用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用

摘要

本发明公开了一种用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用。本发明所提供的制备用于生产拉沙里菌素的工程菌的方法，包括如下步骤：抑制拉沙里菌素产生菌中LodE蛋白或其同源蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产拉沙里菌素的工程菌；所述LodE蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。本发明实现了阻断拉沙里菌素合成中负效基因表达的目的，使拉沙里菌素产量提升300％，摇瓶产量达到12mg/L。另外，首次构建了链霉菌FXJ1.172的遗传操作系统，成功实现通过基因工程的手段来获得拉沙里菌素高产突变株。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用。

背景技术

放线菌是一类高G+C含量(69-78％)的革兰氏阳性细菌，其具有复杂的形态发育分化过程和丰富的次级代谢产物合成能力，广泛分布于土壤、海洋、植物等各种生境中。链霉菌是放线菌中的一大类进化较为高等的种系，具有繁多的次级代谢通路，是天然产物的主要来源。链霉菌产生的次级代谢产物占微生物活性天然产物总数的三分之一以上且具有广谱活性，如抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤、免疫抑制剂等，被广泛应用于医学、农业和畜牧业等。据不完全统计，截止到2012年，临床上应用的抗生素有80％直接或间接来源于链霉菌。近年来大量研究表明，链霉菌中参与特定次级代谢产物合成的相关基因一般呈现出聚簇排列的规律，形成生物合成基因簇。这些基因通常包括调控基因、结构基因、后修饰基因以及抗性基因，对次级代谢产物的合成和产量发挥着至关重要的作用。

拉沙里菌素(lasalocid)是最早被报道的聚醚类离子载体之一。美国科学家Berger等人于1951年从拉沙里链霉菌(Streptomyces lasaliensis)的发酵产物中分离得到一种抗革兰氏阳性细菌的抗生素X-537A(即拉沙里菌素)。有别于其它常见聚醚类离子载体，拉沙里菌素不仅能够结合一价金属离子Na⁺和K⁺，还能选择性结合二价金属离子如Ca²⁺/Mg²⁺。1974年，拉沙里菌素产品在美国进行了实用性研究，结果表明其具有良好的抗球虫活性，且不易产生耐药性，满足国际安全性标准。如今，拉沙里菌素作为主要的抗球虫药物和促生长剂应用于家禽养殖和畜牧业已超过四十年，具有重要的经济价值；此外拉沙里菌素还被报道具有广谱活性，如抗寄生虫、抗病毒、抗细菌和抗真菌等，具有良好的的医药应用前景。

目前，国内外拉沙里菌素高产菌株的选育主要还是依赖于一些传统的物理和化学诱变手段，如紫外诱变和LiCl诱变等方法。传统方法尽管操作简单，但由于突变的不定向性及突变的累积使得菌株在获得高产的同时，在生理代谢和发育分化等方面会明显减弱，并且多次诱变往往导致较高的负突变率和抗性饱和，从而限制了菌株进一步改善的空间，且经多次诱变的生产菌株，其遗传稳定性较差，难以满足工业化稳定生产的需求。随着基因组学、代谢组学相关研究的不断深入，越来越多的次级代谢合成调控通路被解析，从分子生物学角度对合成通路进行调控、合成及后修饰的靶向改造，优化天然产物的合成路径，在工业菌株的改造中已得到逐步推广，为高效稳定的工业生产菌株的获取提供了新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用。

本发明所提供的制备用于生产拉沙里菌素的工程菌的方法，其原理是将拉沙里菌素合成相关的负效基因进行阻断，解除其对拉沙里菌素生物合成的抑制作用，实现拉沙里菌素的高产。该方法具体可包括如下步骤：抑制拉沙里菌素产生菌中LodE蛋白或其同源蛋白的表达和/或活性，从而获得所述用于生产拉沙里菌素的工程菌；所述LodE蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。

其中，实现所述“抑制拉沙里菌素产生菌中LodE蛋白或其同源蛋白的表达和/或活性”的方法可为任何能够达到该目的的方法，包括基因编辑、代谢途径调控等手段。在本发明的一个实施例中，具体是通过将所述拉沙里菌素产生菌的基因组中所述LodE蛋白或其同源蛋白的编码基因替换为筛选标记基因来实现的。

