基于CILLC‑MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法

摘要

本发明涉及胎盘来源间充质干细胞代谢物的萃取及检测技术，旨在提供一种基于CILLC‑MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法。本发明通过萃取、检测GFP基因转染前后的hPMSCs的胞内代谢物，并对其进行定量，深入分析转染前后的差异性代谢物及差异性代谢途径，从代谢组学角度评估绿色荧光蛋白用于标记和示踪间充质干细胞的生物安全性。本发明首创比较hPMSCs与GFP+hPMSCs代谢组学差异的分析流程，将两种样品制备方法结合用于干细胞代谢物萃取，使细胞内代谢物充分释放。结合CIL LC‑MS用于干细胞胞内代谢物检测，实现了胞内代谢物的精准定量分析，并大大增加代谢产物的鉴定种类。本发明极大地提高了结果的灵敏性，可靠性和重复性，避免了操作上引起的不平行性及偶然性。

说明书

发明领域

本发明涉及胎盘来源间充质干细胞代谢物的萃取及检测技术，特别涉及基于同位素标记液相色谱-质谱联用(CIL LC-MS)的评价绿色荧光蛋白基因转染对胎盘来源间充质干细胞代谢组学影响的方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)作为干细胞家族的重要成员，是一种成纤维样、具有高度可塑性和自我更新能力、并能向多种终末细胞分化的多能干细胞。胎盘为临床废弃物，其胎盘来源间充质干细胞(human placental mesenchymal stem cells,hPMSCs)具有来源丰富、分离方法简便、增殖能力强、低免疫原性、无伦理学限制等优点，已经逐步成为干细胞移植治疗的优势种子细胞。

在再生医学中，绿色荧光蛋白因其光毒性弱、相容性好常被用于标记和示踪细胞，以评估移植细胞在体内的分布及存活情况。但在应用于临床前，需要充分研究绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因转染是否对间充质干细胞的基因组学、转录组学、蛋白组学、代谢组学产生影响以满足不同的需求。既往研究已证实GFP基因转染对胎盘来源的间充质干细胞的存活及分化潜能无显著影响。但是否对代谢组学产生影响，由于间充质干细胞代谢物萃取效率低、检测灵敏性低等原因至今尚未证实。

要研究不同组别细胞代谢水平的变化，必须包含尽可能多的代谢途径，因而是否成功萃取代谢物并检测到大量的代谢产物是关键。目前，有很多方法可以应用于哺乳类贴壁细胞代谢组学分析的样品制备。例如9/1v/v甲醇/三氯甲烷(MeOH/CHCl₃)方法或1/1v/v甲醇/水(MeOH/H₂O)方法。根据检测到的匹配峰(peak>

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种基于CILLC-MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法，该方法属于新的间充质干细胞胞内代谢物的萃取及检测方法。

为解决技术问题，本发明是通过以下的技术方案实现的：

提供一种基于CILLC-MS的评价GFP基因转染对hPMSCs代谢组学影响的方法，包括以下步骤：

(1)人胎盘来源间充质干细胞的分离培养与转染

hPMSCs的分离培养：无菌条件下取临床废弃的新鲜胎盘组织，用PBS充分洗涤去血渍后，剪弃胎盘组织表面的膜。将剩下的胎盘组织剪碎，以0.2％四型胶原酶消化，37℃消化1h，过滤，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，收集消化液和冲洗液；洗涤细胞沉淀后，用MSCs专用培养基重悬，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱进行常规培养；

GFP转染hPMSCs：当常规培养的hPMSCs的融汇率达50％时，加入商品化重组慢病毒悬液进行转染；转染后继续培养24h，然后用新的培养基换掉旧培养基继续培养3-4d，再加入10μg/mL的嘌呤霉素进行筛选：未转染成功的hPMSCs死亡，成功转染GFP的hPMSCs存活，从而得到表达GFP的胎盘MSCs；

(2)代谢物的提取

将表达GFP的胎盘MSCs传代至3-5代后，去旧培养基并清洗细胞表面，淬灭；分别以9/1体积比的甲醇/三氯甲烷溶剂和1/1体积比的甲醇/水溶剂萃取，刮下细胞，行超声辅助破碎，离心取上清的代谢物，浓缩干燥仪冻干后备用；

(3)同位素标记

取出冻干后的代谢物，加水溶解后，加乙腈和碳酸钠/碳酸氢钠；然后用¹²C-丹磺酰氯标记轻链，用¹³C--丹磺酰氯标记重链，水浴行标记反应；加氢氧化钠和甲酸中和反应，离心后进行定量；

