一种一步加菌分步发酵制备低抗营养因子酸化饲料的方法

摘要

本发明公开了一种一步加菌分步发酵制备低抗营养因子酸化饲料的方法，将饲料原料和二级发酵种子液的质量比按2:1搅拌混匀，好氧发酵18~20小时之后进行厌氧发酵40~46小时，即得到成品；二级发酵种子液的制备：将新鲜培养的枯草芽孢杆菌ZJUAF‑3和凝结芽孢杆菌ZJUAF‑4分别接种入5mL LB液体培养基中，培养4~6小时，使OD

说明书

技术领域

本发明涉及饲料，微生物发酵生物技术领域，具体涉及同步接菌分步发酵制备低抗营养因子酸化饲料的方法。

背景技术

食品安全和生态安全问题关乎民生大计，近几年越来越被各国社会和政府所关注。养殖业的最终目标就是生产安全优质绿色的肉蛋奶等动物产品，造福人类。饲料行业作为养殖业的上游产业，在整个产业链中起到了重要的作用。抗生素在养殖业里的应用在过去很长一段时间推动了养殖业的发展，但是近年来抗生素滥用被频频报道，残留的抗生素通过食物链到达人体，会严重损害人的健康，引发耐药性细菌的产生，同时污染环境。1986年瑞典率先禁止促生长抗生素的使用，2006年欧盟全面禁止促生长抗生素的使用，2014年美国宣布在未来的三年将逐步禁止促使生长抗生素的使用，2017年4月1日我国宣布禁止硫酸粘杆菌素添加在饲料中作为生长促进剂。同时养殖场废气废污的不适当排放，影响了生态环境，政府越来越倡导绿色养殖。因此安全替抗和绿色高效的新型饲料亟待开发。

我国是人口大国，也是养殖大国。2016年我国肉类总产量8540万吨，猪肉产量5299万吨；牛肉产量717万吨，羊肉产量459万吨，禽肉产量1888万吨，禽蛋产量3095万吨，原奶产量3800万吨。2016年我国商业饲料产量2.9亿吨。

断奶是对幼龄动物的巨大应激，规模化养殖场的早期断奶技术更是加剧了应激程度。幼龄动物生长代谢旺盛，但肠道发育不健全，胃酸分泌不足，对蛋白类饲料易引起消化不良，产生的不良产物对导致肠粘膜刺激，肠绒毛受损，特别是对植物性蛋白和不良寡糖易产生过敏反应，生产氧化应激，而大分子蛋白和非淀粉多糖等容易导致幼龄动物消化不良，最终导致腹泻。母畜繁殖性能直接关系到养殖场的经济效益，母畜妊娠期没有控制好营养摄入容易影响其泌乳期产奶量、产子数和窝重。因此，开发抵抗营养因子、易消化，适口性好富含益生菌乳酸和小肽的幼畜和母畜饲料具有重大意义。

通过微生物发酵的手段来改善饲料营养价值，生产绿色高效的饲料目前已成为养殖业在“无抗”背景下研究的热点。微生物发酵饲料不仅能提供有益菌及其代谢产物，调节胃肠道pH，维护肠道菌群平衡，减少抗生素的使用，提高养分消化率，还能开发利用新的饲料资源，缓解粮食安全问题。同时益生菌产生的乳酸还能抑制饲料中大肠杆菌等致病细菌和病原体的生长和繁殖，延长饲料保存时间。目前固态生产发酵饲料主要形式有好氧发酵和厌氧发酵，好氧发酵有利于降解饲料中抗营养因子和大分子营养物质，提高动物消化吸收能力；厌氧发酵则有利于产生生物酸，抑制杂菌污染，调节动物胃肠道pH，改善饲料适口性。发酵饲料的销售形式主要有干料销售和湿料销售。干料销售不易二次染菌腐败，但是设备投入大，烘干过程容易杀死耐热性差的益生菌及其代谢产物；湿料销售：设备投入小，使益生菌及其代谢产物不被灭活，但是容易造成二次染菌变质。

汪以真等在“高效降解豆粕抗原蛋白的芽孢杆菌及菌酶混合发酵的方法”（专利号ZL201610728880.3）详细介绍了制备低抗营养因子酸化复合饲料的方法，但上述专利制备方法存在以下不足：

1. 由于枯草芽孢杆菌是好氧菌，而乳酸菌是厌氧菌，前者在培养时要通气搅拌，一般6小时即可达到接种浓度，而后者需要深层培养，且培养时间需要12小时。此外，两类菌的培养基也不同，前者提供氮源和无机盐即可， 而后者需要补充碳源。在进行发酵前准备时，需要准备3组培养罐，操作繁琐。