所述同源蛋白是指同源性在60％、70％、80％、90％、92％、95％、98％或99％以上的蛋白。

进一步，所述LodE蛋白的编码基因的序列具体为序列表中序列2。在本发明的一个实施例中，所述筛选标记基因具体为neo基因；所述neo基因的序列具体为序列表中序列1。

在本发明中，所述拉沙里菌素产生菌具体为链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172。

更进一步，在本发明的一个实施例中，所述链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172的基因组中，所述LodE蛋白的编码基因是通过同源重组的方式被所述neo基因替换掉的，上游同源臂的序列具体如序列表中序列3所示，下游同源臂的序列具体如序列表中序列4所示。

更加具体的，所述方法包括如下步骤：向链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172中导入重组载体，所述重组载体中含有自5’端到3’端依次相连的所述上游同源臂、所述neo基因和所述下游同源臂，所述上游同源臂和所述下游同源臂与所述链霉菌(Streptomycessp.)FXJ1.172的基因组上的同源片段发生同源重组，即得所述用于生产拉沙里菌素的工程菌。

其中，所述重组载体为以pKC1139为基本骨架在其EcoRV酶切位点处插入自5’端到3’端依次相连的所述上游同源臂、所述neo基因和所述下游同源臂后得到的重组质粒。

采用所述方法制备得到的用于生产拉沙里菌素的工程菌也属于本发明的保护范围。

所述工程菌在生产拉沙里菌素中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了一种生产拉沙里菌素的方法。

本发明所提供的生产拉沙里菌素的方法，具体可包括如下步骤：将所述的工程菌进行发酵培养，从发酵产物中制得拉沙里菌素。

其中，在本发明的一个实施例中，所述发酵培养的条件具体为28℃振荡培养10天。所述从发酵产物中制得拉沙里菌素具体是通过包括如下步骤的方法实现的：将所述发酵产物进行离心(如12000rpm离心5min)，分别收集菌体和上清液；所述菌体用无水乙醇进行萃取(如萃取10-12h)，得到萃取物1；所述上清液用乙酸乙酯进行萃取(如萃取3-5h，具体如3h)，得到萃取物2；所述萃取物1和所述萃取物2中均含有拉沙里菌素。

本发明的有益效果在于：针对拉沙里菌素生物合成基因簇中的负效基因lodE，采用链霉菌常用的敲除载体pKC1139为骨架，构建了lodE的敲除重组质粒，实现了阻断拉沙里菌素合成中负效基因表达的目的，使拉沙里菌素产量提升300％，摇瓶产量达到12mg/L。另外，首次构建了链霉菌FXJ1.172的遗传操作系统，成功实现通过基因工程的手段来获得拉沙里菌素高产突变株。

附图说明

图1为链霉菌FXJ1.172中拉沙里菌素合成负效基因lodE的敲除载体构建和双交换原理示意图，将lodE基因敲除以后，获得链霉菌FXJ1.172拉沙里菌素高产突变株链霉菌FXJ1.172/△lodE。

图2为双交换突变菌株——链霉菌FXJ1.172/△lodE的测序结果示意图。

图3为链霉菌FXJ1.172/△lodE与野生型链霉菌FXJ1.172发酵产物以及拉沙里菌素标准品的HPLC图谱。

图4为链霉菌FXJ1.172/△lodE与野生型链霉菌FXJ1.172拉沙里菌素产量的对比。

图5为链霉菌FXJ1.172/△lodE与野生型链霉菌FXJ1.172生物量的对比。

图6为链霉菌FXJ1.172/△lodE发酵所得产物的质谱鉴定。A为正离子模式；B为负离子模式。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172：记载于“Liu M,Liu N,Shang F,Huang Y:Activation and identification of NC-1,a cryptic cyclodepsipeptide from redsoil-derived Streptomyces sp.FXJ1.172.Eur J Org Chem,2016,Jun 19；2016(23):3943-3948.”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

