一种三嵌段共聚物、含有该共聚物的口服肠定位型双层载药纳米微球及制备方法

摘要

本发明公开了一种聚(原酸酯‑异氰酸酯‑己内酯)三嵌段共聚物以及由该聚合物与药物混合作为内层、羧甲基壳聚糖作为外层制备得到的口服肠定位型双层载药纳米微球。该三嵌段共聚物以及羧甲基壳聚糖涂层具有良好的生物相容性和生物降解性，用其制备的纳米药物载体能够保护一系列药物通过口服体系进入血液循环，极大的拓宽了药物的使用范围。该双层纳米微球在体内的运输药物的过程为：在胃部环境下羧甲基壳聚糖涂层保护载药核内层不被降解；然后当载体在肠道时，通过小肠尺寸效应吸收后进入血液循环，由于EPR效应和微酸引发药物快速释放，以达到抗癌药物在癌症细胞内富集，因此该双层纳米药物载体在疾病口服治疗领域具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于纳米技术和药物控释技术领域，涉及一种含酸敏感性原酸酯聚合物的合成以及相对应的口服肠定位型双层结构载药纳米微球及其制备方法。

背景技术

随着生活水平的提升，人类生存环境变得更加复杂，导致癌症成为越来越迫切需要解决的疾病之一。当前使用最为广泛的抗癌化疗药物治疗存在很多不足之处，例如：溶解性差，无靶向组织选择性，毒性大，以及对正常组织造成不可逆的损伤。因此，控制药物在特殊部位释放的药物载体技术得到越来越多的研究，特别是基于癌症低pH或者高还原性的特殊微环境而设计的纳米药物载体，其中一部分药物制剂已经在临床治疗中使用并且取得了较好的效果。

口服药物是药物治疗最常用的给药体系，其主要有点在于：给药方式简便，成本较低，控制药物缓慢吸收。一系列常用的化疗抗癌药物例如阿霉素、环孢霉素以及顺铂等通过口服体系会使药物活性丧失或者对胃肠道造成极大的不可逆转的毒性。而现阶段研究的药物载体大多数是通过静脉注射的方式使药物进入人体，并没有在口服给药体系取得很大的成果。

最近一些研究发现，羧甲基壳聚糖微球能在胃酸环境下保持稳定，不被强酸环境所损坏，使得内部包载的药物不被释放。并且根据中国海洋大学的研究，羧甲基壳聚糖能通过打开Caco-2细胞之间的紧密连接以及螯合细胞膜上的Ca²⁺，导致在肠道处能有效促进微球的吸收并进入血液。含有原酸酯键的化合物是一类合成材料，由于其具有pH敏感性以及良好的生物相容性和生物可降解性，被广泛应用于药物缓释等领域。基于上述原理，本发明制备了一种内层为原酸酯-聚氨酯与抗癌药物疏水核心，外层为羧甲基壳聚糖涂层的微球，并且加上交联剂以保证羧甲基壳聚糖涂层在生理环境下稳定存在。理论上，外部的羧甲基壳聚糖涂层能在胃部的环境下保护纳米微球不被胃酸损害，而在肠道环境下羧甲基壳聚糖溶解性变好；还能干扰小肠细胞键紧密连接并且通过小肠吸收的尺寸效应吸收纳米药物载体进入血液循环，由于癌症部位的高渗透性和高滞留效应(EPR效应)使得纳米微球会在癌症病灶处富集，最后癌症细胞通过细胞内吞作用使得纳米微球进入细胞，由于癌症细胞的溶酶体低pH特性，原酸酯酸敏感键断裂，纳米微球发生降解作用，将药物快速释放在癌症细胞内，以达到治疗癌症的效果。

发明内容

本发明的目的就是合成一种能够运用于口服的抗癌纳米药物载体聚合物，并将该聚合物与抗癌药物、羧甲基壳聚糖制成双层载药的纳米微球，通过小肠尺寸效应对纳米粒子进行定位吸收，最后通过EPR效应以及癌症细胞的溶酶体低pH特性使得药物在癌症细胞内富集。