(4)液相色谱-紫外广谱定量

基于液相色谱-紫外广谱联用技术进行梯度洗脱，设定样品管理器的温度、进样方式、柱温、优化流动相的组成、溶剂的比例和洗脱梯度的陡度，使各个色谱峰之间达到最佳的分离；

(5)液相色谱-质谱联用方法鉴定

实验所用的hPMSCs与GFP标记后hPMSCs各6份，将最后得到的样品每个等分，其中一部分标记¹²C-丹磺酰氯，另一部分标记¹³C-丹磺酰氯；根据LC-UV定量结果，将同一种萃取方法，不同类型细胞的¹²C-丹酰氯化物标记的轻链与¹³C-丹酰氯化物标记的重链1:1混合上机；

检测样本之前，空白、检测样本、质控样本连续进样，考察LC-MS的重复性和稳定性；每检测4个目的样品检测一次空白、检测样本、质控样本，以此交替进行；

(6)数据处理

用R-based in-house软件对检测分析得到的原始数据进行预处理，得到包含保留时间、质荷比和峰强度的三维矩阵表；

将三维矩阵表导入到SIMCA-P 15.0软件进行多元数据分析，通过主成成分分析、偏最小二乘判别、火山图来进行代谢数据分析；基于丹酰氯化物标记标注数据库和人类代谢组学数据库、代谢物数据库鉴定代谢物，基于MetaboAnalyst数据库及KEGG数据库分析差异性代谢途径。

本发明所述步骤(4)中，设定样品管理器的温度4℃；进样方式：Partial Loop进样，2μl；柱温：45℃；流动相A：水/甲酸(99.9:0.1,v/v)，流动相B：乙腈/甲酸(99.9:0.1,v/v)；流速：500uL/min；梯度洗脱程序开始时为85％A和15％B，该浓度比例保持1min后，在0.01min内变至2％A和98％B，维持浓度比例1min后，在0.5min内降至85％A和15％B，这个浓度比例维持3.5min。

发明原理描述：

本发明涉及一种基于同位素标记液相色谱-质谱联用(CIL LC-MS)的方法来评价绿色荧光蛋白(GFP)基因转染和表达对人胎盘来源间充质干细胞(hPMSCs)代谢组学影响的方法。本发明通过采用新的技术手段成功萃取、检测GFP基因转染前后的hPMSCs的胞内代谢物，并对其进行定量，深入分析转染前后的差异性代谢物及差异性代谢途径，从代谢组学角度评估绿色荧光蛋白用于标记和示踪间充质干细胞的生物安全性，为细胞疗法提供了一种研究胞内代谢组学的新方法。

考虑到不同的混合溶剂中代谢产物的溶解性有差异，发明人使用9/1MeOH/CHCl₃(方法一)或1/1MeOH/H₂O(方法二)为提取溶剂，根据检测到的匹配峰，方法二明显高于方法一，韦恩图提示有交集但特异性显著。故本发明将方法一和方法二结合用于GFP基因转染前后细胞代谢物的萃取，相较单用一种方法或使用ACN或MeOH/ACN而言改善了萃取效率欠佳的问题，并在高速离心破碎细胞的基础上加用超声波协助，使细胞充分破碎，胞内代谢物充分释放。

液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)是研究胞内代谢的常用方法，但该技术的重复性和敏感性不佳，且缺乏对代谢产物的精准定量。近年来出现的化学同位素标记的色谱-质谱联用(CIL LC-MS)克服了传统的液相色谱-质谱联用技术的上述缺点，CIL LC-MS在传统基础上，结合¹³C/¹²C-DNS标记技术，从传统的HMDB、EML代谢物鉴定库，到dansyl>

本发明结合CIL LC-MS提出了对于GFP基因转染前后胎盘来源间充质干细胞的代谢组学的分析流程，尤其是前期的样品制备和后期的胞内代谢物检测，在此基础上一方面可以分析间充质干细胞胞内代谢，了解细胞已经发生的生物活动，另一方面对其定量可以比较hPMSCs与GFP⁺hPMSCs代谢组学的差异，评估GFP基因转染对胎盘来源间充质干细胞代谢组学的影响。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、本发明首次创建比较hPMSCs与GFP+hPMSCs代谢组学差异的分析流程，通过将9/1MeOH/CHCl₃和1/1MeOH/H₂O两种不同的样品制备方法结合用于干细胞代谢物萃取，在高速离心破碎细胞的基础上加用超声波协助，使细胞充分破碎，胞内代谢物充分释放。