pKC1139载体：武汉淼灵生物科技有限公司货号P0401。

大肠杆菌ET12567(pUZ8002)：湖南科爱医疗器械有限公司旗下网站(优宝生物)货号ST1130。

实施例1、拉沙里菌素高产工程菌株的构建及鉴定

一、拉沙里菌素高产工程菌株的构建

第一步：以powermix高保真酶(苏州新海生物科技股份有限公司产品，货号NH9303)扩增卡那霉素抗性基因neo与目的基因lodE的上下游同源臂lodE-up和llodE-down，将得到的三个片段按lodE-up、neo、llodE-down的顺序连接入链霉菌温敏型载体pKC1139，以获得重组质粒pKC1139::lodE::neo。所述基因neo的核苷酸序列如序列表中序列1所示，lodE基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示(编码序列表中序列5所示的蛋白质，即LodE蛋白)，lodE的上下游同源臂lodE-up和llodE-down核苷酸序列分别如序列表中序列3和序列4所示。

第二步：利用接合转移方法将第一步获得的重组质粒pKC1139::lodE::neo导入野生型链霉菌FXJ1.172体内，待质粒所携带的lodE同源臂与基因组上同源片段发生同源重组，经抗性筛选得到双交换突变菌株，即拉沙里菌素高产菌株。

图1为链霉菌FXJ1.172中拉沙里菌素合成负效基因lodE的敲除载体构建和双交换原理示意图，将lodE基因敲除以后，获得链霉菌FXJ1.172拉沙里菌素高产突变株链霉菌FXJ1.172/△lodE。

具体如下：

1、构建重组质粒pKC1139::lodE::neo

采取Gibson连接构建敲除质粒，相应引物设计遵循试剂盒说明在5’端带有20bp的重叠区。以链霉菌FXJ1.172基因组DNA为模板，分别设计引物lodE-up-F/lodE-up-R与lodE-down-F/lodE-down-R扩增得到lodE基因上下游同源片段lodE-up(序列3)和lodE-down(序列4)；卡那霉素抗性基因neo(序列1)委托公司人工合成作为模版，随后设计引物Gib-kana-F/Gib-kana-R对该模版进行扩增；将之前得到的上下游同源片段和卡那霉素抗性基因neo扩增所得产物，连同EcoRV酶切处理回收的pKC1139质粒线性片段一起通过Gibsonassembly试剂盒(NEB公司，货号E2611S)连接，并经测序验证正确后得到敲除质粒pKC1139::lodE::neo。

引物序列如下：

lodE-up-F：

GATCCGCGGCCGCGCGCGAT ATCGTGTCGTACCCGCACATCTTCC

lodE-up-R：

GGTATCCAGGGGATAGATCTACTCCTTCGTCCACGGCATGAACG

lodE-down-F：

CTGGGGTTCGGGTAAGATCTCGTCGTGTCCAGACCCACCACCAGC

lodE-down-R：

GACATGATTACGAATTCGATGAAAGCGGCGGTTCTCGGTGATGC

Gib-kana-F：

AGATCTATCCCCTGGATACCGCTCGCCGCAG

Gib-kana-R：

AGATCTTACCCGAACCCCAGAGTCCCG

重组质粒pKC1139::lodE::neo的结构描述为：以pKC1139为基本骨架在其EcoRV酶切位点处插入自5’端到3’端依次相连的所述上游同源臂、所述neo基因和所述下游同源臂后得到的重组质粒。

2、转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002)

(1)将重组质粒pKC1139::lodE::neo经化学转化导入到大肠杆菌ET12567(pUZ8002)。

(2)将含有重组质粒pKC1139::lodE::neo的大肠杆菌ET12567(pUZ8002)(下文称为重组大肠杆菌)转接至1mL含有安普霉素、氯霉素、卡那霉素的液体LB培养基中过夜培养；所述安普霉素浓度为50ug/mL，氯霉素浓度为25ug/mL，卡那霉素浓度为50ug/mL；

(3)将过夜培养后得到的重组大肠杆菌培养液按照体积比1:100转接至10mL含有安普霉素，氯霉素，卡那霉素的液体培养基中，在37℃，180rpm的摇床中培养2-3h至OD600≈0.4-0.6。离心收集菌体；所述安普霉素浓度为50ug/mL，氯霉素浓度为25ug/mL，卡那霉素浓度为50ug/mL；

(4)将步骤(3)中所得到的重组大肠杆菌的菌体用新鲜LB液体培养基清洗2次，清除细胞表面残留的抗生素，离心收集菌体并重悬于0.5ml不含抗生素的LB液体培养基中备用。

