一种同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法及检测水果中的类黄酮含量的方法

摘要

本发明提供一种同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法，属于类黄酮检测领域，所述11种类黄酮为飞燕草素葡萄糖苷、飞燕草色素芸香糖苷、芍药色素葡萄糖苷、矢车菊素芸香糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、芦丁、山柰酚、槲皮素、杨梅黄酮、异鼠李素以及芹菜素。本发明通过对高效液相色谱色谱条件的精确限定，在不同的保留时间检测到不同种类的类黄酮物质，色谱峰的最小分离度为1.54，实现了11种类黄酮的同时测定。实施例的数据表明，本发明实现了对11种类黄酮的同时测定，且操作简单快捷，同时峰面积和保留时间的标准偏差较小，具有较高的准确性。

说明书

技术领域

本发明涉及类黄酮含量检测技术领域，特别涉及一种同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法及检测水果中的类黄酮含量的方法。

背景技术

类黄酮又称生物类黄酮，是人类饮食中含量最丰富的一类多酚化合物，广泛存于水果、蔬菜等作物中，目前已经确认有四千多种不同的类黄酮，其中水果中含量较多的类黄酮是黄酮、黄酮醇类及花色苷类化合物。类黄酮具有较强的抗氧化、清除自由基能力，并有调节心血管系统、内分泌系统、抗癌防癌、抗衰老等重要生物活性。

类黄酮的分析方法有紫外分光光度法、硝酸铝比色法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、色谱-质谱联用法等。紫外分光光度法和硝酸铝比色法多用于测定类黄酮的重含量，毛细管电泳法和色谱-质谱联用法多用于鉴定组分类型，实际用于类黄酮组分含量检测的主要是高效液相色谱法。高效液相色谱法操作简单、准确度高、重现性好，但由于花色苷类、黄酮醇类和黄酮类物质各组分的检测条件和方法差别较大，常需分批多次检测，工作繁琐、量大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法。本发明提供的检测方法具有测定范围广、操作简单快捷的特点。

本发明提供了一种同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法，所述11种类黄酮为飞燕草素葡萄糖苷、飞燕草色素芸香糖苷、芍药色素葡萄糖苷、矢车菊素芸香糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、芦丁、山柰酚、槲皮素、杨梅黄酮、异鼠李素以及芹菜素，包括以下步骤：

(1)配制包含所述11种类黄酮标准样品的待测溶液；

(2)将所述步骤(1)得到的待测溶液进行高效液相色谱分析，得到待测样品的色谱图，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：

分析柱：C-18柱；

流动相：水相A:0.3wt％磷酸水溶液；有机相B：乙腈；

流速：1mL/min；

洗脱方式：梯度洗脱，0min，A:B＝95:5，20min，A:B＝85:15，30min，A:B＝75:25，40min，A:B＝50:50，48min，A:B＝95:5；

