一种含有阻拒层的金属螯合亲和层析介质

摘要

本案涉及一种含有阻拒层的金属螯合亲和层析介质，以大孔二氧化硅微球为内核，在微球的孔道内填充有由海藻酸钠、壳寡糖、氮化硅三种组分构成的混合物，在内核表面键合环氧氯丙烷，环氧氯丙烷连接配基，配基络合金属离子；同时在内核表面粘附直链淀粉形成阻拒层，环氧氯丙烷与直链淀粉的质量比为1∶4～5；本发明通过阻拒层实现了对非特异性大分子的阻隔，减少了非特异性吸附，提高了对目标小分子多肽的吸附分离效率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种层析介质，具体涉及一种含有阻拒层的金属螯合亲和层析介质。

背景技术

近年来，生物技术不断进步，快速有效的从复杂天然混合物中分离、提纯多肽逐渐成为开发新型药物的关键与难点。因此，是否能够对多肽进行高效稳定的分离纯化，成为了多肽研究与应用的前提和基础。随着层析技术的迅速发展，固定化金属螯合亲和层析作为高效的分离技术，可以应用于多肽的分离纯化。

固定化金属螯合亲和层析是一种基于金属离子与氨基酸残基配位作用实现分离的技术，由于具有分离速度快，操作简单等诸多优点，自提出以来便成为分离纯化蛋白的强有力方法，被广泛应用于蛋白质、核酸、多肽等的分离纯化中。然而，实际应用中，当需要从混合体系中分离多肽等目标小分子时，由于存在大分子非特异性吸附的影响，导致目标小分子的吸附位点减少，从而降低对目标小分子的吸附性能。因此需要对亲和层析介质进行一定的修饰改性，以便达到阻拒大分子，降低大分子的非特异性吸附，提高目标小分子的吸附。现有技术中通过在亲和介质基质表面枝接亲水性物质聚乙二醇(PEG)，以形成半渗透保护屏障对大分子杂蛋白进行体积排阻，从而提高对小分子多肽的分离纯化效率，但是该方法需要提前将PEG的端羟基转化为醛基、羧基、卤素、氨基等活性基团才能枝接其于基质，工艺繁琐，而且在含有大分子杂蛋白的体系中对目标小分子多肽的特异性分离效果不甚理想。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种含有阻拒层的金属螯合亲和层析介质。

本发明的技术方案概述如下：

以大孔二氧化硅微球为内核，在大孔二氧化硅微球的孔道内填充有由海藻酸钠、壳寡糖、氮化硅三种组分构成的混合物，在内核表面键合环氧氯丙烷，环氧氯丙烷连接配基，配基络合金属离子，同时内核表面粘附有直链淀粉形成阻拒层，其中，所述环氧氯丙烷与直链淀粉的质量比为1∶4～5。

优选的是，所述混合物中海藻酸钠、壳寡糖、氮化硅的质量分数分别为：

海藻酸钠50～55wt％；

壳寡糖40～45wt％；

氮化硅3～5wt％。

优选的是，所述大孔二氧化硅与复合物的质量比为1∶4～5。

优选的是，所述直链淀粉的聚合度为900～1000。

优选的是，所述大孔二氧化硅微球的粒径在50～100μm，孔道内径大于50nm。

优选的是，所述配基为亚氨基二乙酸、三羟甲基乙二胺、次氨基三乙酸中的一种。

优选的是，所述金属离子为Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Co²⁺中的一种。

本发明的有益效果是：本案选用孔径大于50nm的大孔二氧化硅微球作为内核，具有较大的内表面积和孔隙比，可以较多吸附填充海藻酸钠等混合物；海藻酸钠对二氧化硅具有很好的粘结吸附作用，可以增加混合物对二氧化硅的粘结强度，使内核结构紧密坚实；壳寡糖富含氨基、羟基等活性基团，为键合直链淀粉或者环氧氯丙烷提供连接基团；氮化硅硬度大，能够有效增强亲和层析介质的机械性能和耐压性能。

本发明所采用的直链淀粉是以螺旋形构成的长链多糖，聚合度为900～1000，每一螺旋回转包含6个葡萄糖基，由于直链淀粉富含羟基且粘性较大，不需要经过基团修饰就能够通过与壳寡糖相互粘结或者与环氧氯丙烷发生键合而固定于微球内核表面，形成柔性屏障，控制适当的直链淀粉密度可以有效实现对非特异性大分子的阻隔，通过对大分子杂蛋白进行体积排阻减少非特异性吸附，提高对目标小分子多肽的吸附分离效率。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。本发明提供了一种含有阻拒层的金属螯合亲和层析介质，通过下述实施例以及对比例具体阐述。

实施例1

制备过程如下：

(1)将20g粒径在50～100μm、孔径大于50nm的大孔二氧化硅微球浸泡在0.5mol/L的氢氧化钠溶液中，在50～55℃下搅拌1～1.5小时使大孔二氧化硅微球活化，真空干燥12小时；

(2)向60g海藻酸钠、54g壳寡糖、6g氮化硅、10g氢氧化钠的混合物中加入250mL体积分数为30％的丙酮溶液，剧烈搅拌并超声形成均匀的悬浮液；将大孔二氧化硅微球从真空干燥炉中取出后迅速置于该悬浮液中，在45～50℃下搅拌8～10小时，过滤后用去离子水冲洗并干燥得到填充有混合物的大孔二氧化硅微球内核；

(3)向步骤(2)所得微球内核中加入50mL丙酮、15g环氧氯丙烷和5g氢氧化钠，在35～40℃下搅拌3～4小时，反应结束后洗涤干燥，得到表面键合环氧氯丙烷的活化微球内核；