2、本发明结合CIL LC-MS用于干细胞胞内代谢物检测，引入同位素内标，从传统的HMDB、EML代谢物鉴定库，到dansyl standard library数据库的增加，实现了胞内代谢物的精准定量分析，并大大增加代谢产物的鉴定种类。

3、本发明极大地提高了结果的灵敏性，可靠性和重复性，避免了操作上引起的不平行性及偶然性。

具体实施方式

首先说明：本发明中利用的胎盘组织是临床废弃物，直接来源于产妇生产所在医疗机构。本发明的内容基于对新鲜胎盘组织的利用，但并不直接涉及取出或切除胎盘组织的操作。

下面结合具体实施例子，对本发明的技术方案详细描述。

比较hPMSCs与GFP⁺hPMSCs之间的代谢组学差异

(一)间充质干细胞的分离培养与转染

hPMSCs的分离培养：

无菌条件下将临床废弃的新鲜胎盘组织用PBS充分洗涤去血渍后，剪弃胎盘组织表面的膜。将剩下的胎盘组织剪碎至碎末状，置于0.2％四型胶原酶中消化，37℃消化1h，过滤，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，收集消化液和冲洗液，PBS重复洗涤细胞2次。用MSCs专用培养基重悬，根据细胞量接种于T25培养瓶中，置于37℃、5％CO₂饱和湿度培养箱中，进行常规培养及传代。

hPMSCs的转染：

常规培养的hPMSCs融汇率达50％时，按感染复数(MOI)为100加入重组慢病毒(Lentivirus)悬液进行转染，培养24h后用新的培养基换掉旧培养基继续培养，通常48h后可见荧光，3-4d后10μg/ml嘌呤霉素进行筛选，未转染成功的hPMSCs死亡，成功转染GFP的hPMSCs存活，从而得到表达GFP的胎盘MSCs(GFP⁺hPMSCs)。

重组慢病毒悬液(慢病毒载体)是以人类免疫缺陷I型病毒为基础发展起来的基因治疗载体，慢病毒核蛋白质前整合复合物具有噬核特性，病毒基因组运输至细胞核，从而使慢病毒可以感染和在非有丝分裂细胞中复制。本发明的重组慢病毒悬液是市购商品，购自上海吉凯基因科技有限公司，官方网址：www.genechem.com.cn，感染复数为100。)

(二)代谢物的提取

使用9/1MeOH/CHCl₃萃取法

1、GFP⁺hPMSCs常规培养于T175培养瓶，传代至3-5代。

2、去旧培养基，用37℃预热的超纯水20ml/瓶快速清洗细胞表面。

3、在5s内用液氮(LN₂)15ml/瓶淬灭。

4、每瓶加入3ml预冷的9/1MeOH/CHCl₃萃取。

5、细胞刮刮下细胞，转移至15ml离心管，行超声波协助使细胞充分破碎。

6、分装至1.5ml离心管，16100g 4℃离心10min，取上清，浓缩干燥仪冻干上清，存于-40℃备用。

使用1/1MeOH/H₂O萃取法

1、GFP⁺hPMSCs常规培养于T175培养瓶，传代至3-5代。

2、去旧培养基，用37℃预热的超纯水20ml/瓶快速清洗细胞表面。

3、每瓶立即加入-20℃1/1MeOH/H₂O>

4、细胞刮刮下细胞，转移至15ml离心管，行超声波协助使细胞充分破碎。

5、分装至1.5ml离心管，16100g 4℃离心10min，取上清的代谢物，浓缩干燥仪冻干上清，存于-40℃备用。

(三)代谢物衍生化标记

1、取出冻干后的代谢物，加50ul水溶解，震荡混匀后，12000rpm离心15min。

2、加入25ul ACN，加入15ul NA₂CO₃/NAHCO₃(0.5mol/L,pH>

3、加入50ul>12C-丹磺酰氯：ACN＝20mg/ml标记轻链接，50ul>13C-丹磺酰氯：ACN＝20mg/ml标记重链，震荡混匀后，离心10-15s。

4、水浴锅60℃，60min行丹酰化反应。

5、加入10ulNAOH(250mM)消耗多余的丹酰氯化物，震荡混匀，离心后60℃，水浴10min。

6、加入50ul(1％FA甲酸：10％(ACN:水＝1:1)425mM)中和多余氢氧化钠。

7、震荡混匀，14000rpm离心15min后，取10ul¹²C-丹酰氯化物标记的进行LC-UV定量分析。

(四)LC-UV定量

本实验中设定液相色谱条件如下：

1.使用Agilent 1290超高效液相色谱仪(带有光电二极管阵列检测器，用于338nm定量吸收)，ACQUITY UPLC BEH C18分析柱(2.1×100mm,1.7μm,pore size WatersCo.)进行色谱分离。