3、固体培养获得链霉菌FXJ1.172新鲜孢子悬液

(1)将链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172接种于ISP3固体培养基，28℃培养10天，用无菌棉签刮取菌体表面的孢子，收集于1ml 2×YT液体培养基中；

(2)6000rpm离心3min，弃去上清，将孢子重悬于0.5ml的2×YT液体培养基，备用。

4、将步骤2和3中获得的0.5ml重组大肠杆菌细胞悬液和0.5ml链霉菌FXJ1.172孢子悬液混合摇匀后，均匀涂布于含有10mM MgCl₂的新鲜固体MS培养基表面。

5、28℃倒置培养20h后，在该培养基表面覆盖1ml含适量安普霉素和萘啶酮酸的无菌水，继续倒置培养至长出链霉菌单克隆。所述安普霉素的终浓度为10μg/mL，萘啶酮酸的终浓度为25μg/mL。

6、将链霉菌单克隆转接至含有适量安普霉素和萘啶酮酸的新鲜GYM固体培养基上(安普霉素的终浓度为20μg/mL，萘啶酮酸的终浓度为25μg/mL)，培养3-5天后，获得抗性菌株。

7、通过PCR对步骤6获得的抗性菌株进行验证，筛选出成功导入重组质粒pKC1139::lodE::neo的菌株，并传代培养收集孢子制作孢子悬液，稀释涂布于含有卡那霉素的GYM固体培养基；

8、39℃倒置培养72h后，挑取链霉菌单克隆，采用影印法将克隆分别点接于含安普霉素和卡那霉素的GYM固体培养基上，28℃培养72h后挑取对安普霉素敏感且对卡那霉素不敏感的突变株；

9、提取突变株基因组DNA，进行PCR和测序验证，得到成功的双交换突变菌株，命名为链霉菌FXJ1.172/△lodE。测序结果示意图如图2所示。

本实施例所用的各种培养基具体如下(均以1L培养基所需成分计算)：

LB培养基：5g酵母浸提物，10g蛋白胨，10gNaCl。

MS培养基：20g新鲜黄豆粉，20g甘露醇，15g琼脂粉。

GYM培养基：4g酵母提取物，10g麦芽提取物，4g葡萄糖，2gCaCO₃。

ISP3培养基：20g新鲜燕麦粉，1ml微量盐溶液(含0.1g/L FeSO₄·7H₂O，0.1g/LMnCl₂·4H₂O，0.1g/LZnSO₄·7H₂O)。

2×YT培养基：16g蛋白胨，10g酵母提取物，5gNaCl。

实施例2、发酵验证实施例1中获得的双交换突变株确实为拉沙里菌素高产株

具体的操作步骤如下：

1、将实施例1获得的双交换突变菌株FXJ1.172/△lodE，在固体ISP3培养基上培养10天，至孢子生长茂密厚实，收取孢子于1ml 2×YT液体培养基中，取30μl孢子悬液接入100ml GYM液体培养基中，置于28℃，165rpm的摇床中培养48h作为种子液。

2、将培养好的种子液按1:100的比例转接至含有100ml液体GYM培养基的250ml三角瓶中，置于28℃，165rpm的摇床中发酵培养10天。

3、整个发酵过程中定期取样，发酵液12000rpm离心5min分别收集菌体和上清液，菌体加入50ml无水乙醇过夜萃取，上清液加入100ml乙酸乙酯萃取3小时。

4、萃取液过滤后分别通过减压旋蒸至干燥，随后分别用1ml甲醇溶解固相物，合并后12000rpm离心10min，取上清部分待用。利用高效液相色谱(HPLC)检测萃取液中拉沙里菌素含量。绘制拉沙里菌素标准品(SIGMA-ALDRICH公司：货号33339，溶剂为乙腈)不同进样量条件下的HPLC图谱，利用excel软件构建拉沙里菌素浓度与HPLC图谱组分积分面积的线性回归方程，根据样品的HPLC图谱分析各组分面积，计算突变株链霉菌FXJ1.172/△lodE的拉沙里菌素产量。