(4)将10g次氨基三乙酸、70g直链淀粉、8g氢氧化钠在50～55℃下溶解于250mL质量分数为30％的乙醇溶液中，搅拌均匀形成混合溶液；将步骤(3)所得的活化微球内核置于该混合溶液之中，在50～55℃下搅拌反应6～8小时，反应结束后过滤并洗涤干燥；

(5)将步骤(4)所得微球浸泡于1mol/L的醋酸铜溶液，用醋酸调节溶液pH为4～4.5，在40℃下搅拌12小时，过滤并用去离子水洗涤三次得到具有直链淀粉阻拒层的金属螯合亲和层析介质。

实施例2

制备过程如下：

将实施例1的步骤(5)中醋酸铜溶液用相同浓度的醋酸镍代替，其余制备过程与实施例1相同。

对比例1

制备过程如下：

实施例1步骤(4)中不加入直链淀粉，其余制备过程与实施例1相同。

对比例2

制备过程如下：

将实施例1步骤(4)中的70g直链淀粉用相同质量的醛基化聚乙二醇(PEG)代替，其余制备过程与实施例1相同。

对比例3

制备过程如下：

将实施例1步骤(2)中海藻酸钠被相同质量的葡聚糖代替，其余制备过程与实施例1相同。

对比例4

制备过程如下：

将实施例1步骤(2)中不加入壳寡糖，同时加入海藻酸钠质量为110g，其余制备过程与实施例1相同。

实施例5

市售螯合铜离子的金属螯合亲和层析介质。

为了测试本发明所制备的金属螯合亲和层析介质对小分子多肽的亲和吸附效率，以及对大分子蛋白质的阻拒效果，这里将牛清血蛋白BSA作为大分子蛋白质模型，它由583个氨基酸残基构成，存在多种容易与金属离子螯合的氨基酸序列，是需要除去的大分子蛋白质杂质；以α-乳清蛋白水解物中的一个多肽片段VSLPEW(Val-Ser-Leu-Pro-Glu-Try)作为目标小分子多肽，其中该小分子多肽具有良好的降血压功能，VSLPEW多肽中氨基氮或者羧基氧能够与铜离子螯合，从而实现分离；在从实际的发酵或者酶解体系中提取VSLPEW多肽时，类似于BSA的大分子蛋白质常常会作为非特异性杂质吸附于亲属螯合亲和层析柱，影响对目标小分子多肽的纯化效果；采用本发明所制备的含有阻拒层的金属螯合亲和层析介质可以通过体积排阻减少对大分子蛋白质的非特异性吸附。

首先配制pH为6.5的浓度为0.2mol/L的磷酸氢二钠、磷酸二氢钠溶液作为缓冲溶液，用该缓冲溶液配制VSLPEW多肽浓度为0.05mg/mL的溶液，调节BSA的量，分别配制VSLPEW与BSA浓度比为1∶5(混合液A)、1∶10(混合液B)、1∶100(混合液C)的一组混合溶液；分别将20mg实施例1～2和对比例1～5所得的金属螯合亲和层析介质置于5mL离心管中，加入3mL混合蛋白溶液，在摇床中30℃恒温震荡50min，磁吸亲和层析介质，取上清液，用0.22μm的纤维膜过滤，并用高效液相色谱对上清液定量测试，取两次平行操作的平均数。表1记录了各亲和层析介质对混合溶液A～C亲和吸附后，上清液中VSLPEW与BSA各自的浓度，上清液中VSLPEW或者BSA的浓度越小，说明所制备的金属螯合亲和层析介质对其吸附越多；同时，两者的浓度相差越大，说明亲和层析介质的选择吸附性越强。

对于不同浓度比的混合溶液亲和吸附后，对实施例1的测试而言，上清液中目标小分子多肽VSLPEW的浓度均减少了约0.0400mg/mL，杂质大蛋白BSA的浓度仅减少了约0.0030～0.0123mg/mL，说明实施例所制备的亲和层析介质能够选择性的吸附小分子多肽VSLPEW，通过实施例2的实验数据能够得出一致的结论，由于镍离子对VSLPEW的螯合性能较铜离子弱，所以实施例2的上清液中所测得VSLPEW浓度较实施例1中大；更进一步，亲和层析介质对比例1中没有加入直链淀粉，它的上清液中VSLPEW的浓度仅减少了约0.0070mg/mL，BSA的浓度反而减少了约0.0500～0.0700mg/mL，对比例1的亲和层析介质主要吸附了杂质大蛋白分子，对目标小分子多肽的选择性吸附极弱，这说明直链淀粉的加入在亲和层析介质表面形成了能够有效阻隔大分子蛋白质的阻隔层，实现对小分子多肽的选择性吸附；根据实施例5，市售亲和层析介质难以实现对大分子蛋白质的阻隔，不能选择性吸附目标小分子蛋白质。

对比例2采用醛基化聚乙二醇构建阻隔层，也能实现对目标小分子蛋白质的选择性吸附，但是分离效果较实施例2差，对比例2上清液中的VSLPEW浓度减少量约为BSA浓度减少量的2～4倍，并且随着混合溶液中BSA浓度的增加，对两者的分离效果变差；对比例3和对比例4中的上清液中VSLPEW浓度高于实施例1中的VSLPEW浓度，说明对比例3和对比例4的亲和层析介质对VSLPEW亲和吸附性能较差，这与大孔二氧化硅微球中所填充的混合物有关，海藻酸钠、壳寡糖以及氮化硅作为填充物，能够有效增加金属螯合亲和层析介质中金属配基的量，从而吸附较多的目标蛋白。

表1

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。