检测波长：510nm、360nm；

检测温度：40℃；

进样体积：10μL；

检测时间：50min；

检测器：G1314F VWD检测器；

(3)根据所述待测样品的色谱图与预定的标准谱图进行对比，得到待测样品中类黄酮的种类。

优选地，所述检测时间为(0,20)min时，检测波长为510nm，所述检测时间为[20,50]min时，检测波长为360nm。

优选地，所述待测溶液进行高效液相色谱分析前还包括用0.22μm的有机滤膜对待测溶液进行过滤，得到进样溶液。

优选地，所述混合标准溶液中11种类黄酮的浓度独立地为2.5～500.0μg/mL。

优选地，所述C-18柱为InfinityLab Poroshell 120EC-C18，所述C-18柱的规格为4.6×150mm。

优选地，所述步骤(1)中配制待测溶液使用的溶剂为甲醇-盐酸混合溶液，所述甲醇-盐酸混合溶液中甲醇与盐酸的体积比为98:2，所述盐酸的质量分数为30～36％。

本发明还提供了一种水果中类黄酮的检测方法，包括以下步骤：

(1)水果鲜样破碎后第一避光醇提，固液分离得到第一滤液和第一滤渣；

(2)将所述步骤(1)得到的第一滤渣反复进行避光醇提，将滤液合并得到第二滤液；

(3)将所述第一滤液和第二滤液混合后依次进行稀释、离心分离和有机滤膜过滤，得到待测液，所述有机滤膜的孔径为0.22μm；

(4)将步骤(3)得到的待测液进行高效液相色谱分析，用外标法以标准方程计算得到水果中类黄酮的含量，所述标准方程是以每种类黄酮的质量浓度为自变量、峰面积为因变量的方程；

所述高效液相色谱分析的色谱条件为：

分析柱：C-18柱；

流动相：水相A:0.3wt％磷酸水溶液；有机相B：乙腈；

流速：1mL/min；

洗脱方式：梯度洗脱，0min，A:B＝95:5，20min，A:B＝85:15，30min，A:B＝75:25，40min，A:B＝50:50，48min，A:B＝95:5；

检测波长：510nm、360nm；

检测温度：40℃；

进样体积：10μL；

检测时间：50min；

检测器：G1314F VWD检测器。

优选地，所述步骤(1)中第一避光醇提使用的浸提剂为甲醇-盐酸混合溶液，所述甲醇-盐酸混合溶液中甲醇与盐酸的体积比为99:1，所述盐酸的质量分数为30～36％。

优选地，所述步骤(1)中水果鲜样的质量与浸提剂的体积比为5g:25～35mL。

优选地，所述步骤(4)中标准方程的线性范围独立地为5～500μg/mL。

本发明提供的同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法，所述11种类黄酮为飞燕草素葡萄糖苷、飞燕草色素芸香糖苷、芍药色素葡萄糖苷、矢车菊素芸香糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、芦丁、山柰酚、槲皮素、杨梅黄酮、异鼠李素以及芹菜素，配制包含所述11种类黄酮标准样品的待测溶液，得到待测样品的色谱图，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：分析柱：C-18柱，流动相：水相A:0.3wt％磷酸水溶液；有机相B：乙腈，流速：1mL/min，洗脱方式：梯度洗脱，0min，A:B＝95:5，20min，A:B＝85:15，30min，A:B＝75:25，40min，A:B＝50:50，48min，A:B＝95:5，检测波长：510nm、360nm，检测温度：40℃，进样体积：10μL，检测时间：50min；检测器：G1314F VWD检测器。本发明通过对高效液相色谱色谱条件的精确限定，在不同的保留时间检测到不同种类的类黄酮物质，色谱法的最小分离度为1.54，能够实现11种类黄酮的同时测定。实施例的数据表明，本发明实现了对11种类黄酮的同时测定，且操作简单快捷，同时峰面积和保留时间的标准偏差较小，具有较高的准确性。

并且，本发明提供的方法能够同时测定11种类黄酮，能够将水果中的类黄酮与其他组分、类黄酮之间分离开，并且通过一次检测实现水果中类黄酮的测定。

附图说明

图1是本发明实施例1同时测定11种类黄酮的高效液相色谱谱图；

图2是本发明实施例2得到的高效液相色谱谱图；

图3是本发明实施例3得到的高效液相色谱谱图；

图4是本发明实施例4得到的高效液相色谱谱图；

图5是本发明实施例4得到的高效液相色谱谱图；

图6是本发明实施例5得到的高效液相色谱谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法，所述11种类黄酮为飞燕草素葡萄糖苷、飞燕草色素芸香糖苷、芍药色素葡萄糖苷、矢车菊素芸香糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、芦丁、山柰酚、槲皮素、杨梅黄酮、异鼠李素以及芹菜素，包括以下步骤：

(1)配制包含所述11种类黄酮标准样品的待测溶液；

(2)将所述步骤(1)得到的待测溶液进行高效液相色谱分析，得到待测样品的色谱图，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：