为了达到此目的，本发明通过以下技术方案实现：

一种三嵌段共聚物，具体为一种聚(原酸酯-异氰酸酯-己内酯)三嵌段共聚物P(OE-HMDI-CL)，是基于4,4'-二环己基甲烷二异氰酸酯与聚己内酯和原酸酯二羟基单体4,4-二亚甲基氧-二-(2-氨基乙氧基-1，3-二氧戊烷)分步聚合得到的，其中OE表示原酸酯；HMDI表示4,4'-二环己基甲烷二异氰酸酯，CL表示聚己内酯，其数均分子量为530；该三嵌段共聚物的结构如下所示：

n表示整数值1-10，m表示整数值15-100。

一种三嵌段共聚物P(OE-HMDI-CL)的制备方法的具体步骤如下：

步骤一、将2-羟基乙酸乙酯、4，4-二亚甲基-(2-甲氧基-1，3-二氧戊烷)、对甲苯磺酸吡啶盐和无水甲苯按照摩尔体积比(mol/mol/mol/L)＝1：4：0.02：(10-30)加入反应瓶中，在135℃条件下反应5-10小时后，6％的碳酸氢钠溶液萃取2-3次，饱和氯化钠萃取2-3次。然后在氢氧化钠溶液下搅拌6-8h，乙酸乙酯萃取，油泵负压干燥得到原酸酯二羟基单体(HO-OE-OH)，其结构如下所示：

步骤二、将4,4'-二环己基甲烷二异氰酸酯与聚己内酯和无水二氯甲烷按照摩尔体积比(mol/mol/L)＝1:0.5:(2-4)加入到反应瓶中，氮气环境下反应3-5小时后，再次加入摩尔体积比(mol/mol/L/L)为0.5:0.02:1:(2-4)的步骤一制备的原酸酯二羟基单体、二月桂酸二丁基锡、无水三乙胺、无水二氯甲烷，其中4,4'-二环己基甲烷二异氰酸酯与二端羟基原酸酯的摩尔比为1:0.5，继续在氮气环境下反应20-30小时，用无水乙醚沉降2-3次，乙酸乙酯洗2-4次，油泵负压干燥得到聚合物P(OE-HMDI-CL)。

一种口服肠定位型抗癌纳米微球药物载体，包括上述的三嵌段共聚物P(OE-HMDI-CL)以及抗肿瘤药物作为内层，还包括作为外部涂层的羧甲基壳聚糖，以保护内部疏水核心不被胃酸破坏。

所述的抗肿瘤药物选自5-氟尿嘧啶、喜树碱、顺铂、紫杉醇、阿霉素、环孢霉素、卡莫司汀等。

一种双层肠定位型纳米微球药物载体的制备方法如下：将三嵌段共聚物P(OE-HMDI-CL)、抗肿瘤药物，在震荡条件下滴入到4-10％的羧甲基壳聚糖水溶液，超声3-4分钟，加入到0.26-0.3％聚乙烯醇水溶液中，加入一定量的交联剂，室温搅拌3-5小时，10000rpm离心得到目的纳米微球药物载体。