2. 由于两类菌对氧气需求不同，为达到充分降解抗原蛋白的目的，该专利进行分步加菌，分步发酵。但是中小型饲料企业的设备一般难以支持分步加菌，增加了生产成本。

3.该专利方法中采用的乳酸菌在饲料烘干处理中不易存活，不利于饲喂后继续发挥菌株自身的益生效果。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种一步加菌分步发酵制备低抗营养因子酸化饲料的方法。

一种一步加菌分步发酵制备低抗营养因子酸化饲料的方法，将饲料原料和二级发酵种子液的质量比按2:1搅拌混匀，好氧发酵18~20小时之后进行厌氧发酵40~46小时，即得到成品；所述二级发酵种子液的制备：将新鲜培养的枯草芽孢杆菌ZJUAF-3和凝结芽孢杆菌ZJUAF-4分别接种入5mL LB液体培养基中，培养4~6小时，使OD₆₀₀达到0.5，得到ZJUAF-3一级种子液和ZJUAF-4一级发酵种子液，一级发酵种子液以终质量2%~3%分别加入饲料原料浸汁液中37℃培养8小时，使OD600达到0.5，得到ZJUAF-3二级发酵种子液和ZJUAF-4二级发酵种子液。

枯草芽孢杆菌ZJUAF-3和凝结芽孢杆菌ZJUAF-4皆为现有的菌，其中ZJUAF-3首次公开在CN106167782 A（CN201610728303.4），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：12825，凝结芽孢杆菌ZJUAF-4从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心购买，保藏号为CGMCC NO：1.2009，具有较好的产乳酸能力。

所述的ZJUAF-3二级发酵种子液和ZJUAF-4二级发酵种子液，按体积比1:1~1:1.5的比例添加到饲料原料中搅拌混匀。

所述的饲料原料浸汁液的配制：按质量百分比，6%饲料原料粉，0.8% Na₂HPO₄·12H₂O，0.4%>4)₂SO₄，0.15%>4Cl，加入水搅拌10min，配制完成后，90℃灭菌30min。

所述的饲料原料为玉米、豆粕、麸皮和玉米DDGS一种或多种，和/或上述原料膨化产品中的一种或多种。

所述的发酵温度30~40℃。

本发明的有益效果：

利用本发明的菌株配伍发酵，可以把原来多步接菌多步搅拌的生产流程简化为一步加菌搅拌，大大提高了生产效率，减少了生产成本。并且在单一原料（豆粕）、混合饲料（玉米-豆粕）和低值酒糟原料（DDGS）上验证了此方法的效果，证明了此方法的实用性。饲料原料在较短时间的好氧发酵后即可装袋运输，不需要额外添加酶制剂，降低了生产成本，生成的大量乳酸抑制了有害杂菌生长，缓解了饲料运输和保存中杂菌污染的问题。

两株菌配伍性良好，抗逆性强，能够抵抗高温烘干等严苛环境，顺利到达动物肠道发挥益生作用。经检测发现，本发明生产的发酵饲料，色泽金黄，具有酸香味，抗营养因子降低效果好，富含益生菌数，发酵小肽，乳酸及其他促生长因子，能降低幼龄动物腹泻，提高母畜繁殖性能，并且同时适合干料和湿料销售，具有良好的应用前景。

附图说明

图1 为本发明方法（左部分）和ZL201610728880.3（右部分）发酵饲料生产工艺流程对比图；

图2为本发明工艺发酵不同饲料原料抗营养因子降解效果电泳图；

图3为本发明配伍菌株与其他不同配伍菌株发酵饲料蛋白降解效果电泳图；

图4为采用本发明方法生产的发酵玉米豆粕混合饲料的乳酸及pH变化图；

图5为采用本发明方法生产的发酵玉米豆粕混合饲料的微生物数量变化图；

图6为采用本发明方法生产的发酵饲料色泽。

具体实施方式

以下通过实施例和附图对本发明一步加菌分步发酵制备低抗营养因子酸化饲

料的方法做进一步的阐述。

由图1所示，本发明改良的发酵饲料生产工艺流程，将之前专利两次分步加菌搅拌的生产工艺简化为一步加菌搅拌，大大提高了生产效率，减少了生产成本；

由图2可知，本发明提供的发酵饲料生产工艺流程，在不同饲料上均有很好的发酵效果，验证了本方法的实用性和通用性。

实施例1

一、配制饲料原料浸汁液（活化培养基）：按质量百分比，4%豆粕粉，3%玉米粉，0.8% Na₂HPO₄·12H₂O，0.4%>4)₂SO₄，0.15%>4Cl，加入水搅拌10min，配制完成后，滤去不溶物质，90℃灭菌30min后自然冷却至室温。