分析柱：C-18柱；

流动相：水相A:0.3wt％磷酸水溶液；有机相B：乙腈；

流速：1mL/min；

洗脱方式：梯度洗脱，0min，A:B＝95:5，20min，A:B＝85:15，30min，A:B＝75:25，40min，A:B＝50:50，48min，A:B＝95:5；

检测波长：510nm、360nm；

检测温度：40℃；

进样体积：10μL；

检测时间：50min；

检测器：G1314F VWD检测器。

(3)根据所述待测样品的色谱图与预定的标准谱图进行对比，得到待测样品中类黄酮的种类。

在本发明中，所述11种类黄酮中飞燕草素葡萄糖苷、飞燕草色素芸香糖苷、芍药色素葡萄糖苷、矢车菊素芸香糖苷和矢车菊素葡萄糖苷为花色苷，芦丁、山柰酚、槲皮素、杨梅黄酮和异鼠李素为黄酮醇，芹菜素为黄酮。

本发明配制包含所述11种类黄酮标准样品的待测溶液。在本发明中，所述配制包含所述11种类黄酮标准样品的待测溶液使用的溶剂优选为甲醇-盐酸混合溶液，所述甲醇-盐酸混合溶液中甲醇与盐酸的体积比优选为98:2，所述盐酸的质量分数优选为30～36％，更优选为35％。在本发明中，所述11种类黄酮标准样品优选为高效液相色谱纯的产品，所述11种类黄酮标准样品的纯度≥99％。

在本发明中，所述待测溶液中11种类黄酮的浓度独立地优选为2.5～500.0μg/mL，更优选为5.0～100.0μg/mL，最优选为50.0μg/mL。

在本发明中，所述待测溶液进行高效液相色谱分析前还优选包括用0.22μm的有机滤膜对待测溶液进行过滤。在本发明中，所述过滤能够除去待测溶液中的杂质，避免对高效液相色谱检测结果产生影响。

得到待测溶液后，本发明将所述待测溶液进行高效液相色谱分析，所述高效液相色谱分析的色谱条件为：

分析柱：C-18柱；

流动相：水相A:0.3wt％磷酸水溶液；有机相B：乙腈；

流速：1mL/min；

洗脱方式：梯度洗脱，0min，A:B＝95:5，20min，A:B＝85:15，30min，A:B＝75:25，40min，A:B＝50:50，48min，A:B＝95:5；

检测波长：510nm、360nm；

检测温度：40℃；

进样体积：10μL；

检测时间：50min；

检测器：G1314F VWD检测器。

在本发明中，采用双波长进行高效液相色谱检测，当所述检测时间为(0,20)min时，检测波长为510nm，当所述检测时间为[20,50]min时，检测波长为360nm。

在本发明中，所述C-18柱优选为InfinityLab Poroshell 120EC-C18，所述C-18柱的规格为4.6×150mm。

本发明还提供了一种水果中类黄酮的检测方法，包括以下步骤：

(1)水果鲜样破碎后第一避光醇提，固液分离得到第一滤液和第一滤渣；

(2)将所述步骤(1)得到的第一滤渣反复进行避光醇提，将滤液合并得到第二滤液；

(3)将所述第一滤液和第二滤液混合后依次进行稀释、离心分离和有机滤膜过滤，得到待测液，所述有机滤膜的孔径为0.22μm；

(4)将步骤(3)得到的待测液进行高效液相色谱分析，用外标法以标准方程计算得到水果中类黄酮的含量，所述标准方程是以11种类黄酮的质量浓度为自变量、峰面积为因变量的方程；

所述高效液相色谱分析的色谱条件为：

分析柱：C-18柱；

流动相：水相A:0.3wt％磷酸水溶液；有机相B：乙腈；

流速：1mL/min；

洗脱方式：梯度洗脱，0min，A:B＝95:5，20min，A:B＝85:15，30min，A:B＝75:25，40min，A:B＝50:50，48min，A:B＝95:5；

