本发明提供的培养方法可以显著提高防风愈伤组织中的亥茅酚苷含量；本发明提供的防风愈伤组织富含亥茅酚苷，可以用作制备亥茅酚的原料；以组织培养的方法制备得到的防风愈伤组织成本低，可以规模化制备，且质量可控，可以克服现有技术中防风药材越来越紧张的不足。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。