所述的交联剂为戊二醛、乙二醛、聚乙烯醇缩甲醛、醛基化葡聚糖、醛基淀粉等二醛基或者多醛基化合物。

本发明的优点是：

1、引入了生物相容性好的聚己内酯，并且加强载体疏水性，以避免药物在胃部释放。

2、加入生物相容性好的酸敏感性原酸酯，使得纳米微球在羧甲基壳聚糖涂层溶解后药物能控制释放。

3、引入生物相容性好的羧甲基壳聚糖涂层，使得纳米微球在酸性条件下，羧甲基壳聚糖的溶解性不好以保护载药内层。

4、纳米微球可以保护化疗药物通过口服给药体系不被胃肠道损坏，增加药物利用范围。

附图说明

图1为三嵌段共聚物聚(原酸酯-异氰酸酯-己内酯)P(OE-HMDI-CL)的¹H>

图2为口服肠定位型纳米微球载体A制备后电位随pH的变化趋势图。

图3为口服肠定位型纳米微球载体A平均粒径以及透射电镜观察的形貌图。

图4为实施例6中的载阿霉素纳米微球对应pH为8.0、7.4和5.0的磷酸盐缓冲溶液的药物释放结果图。

图5为实施例7中的载阿霉素纳米微球对应肠或胃模拟液的药物释放结果图。

图6为实施例8中小鼠口服不同剂量的纳米微球载体A后体重的变化检测图。

图7为实施例9中小鼠口服不同剂量的纳米微球载体A后血浆生化指标变化的结果图。

图8为实施例10的小鼠口服载阿霉素纳米微球后体内药物分布图。

图9为实施例11中肝癌小鼠分别口服阿霉素、包载阿霉素的纳米微球以及生理盐水7天后，肿瘤的重量变化对比图。

图10为实施例12中肺癌小鼠口服包载阿霉素的纳米微球7天后，心脏与肿瘤的石蜡切片观察结果图。

具体实施方式

实施例1三嵌段共聚物P(OE-HMDI-CL)的制备

在氮气环境下，向50mL的圆底反应瓶中依次加入0.29g(0.55mmol)分子量为530的聚己内酯，0.29g(1.10mmol)分子量为262.35的4,4'-二环己基甲烷二异氰酸酯以及2mL的二氯甲烷，磁力搅拌下反应4小时后，再次加入2mL的二氯甲烷以及0.17g(0.55mmol)分子量为310.3的原酸酯二羟基单体，室温下反应24小时，用无水乙醚沉降3次，乙酸乙酯洗3次，油泵负压干燥得到聚合物P(OE-HMDI-CL)0.69g，产率90.17％。¹H>3，δ，ppm)：0.78-1.48(m，12H，CH₂-CH₂-CH)，1.49-1.79(m，12H，CH₂)，1.92-2.09(d，4H，NH-CH-CH₂)，2.24-2.45(m，4H，O-CO-NH)，3.32-3.47(s，2H，NH-CH)，3.49-3.90(m，12H，O-CH₂)，3.91-4.12(m，8H，CH₂-O-CO)，4.16-4.28(m，8H，O-CH₂-CH₂-O)，4.29-2.39(d，2H，O-CH)，4.45-5.03(m，2H，OOC-NH)，5.80-5.92(d，2H，CH(O)₃)，见图1。所有核磁峰的位置以及面积积分比均正确，表明该聚合物被正确合成。

称取2mg的聚合物用1mL的DMF溶解并保证聚合物浓度为2mg/mL，用孔径为0.45μm有机相滤头过滤后，通过Waters 1515GPC检测聚合物的分子量及其分布，其中以DMF为流动相，流速为1mL/min，进样体积为60μL，结果见表1。

表1

实施例2口服肠定位型双层纳米微球载体A的制备

将40mg的实施1制备的三嵌段聚合物加入到2ml二氯甲烷中充分溶解后，在涡旋的条件下加入到10mL的5％的羧甲基壳聚糖溶液中，然后立即超声(3次，每次10秒，间隔5秒,功率300W)，超声后立即加入到20mL的0.3％的聚乙烯醇溶液中，然后加入5μL戊二醛，室温下搅拌3h，使二氯甲烷挥发，在10000rpm下，离心10min，得到的产物分别分散在pH＝1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5、7.4、8.5、9.5的磷酸缓冲液中，用DLS测量电位变化趋势，结果见如图2，此结果与羧甲基壳聚糖的pKa值吻合，表明羧甲基壳聚糖涂层成功制备。将离心后得到的产物用0.01M pH8.0的缓冲液再分散后，得到纳米药物载体A。通过DLS和透射电镜检测纳米载体的粒径分布及形貌，结果如图3。制备得到的纳米微球粒径为355.8nm，很适合通过小肠尺寸效应吸收进入血液。

实施例3口服肠定位型双层纳米微球载体B的制备

将40mg实施例1制备的三嵌段聚合物加入到2mL的二氯甲烷中充分溶解后，在涡旋的条件下加入到10mL的4％的羧甲基壳聚糖溶液中，然后立即超声(3次，每次10秒，间隔5秒,功率300W)，超声后立即加入到20mL的0.3％的聚乙烯醇溶液中，然后加入5μL乙二醛，室温下搅拌3h，使二氯甲烷挥发。在10000rpm下，离心10min，用0.01M pH8.0的缓冲液再分散后，得到纳米药物载体B。

实施例4口服肠定位型双层纳米微球载体C的制备

将40mg实施例1制备的三嵌段聚合物加入到2mL的二氯甲烷中充分溶解后，在涡旋的条件下加入到10mL的6％的羧甲基壳聚糖溶液中，然后立即超声(3次，每次10秒，间隔5秒,功率300W)，超声后立即加入到20mL的0.3％的聚乙烯醇溶液中，然后加入10μg醛基淀粉，室温下搅拌3h，使二氯甲烷挥发。在10000rpm下，离心10min，用0.01M pH8.0的缓冲液再分散后，得到纳米药物载体C。

实施例5包载阿霉素的口服肠定位型双层载药纳米微球A的制备

将40mg实施例1制备的三嵌段聚合物以及8mg的阿霉素加入到2mL的二氯甲烷中充分溶解后，在涡旋的条件下加入到10mL的5％的羧甲基壳聚糖溶液中，然后立即超声(3次，每次10秒，间隔5秒,功率300W)，超声后立即加入到20mL的0.3％的聚乙烯醇溶液中，然后加入5μL戊二醛，室温下搅拌3h，使二氯甲烷挥发。在10000rpm下，离心10min，用0.01M pH 8.0的磷酸缓冲液再分散，4℃冰箱中保存。其包封率和载药量见表2，其中包封率和载药量的计算公式如下：