检测波长：510nm、360nm；

检测温度：40℃；

进样体积：10μL；

检测时间：50min；

检测器：G1314F VWD检测器。

在本发明中，所述水果鲜样优选包括黑宝石李果皮、蓝莓、黑提、火龙果或车厘子。

本发明将水果鲜样破碎后第一避光醇提，得到第一滤液和第一滤渣。在本发明中，所述破碎优选为在液氮环境中进行研磨，在液氮环境中进行研磨时不会除去水果鲜样中的水分。本发明对所述研磨的时间没有特殊的限定，能够将所述水果鲜样研磨至粉状即可。

将水果鲜样破碎后，本发明将所述破碎后的水果鲜样进行第一避光醇提，得到第一滤液和第一滤渣。在本发明中，所述第一避光醇提使用的浸提剂优选为甲醇-盐酸混合溶液，所述甲醇-盐酸混合溶液中甲醇与盐酸的体积比优选为99:1，所述盐酸的质量分数优选为30～36％，更优选为35％。在本发明中，所述水果鲜样的质量与浸提剂的体积比优选为5g:25～35mL，更优选为5g:30mL。在本发明中，所述第一避光醇提的时间优选为6～12h，更优选为8～10h；所述第一避光醇提的温度优选为室温，不需要额外的加热或降温。

第一避光醇提完成后，本发明通过固液分离得到第一滤液和第一滤渣。本发明对所述固液分离的具体方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的固液分离方式即可，具体的，如过滤。

得到第一滤渣后，本发明将所述第一滤渣反复进行避光醇提，将滤液合并得到第二滤液。在本发明中，所述避光醇提的条件优选为与前述第一避光浸提条件一致，在此不再赘述。在本发明中，所述避光醇提的次数优选为2～5次，更优选为3～4次。本发明通过多次避光醇提有助于实现水果鲜样中类黄酮物质的完全提取。本发明将每次避光醇提得到的滤液合并得到第二滤液。

得到第一滤液和第二滤液后，本发明将所述第一滤液和第二滤液混合后依次进行稀释、离心分离和有机滤膜过滤，得到待测液，所述有机滤膜的孔径为0.22μm。本发明将第一滤液和第二滤液混合，得到混合液。本发明对所述混合的方式没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的混合方式即可。

得到混合液后，本发明将所述混合液稀释，得到稀释液。在本发明中，所述稀释使用的稀释溶液优选为与上述浸提剂一致，在此不再赘述。在本发明中，优选用所述稀释溶液与将所述混合液的体积比优选为2～5：1，更优选为2.5～3.5：1，本发明将所述混合液稀释到标准曲线的线性范围内，便于能够后续计算水果中类黄酮的含量。

得到稀释液后，本发明将所述稀释液离心分离，得到样液。本发明对所述离心分离的转速、时间没有特殊的限定，优选地，所述离心分离的转速优选为8000～10000rpm，更优选为8500～9000rpm；所述离心分离的时间优选为10～15min，更优选为12min；所述离心分离的温度优选为4℃。在本发明中，所述离心温度能够避免类黄酮物质被氧化。

得到样液后，本发明将所述样液经过有机滤膜过滤得到待测液，所述有机滤膜的孔径为0.22μm。在本发明中，所述过滤能够除去样液中的滤渣，防止大颗粒物质堵塞色谱柱，同时避免对高效液相色谱检测结果产生影响。

得到待测液后，本发明将所述待测液进行高效液相色谱分析，用外标法以标准方程计算水果中类黄酮的含量，所述标准方程是以11种类黄酮的质量浓度为自变量、峰面积为因变量的方程。在本发明中，进行高效液相色谱分析的色谱条件与同时测定11种类黄酮的高效液相色谱的色谱条件一致，在此不再赘述。