2.样品管理器的温度：设定在4℃

3.进样方式：Partial Loop(质谱机器菜单上的一种进样方式)，2μl

4.柱温：45℃

5.流动相A：水/甲酸(99.9:0.1,v/v)

流动相B：乙腈/甲酸(99.9:0.1,v/v)

流速：500uL/min

液相色谱条件中的柱温、流速对色谱峰的影响不大，主要应该优化流动相的组成、溶剂的比例和梯度的陡度，从而使各个色谱峰之间达到最佳的分离，优化条件如下：

梯度洗脱程序开始时为85％A和15％B，这个浓度比例保持1min后，在0.01min内变至2％A和98％B，维持浓度比例1min后，在0.5min内降至85％A和15％B，这个浓度比例维持3.5min。

(五)LC-MS鉴定

实验所用的hPMSCs与GFP标记后hPMSCs皆为生物样本重复3次，将最后得到的样品每个等分，其中一部分标记¹²C，另一部分标记¹³C。根据LC-UV定量结果，将同一种萃取方法，不同类型细胞的¹²C-丹酰氯化物标记的轻链与¹³C-丹酰氯化物标记的重链1:1混合上机。

实验中设定液相色谱-质谱条件如下：

1.使用Agilent 1290UPLC系统，配备Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈分析柱(2.1mm×10cm,1.7μm>

2.离子源条件设定如下：

nitrogen nebulizer gas(氮气雾化器气压):1.38Bar

dry gas flow:5L/min(干燥气体流量)

dry temperature(干燥温度):325℃,

capillary voltage(毛细管电压):4000V

end plate offset(端板偏移电压):120V

mass range(质量范围):m/z up to 1700

spectra rate(光谱率):1Hz.

resolving power(分辨能力)：11000,FWHM at m/z 622.

正离子模式下获取质谱波谱。

3.梯度洗脱程序开始时为85％A和15％B，2min时仍为85％A和15％B，15min线性变化为55％A和45％B，20min后，变至35％A和65％B，26min时变至2％A和98％B，这个浓度比例保持3min后，再在0.1min内回到85％A、15％B。

4.开始检测样本之前，BLANK、AA、QC样本连续进样3次，考察UPLC-MS的重复性和稳定性。若仪器重复性好，则开始检测目的样本。每检测4个目的样品检测一次BLANK、AA、QC样本，以此交替进行。

(六)数据分析处理及差异性物质的鉴定

1、用R-based in-house软件IsoMS(Guo and Li,2009)对UPLC-MS检测分析得到的原始数据进行预处理，经过滤噪、峰识别、峰提取、峰对齐和归一化，zero-fill program代替缺失值后，对数据进行相应的中心化、缩放、转换，得到包含保留时间、质荷比和峰强度的三维矩阵表。

2、将三维矩阵表导入到SIMCA-P 15.0(Umetrics,Umea,瑞典)软件进行多元数据分析，通过主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别(PLS-DA)、火山图等分析代谢数据。首先，用PCA对包括QC样本在内的所有样本的数据进行分析，以验证UPLC-MS检测的可靠性，获得总体变化趋势，hPMSCs组与GFP⁺hPMSCs组间未能很好的分离。为了进一步区分hPMSCs与GFP⁺hPMSCs的组间差异，采用PLS-DA、OPLS、Volcano>

3、本实验共检测到1151个peak pairs，根据精确的质荷比到HMDB、EML数据库和dansyl standard library进行搜索，并根据保留时间进行甄选。将可能物质的标准品和需要鉴定的物质进行保留时间和MS/MS离子碎片模式进行对比，从而最终确定物质739个，包括差异性物质11个。通过检索代谢物谱图库以及与本实验室建立的标准品谱库进行对比的方法来鉴定有生物学意义的代谢物5个。

4、基于MetaboAnalyst(www.metaboanalyst.ca)及KEGG数据库对差异性代谢物、差异性代谢途径进行分析。涉及到九条代谢途径，由于差异性代谢物(牛磺酸、二氧嘧啶、r-氨基丁酸等)占据的位置相对不重要，并未引起代谢途径的显著改变。因此基于CIL LC-MS的GFP基因转染对胎盘来源间充质干细胞的代谢组学无显著影响，可继续用于细胞的标记和示踪。