实验同时设置原始野生型链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172菌株作为对照。

本实施例中所使用的高效液相色谱检测方法为：

检测波长：拉沙里菌素(305nm)；

流动相：A：甲醇；B：水；流速：1.0ml/min；

洗脱条件：线性梯度洗脱(表1)；

色谱柱：XBridge^TM>

表1线性梯度洗脱

所用的各培养基配方同实施例1。

HPLC检测图谱如图3所示，箭头所示产物峰即为拉沙里菌素，拉沙里菌素出峰时间为15min-17min之间(受柱温、溶剂、温度等条件波动影响)。突变株链霉菌FXJ1.172/△lodE的拉沙里菌素产量，与原始野生型链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ1.172菌株相比，突变株拉沙里菌素产量提高了近3倍，摇瓶产量达到12mg/L(图4)。而二者生物量(以菌体干重计)并无明显区别(图5)，表明lodE基因对拉沙里菌素的产量有直接影响且行使着负效基因的功能，对其进行敲除能够显著提高产物的合成量。

另外，为了进一步确认链霉菌FXJ1.172/△lodE发酵所得产物确实为拉沙里菌素，本发明的发明人还对其进行了质谱鉴定。结果如图6所示，正离子模式下[M+H]＝591.3898，[M+NH₄]＝608.4167；负离子模式下[M-H]＝589.3737。该结果进一步证实所得产物确实为拉沙里菌素。

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 用于生产拉沙里菌素的工程菌及其制备方法与应用

<130> GNCLN171569

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1028

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatcccctg gataccgctc gccgcagccg 60

aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga ggaagcggaa gaatcaaatt atcgaggttg 120

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tcatggctga tgcaatgcgg cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc 600

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ccttctatcg ccttcttgac gagttcttct gagcgggact ctggggttcg ggtaccgagc 1020

tcaagctt 1028

<210> 2

<211> 1569

<212> DNA

<213> 链霉菌（Streptomyces sp.）

<400> 2

atggatgccg acatggccgt ctcaagtgcc cgacggtggt gggctgtagg cgccctcgcc 60

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gcgctctag 1569

<210> 3

<211> 2467

<212> DNA

<213> 链霉菌（Streptomyces sp.）

<400> 3

atcgtgtcgt acccgcacat cttccagcag atcgacgtat gacacggcag ctgtgaccga 60

gggaggtcag ccgagaaggc tgccctccct cgggcggctc cgaatcgtga agctgatggc 120

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ggcgcgatgc tcgaggatgt cgtgcccctg ctcggtctgc ctcgtgcgcg cacccatctc 1200