在本发明中，所述标准方程优选包括以下步骤：采用与同时测定11种类黄酮的高效液相色谱的检测方法相同的方法对浓度梯度为2.5～500.0μg/mL的11种类黄酮的待测溶液溶液进行高效液相色谱分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，峰面积对浓度作线性方程，得到标准方程。

在本发明中，所述浓度梯度优选为2.5、5.0、50.0、100.0、500.0μg/mL。

本发明得到的中标准方程的线性范围独立优选为5～500μg/mL，所述标准方程的最低检测限为5μg/mL。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的同时测定11种类黄酮的高效液相色谱检测方法及检测水果中的类黄酮含量的方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

分别称取HPLC色谱纯(纯度≥99％)的飞燕草素葡萄糖苷、飞燕草色素芸香糖苷、芍药色素葡萄糖苷、矢车菊素芸香糖苷、矢车菊素葡萄糖苷、芦丁、山柰酚、槲皮素、杨梅黄酮、异鼠李素、芹菜素试剂，用甲醇-盐酸(V_甲醇:V_盐酸＝98:2)溶解配制成浓度为2.5、5.0、50.0、100.0、500.0μg/mL的混合标准溶液，用0.22μm的有机滤膜过滤后进行高效液相色谱分析。

将混合标准溶液进行高效液相色谱分析，色谱条件为：

分析柱：C-18柱，InfinityLab Poroshell 120EC-C18，4.6×150mm；

流动相：水相A:0.3wt％磷酸水溶液；有机相B：乙腈；

流速：1mL/min；

洗脱方式：梯度洗脱，0min，A:B＝95:5，20min，A:B＝85:15，30min，A:B＝75:25，40min，A:B＝50:50，48min，A:B＝95:5；

检测波长：510nm、360nm，当检测时间为(0,20)min时，检测波长为510nm，当检测时间为[20,50]min时，检测波长为360nm；

检测温度：40℃；

进样体积：10μL；

检测时间：50min；

检测器：G1314F VWD检测器。

浓度为2.5μg/mL的混合标准溶液的高效液相色谱检测谱图如图1所示，由图1可以看出，本发明提供的检测方法实现了对11种类黄酮的同时测定，图1中1为飞燕草素葡萄糖苷，2为飞燕草色素芸香糖苷，3为矢车菊素葡萄糖苷，4为矢车菊素芸香糖苷，5为芍药色素葡萄糖苷，6为芦丁，7为杨梅黄酮，8为槲皮素，9为芹菜素，10为异鼠李素，11为山柰酚。

以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，峰面积对浓度作线性方程，得到11种类黄酮的标准方程，结果如表1，由表1可以看出，峰面积和保留时间的标准偏差较小，本发明提供的检测方法具有较高的准确性。

表1 11种类黄酮的标准方程、相关系数、线性范围以及相对标准偏差结果

其中，回归方程中，y表示峰面积，x表示类黄酮的浓度(μg/mL)。

实施例2

取黑宝石李果皮5g，液氮研磨至粉碎，25ml甲醇-盐酸溶液(V_甲醇:V_盐酸＝99:1)避光浸提12h，过滤；滤渣再用25ml甲醇-盐酸溶液(V_甲醇:V_盐酸＝99:1)反复浸提2次；收集所有滤液用甲醇-盐酸溶液(V_甲醇:V_盐酸＝99:1)定容至100ml得样液，样液在8000rpm4℃下离心10min，再用0.22μm的有机滤膜过滤后得待测液备用。

采用与实施例1完全相同的高效液相色谱检测条件对待测液进行检测，得到的高效液相色谱谱图如图2所示，图2中1为飞燕草素葡萄糖苷，2为飞燕草色素芸香糖苷，3为矢车菊素葡萄糖苷，4为矢车菊素芸香糖苷，5为芦丁，6为杨梅黄酮，7为山柰酚。