载药量(％)＝纳米粒子中阿霉素质量/投入的纳米粒子质量×100％

包封率(％)＝纳米粒子中阿霉素质量/总投入的阿霉素质量×100％

表2

其中NP/DOX表示包载阿霉素后的纳米微球。

实施例6纳米微球药物载体A包载阿霉素后的体外释放检测

以实施例2制备的纳米微球载体A负载阿霉素，制成阿霉素浓度为500μg/mL的双层载药纳米粒子，取1mL的载药纳米粒子置于8kD-14kD的透析袋中，放入到含有10mL的pH分别为7.4、5.0、1.0的磷酸缓冲液的EP管中，设3个重复，在37℃，100rpm条件下振荡，分别在1、2、3、4、5、6、12、24、48、72小时后取出缓冲液，并加入新的缓冲液，然后检测缓冲液中的阿霉素浓度，计算阿霉素的释放量，释放结果如图4。在pH＝1的条件下，双层纳米微球的释放很缓慢，足以表明羧甲基壳聚糖涂层能够在胃酸条件下通过溶解性的变化保护载药内层。

实施例7载药纳米微球的体外模拟口服体系的药物释放检测

取实施例6中的载药纳米粒子1mL置于8kD-14kD的透析袋中，放入到含有10mL肠或胃部模拟液的EP管中，设3个重复，在37℃，100rpm条件下振荡，分别在1、2、3、4、5、6、8、10、12小时后取出缓冲液，并加入新的缓冲液，然后检测缓冲液中的阿霉素浓度，计算阿霉素的释放量，结果如图5所示。通过体外实际模拟体内环境，得到两层载药纳米微球能在胃部稳定存在并且不释放过多药物损害胃肠道。

实施例8小鼠口服纳米微球载体A后体重变化实验

将32只ICR小鼠(25g)随机分为4组后，将实施例2制备的纳米微球载体A和小鼠按照质量比为50、300、2000(mg/kg)的剂量进行灌胃，生理盐水组作为对照，在连续14天内对小鼠的体重情况进行统计，结果如图6，saline表示对照组，NP表示服用纳米微球载体A实验组。各种不同剂量的纳米微球载体A对小鼠的生长并没有抑制效果，表明双层载药纳米微球拥有很好的生物相容性。

实施例9小鼠口服纳米微球载体A后血浆生化指标变化

将32只ICR小鼠(25g)随机分为4组后，将实施例2制备的纳米微球载体A和小鼠按照质量比为50、300、2000(mg/kg)的剂量进行灌胃，生理盐水组作为对照，正常饲养14天后，取出血液，进行血常规实验，对小鼠血浆生化指标(血浆总蛋白，尿素氮，肌酐，谷草转氨酶，乳酸脱氢酶)进行检测，结果如图7。

实施例10小鼠口服包载阿霉素的纳米微球后体内药物分布实验

将18只小鼠通过灌胃分别注入由实施例2制备的纳米微球载体A与阿霉素按照相对浓度为10mg/kg制成的载药微球，另取3只小鼠注入生理盐水作为对照。在2、4、8、12、24、48小时后通过眼球取血，并且处死小鼠，分别取出各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾、肠和胃，分别称重后加入萃取液(0.3M的盐酸乙醇溶液)浸泡48小时，用组织匀浆机使得液体分布均匀，在5000rpm下离心10分钟，测出每组阿霉素含量结果如图8。由结果得到双层载药纳米微球相比于阿霉素药物能明显降低药物在心脏中的富集，并且在肝脏分布明显较高，考虑下一步建立H22小鼠肝癌模型验证口服药物载体的实际抗癌效果。

实施例11肝癌小鼠口服包载阿霉素的纳米微球治疗后肿瘤抑制实验

随机取肿瘤大小类似的肝癌小鼠(H22肿瘤小鼠模型)，每天使用实施例10所述的阿霉素含量为10mg/kg的载药纳米微球、剂量为10mg/kg的阿霉素以及生理盐水作为对照分别对小鼠进行治疗，分别在治疗3、5、7天后取出肿瘤称重，结果如图9。结果表明相比于阿霉素，双层纳米药物载体拥有更好的抗癌效果，可能是由于直接口服阿霉素会产生首过效应，而载药微球能在小肠部位吸收进入血液形成稳定并长期的血药浓度。

实施例12肝癌小鼠口服包载阿霉素的纳米微球治疗后切片实验

随机取肿瘤大小类似的肝癌小鼠(H22肿瘤小鼠模型)，每天用实施例10所述的阿霉素含量为10mg/kg的载药微球对肝癌小鼠进行治疗，在治疗7天后，处死小鼠，取出心脏、肿瘤制备成组织切片后在倒置显微镜下观察，结果如图10。由切片结果得到双层口服纳米药物载体拥有很好的癌症细胞杀伤力以及几乎没有造成心脏毒性。