二、制备二级发酵种子液：将新鲜培养的枯草芽孢杆菌ZJUAF-3和凝结芽孢杆ZJUAF-4分别接种入5 mL LB液体培养基中（即有两管，每种菌5 mL一管），培养4~6小时，使OD₆₀₀达到0.5，得到ZJUAF-3一级种子液和ZJUAF-4一级种子液，按1mL培养后的一级种子液以终质量2%~3%分别加入饲料原料浸汁液中37℃放大培养8小时，使OD₆₀₀达到0.5，得到各自的二级种子液后备用。

三、发酵玉米豆粕型混合饲料：将200Kg玉米、200Kg豆粕混合，加100公斤麸皮作为辅料配成混合饲料，加入250公斤的二级发酵种子液，其中ZJUAF-3和ZJUAF-4的二级种子液按1:1.5的比例添加，使含水量约为总发酵质量的40%（饲料原料含有约10%水分），混合搅拌均匀后，于室温好氧发酵24小时得到发酵混合饲料1。然后将发酵混合饲料1封装于厌氧发酵装置中。发酵48小时后即得到成品。

对实施例1发酵豆粕进行营养成分检测，并与现有的专利方法、某商业菌株发酵方法效果进行了比较。结果如表1所述：

由表1可知本发明实施例1的方法发酵混合饲料在饲料抗原蛋白降解、小肽提高、pH、益生菌数等方面效果好于ZL201610728880.3，并明显优于某商业菌株发酵效果。

如图3所示，本发明所用的菌株配伍对饲料的发酵效果好于与其他菌株配伍的发酵玉米豆粕型混合饲料效果，说明本发明所用菌株配伍的合适性和高效性。

实施例2

一、配制饲料原料浸汁液（活化培养基）：按质量百分比，5%豆粕粉，0.8% Na₂HPO₄·12H₂O，0.4%>4)₂SO₄，0.15%>4Cl，加入水搅拌10min，配制完成后，将培养基加热到90℃后自然冷却至室温。

二、制备二级发酵种子液液：将新鲜培养的枯草芽孢杆菌ZJUAF-3和凝结芽孢杆ZJUAF-4分别接种入两管5 mL LB液体培养基中，培养4~6小时，使OD600达到0.5，按1mL培养后的一级种子液以终质量2%~3%分别加入饲料原料浸汁液中37℃放大培养8小时，使OD₆₀₀达到0.5，得到各自的二级种子液后备用。

三、发酵豆粕：取500Kg豆粕，加入250公斤的二级发酵种子液，其中ZJUAF-3和ZJUAF-4的二级种子液按1:1的比例添加，使含水量为总发酵质量的40%，混合搅拌均匀后，于室温好氧发酵24小时得到发酵豆粕1，然后将发酵豆粕1厌氧发酵48小时后即得到成品。

对实施例2发酵豆粕进行营养成分检测，并与现有的专利方法、某商业菌株发酵方法效果进行了比较。结果如表2所述：

由表2可知本发明实施例2的方法发酵豆粕在饲料抗原蛋白降解、小肽提高、pH、益生菌数上面效果明显好于ZL201610728880.3技术方案的发酵效果。

由图4所示，本发明发酵后豆粕pH逐渐下降，乳酸含量逐渐积累，酸香味。

如图5说明发酵豆粕完成后大肠杆菌生长受抑制，其小于1.0×103CFU/g，有利于饲料保存，饲料中主要菌群以枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌为主，益生作用强。

实施例3

一、配制饲料原料浸汁液（活化培养基）：按质量百分比，5%玉米DDGS粉，0.8% Na₂HPO₄·12H₂O，0.4%>4)₂SO₄，0.15%>4Cl，加入水搅拌10min，配制完成后，将培养基加热到90℃后自然冷却至室温。

二、制备二级发酵种子液：将新鲜培养的枯草芽孢杆菌ZJUAF-3和凝结芽孢杆ZJUAF-4分别接种入两管5 mL LB液体培养基中，培养4~6小时，使OD600达到0.5，按1mL培养后的一级种子液以终质量2%~3%分别加入饲料原料浸汁液中37℃放大培养8小时，使OD₆₀₀达到0.5，得到各自的二级种子液后备用。

三、发酵玉米DDGS:取500Kg玉米DDGS，加入250公斤的二级发酵种子液， 其中ZJUAF-3和ZJUAF-4的二级种子液按1:1的比例添加，使含水量为总发酵质量的40%，混合搅拌均匀后，于室温好氧发酵24小时得到发酵DDGS1，然后将发酵DDGS1厌氧发酵48小时后即得到成品。

对实施例3发酵玉米DDGS进行营养成分检测，并与某商业菌株发酵方法效果进行了比较。结果如表3所述：

由表3可知本发明实施例3的方法发酵玉米DDGS效果好于某商业菌株发酵效果。

图6表明本发明提供的发酵饲料中，发酵成品呈金黄色，商业感官价值高。