根据实施例1提供的标准方程计算黑宝石李果皮中的不同种类的类黄酮的含量，结果如表2所示，由图2和表2可以看出，实施例2通过一次检测实现了黑宝石李果皮中类黄酮的测定。

表2黑宝石李果皮中类黄酮含量(μg/g·FW)

其中，FW为水果鲜样的鲜重(g)，此外，需要说明的是，上述实施例的结果分析中，仅给出能够检测到的类黄酮的含量，含量小于5μg/g·FW或未检出的不在表中体现。

实施例3

采用与实施例2相同的步骤，区别仅在于将黑宝石李果皮替换为车厘子(果皮和果肉)。得到的高效液相色谱谱图如图3所示，图3中1为矢车菊素葡萄糖苷，2为矢车菊素芸香糖苷，3为芦丁。

根据实施例1提供的标准方程计算黑宝石李果皮中的不同种类的类黄酮的含量，结果如表3所示，由图3和表3可以看出，实施例3通过一次检测实现了车厘子中类黄酮的测定。

表3车厘子果实中类黄酮含量(μg/g·FW)

其中，FW为水果鲜样的鲜重(g)，此外，需要说明的是，上述实施例的结果分析中，仅给出能够检测到的类黄酮的含量，含量小于5μg/g·FW或未检出的不在表中体现。

实施例4

采用与实施例2相同的步骤，区别仅在于将黑宝石李果皮替换为蓝莓(果皮和果肉)。得到的高效液相色谱谱图如图4所示，图4中1为飞燕草素葡萄糖苷，2为飞燕草色素芸香糖苷，3为矢车菊素葡萄糖苷，4为矢车菊素芸香糖苷，5为芦丁，6为杨梅黄酮。

根据实施例1提供的标准方程计算黑宝石李果皮中的不同种类的类黄酮的含量，结果如表4所示，由图4和表4可以看出，实施例4通过一次检测实现了蓝莓中类黄酮的测定。

表4蓝莓果实中类黄酮含量(μg/g·FW)

其中，FW为水果鲜样的鲜重(g)，此外，需要说明的是，上述实施例的结果分析中，仅给出能够检测到的类黄酮的含量，含量小于5μg/g·FW或未检出的不在表中体现。

实施例5

采用与实施例2相同的步骤，区别仅在于将黑宝石李果皮替换为火龙果(果肉)。得到的高效液相色谱谱图如图5所示，图5中1为飞燕草色素芸香糖苷，2为矢车菊素芸香糖苷，3为芍药色素葡萄糖苷，4为芦丁，5为槲皮素，6为异鼠李素，7为山柰酚。

根据实施例1提供的标准方程计算黑宝石李果皮中的不同种类的类黄酮的含量，结果如表5所示，由图5和表5可以看出，实施例5通过一次检测实现了火龙果中类黄酮的测定。

表5火龙果果肉中类黄酮含量(μg/g·FW)

其中，FW为水果鲜样的鲜重(g)，此外，需要说明的是，上述实施例的结果分析中，仅给出能够检测到的类黄酮的含量，含量小于5μg/g·FW或未检出的不在表中体现。

实施例6

采用与实施例2相同的步骤，区别仅在于将黑宝石李果皮替换为黑提(果皮和果肉)。得到的高效液相色谱谱图如图6所示，图6中1为飞燕草素葡萄糖苷，2为矢车菊素芸香糖苷，3为芦丁，4为山柰酚。

根据实施例1提供的标准方程计算黑宝石李果皮中的不同种类的类黄酮的含量，结果如表6所示，由图6和表6可以看出，实施例6通过一次检测实现了黑提中类黄酮的测定。

表6黑提果实中类黄酮含量(μg/g·FW)

其中，FW为水果鲜样的鲜重(g)，此外，需要说明的是，上述实施例的结果分析中，仅给出能够检测到的类黄酮的含量，含量小于5μg/g·FW或未检出的不在表中体现。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并非对本发明作任何形式上的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。