acggtggccg agcacgccaa cacgggtgcg gcctccgtgc cgctcgctct cgacgtggcc 1260

cgacgcggcg gcctcctcgg tgacggggac accgtgctgc tggcggggtt cggcgggggc 1320

atgtcgatcg gcaccgccct ggtgcgctgg gacgcgcggg cccggtccgc ccgttgacga 1380

acggcgcccg tgccgggtca gcccctgagc cgttcgcgga gcagtttcag tacgtccgtc 1440

tggtgggtgg tgaggtagaa atggccgccc tcgaagacgc gcaggtcgaa gtcgccgtcg 1500

gtgtgctgcc gccaggcctc ggcctcggcg agtgtgacct tcgggtcgct gtcgcccacc 1560

agcacggtca ccgggcaagg cagcggggcc gcggggcggt gctcgtaggt ctcgatcgcg 1620

cggtagtcgg cgcgcagcgc cggcaggatc atggcgagga cgtcgtcgtc ggcgagcagc 1680

gccgcctccg tcccggcgag cgacttcagt tcgcgtacga tgcccgcgtc gtcccggaga 1740

tgcaccgtct cgacgcgttg ggtggtcggc gcgcggcggc ccgagacgta cagcgccgcc 1800

gggccggagc cggtcgactc cgcgaggcgg agggcgactt cgtaggcgat gacggcgccc 1860

atgctgtgcc cgaacaggtg cagcggctcg tcgcgccagg ggccgagggc ctcggtgacg 1920

cggtcggcca ggcggcggat gtcgtccagc ggccgctcgt ccctgcggtc ctgccggccg 1980

gggtactgca ccgcgaggac gtcgatgtcc ggactcagtc cggcggccac ggggaagtag 2040

aagctggccg aaccgccggc gtgcgggaag cagacgagac ggggcgatcc cggcaaggcc 2100

gtgcggtact gccgtatcca cgtgccgctg tccaccgatg atgtgctcaa ccgactgccc 2160

ccgcttcctg gagttccgga cacctcgcgg tgacgctaac caaggagcgg gcggcgtgaa 2220

acccctattt tttccgggca agggccgacg gcccgaccgt cgggggattc cggccgggcc 2280

gtcggcagtc gagagggggt tcgctagagc gcgcccctcg cctgtgcgtc ggtgggtgcg 2340

acgccgtccg cgccctgatc cgcccgcacg gtctgccgcg gaatgaaggc gacggccagc 2400

acggtgccga ccacggcgat cgcgccgcac acgatgagca tcacgttcat gccgtggacg 2460

aaggagt 2467

<210> 4

<211> 2190

<212> DNA

<213> 链霉菌（Streptomyces sp.）

<400> 4

cgtcgtgtcc agacccacca ccagcgcact gagggcgagg gcgcctacag cccaccaccg 60

tcgggcactt gagacggcca tgtcggcatc catccttagg ttgttcctga tgtgccacgt 120

ctttcatgca cgacattagt ttcacacatt cgtgaagtca atgaatgctg taaactctca 180

gccgcacgca acaaccagag ggaggcgacg cagggtgacc gacaagcccg cgcaggcccg 240

tgaccaggag gccgtgctca ggttcatcga gcgcttcgcg gccgcgctga ccgaggcggg 300

tttcccgcgc atgcccgccc gggtcttcgt ggcgctgttc gcctcggact ccgaccacct 360

gaccgcggga gaactggccg agcagcttca ggtgagcccc gccgccatct cgggagccgt 420

ccgctacctc acccaggtga acctcgccat ccgcgagcgc gaaccgggcg cccggcagga 480

tcacttccgg gtcgacagca acgtctggta cgagctgatg cgccgccgcg accacgaact 540

cgtccgctgg gaggacagtc tgcgcgaggg gatcggcgcg ctcggcgcgg acaccccggc 600

cggggccaag ctcgcggcga cgctgccctt cttcgagttc atgcagaagg aactctccga 660

aatgctggaa cgctggcgac aacaggaggc aagcaactga cgccgaatcg ggcacctccg 720

cccgcccggc gtcgaccgac atcaaaccct cacatcacac accacaccaa cacggtccgg 780

ccgagtgtgc cggaacggcg ctggagcgtt ccgttctccc gcaatagggc acccctatcc 840

atacccttat cgacccctag gtctgcggga tacccacacc atcgcgccta ccggttgaca 900

tagcatccct ttcggacagg cggacgacga acatccggcc gccatccggt cgaccacacg 960

gcacaccggg gcattcaccg ctcccgcctg cgaattcagc gaccacaacc gactcgaccg 1020

tgaggcgcgg tgcgtggaag gtaccagatc cccactcctg cgacagatgc ttttcagaca 1080

aagatgttaa tggtccgtca gacgccacgt tgacgagagc cgactttcga gattgcatct 1140

cgtcggtcca cagtcactgt gcgccgcaca aggaagtccg tgcgccagca agcccaggac 1200

gtgcacgccg gggaaacagc cggctcggaa gcgcgaggcc ggccgaaaaa tcgggggttc 1260

gtgtctctgc catggaattc ttagaacaac gaacagattg gcttgccctg caagccgcat 1320

tcgaggaagt ggtgtccggc gactcccgga cggtgctcat cgaagccggg gtggcctgcg 1380

gaaagagcac ggccctcgag gggatcggcg agtacgcggc cgctcggggc gccctgatcc 1440

tgcacgccgc aggatccctg tccggcagca gcacaccgtt aggtgtcgta cgccaactca 1500

tcgactgccg gtcgtttccc gaacgcgcgc gcgagggaat cctcgccacc cttggccaag 1560

gaaattacgg acagttcggc gccatcgtgc ggaatctcgc cgtccgcatt ccggtggtgg 1620

tgagtgtcga tgatctgcac catgtggacg tcgaatcgtt gcactgtctt ctccatctcg 1680

tcggccacac ccgcaagagc cggattctga cgctcttcac ccagtcgctg tcgcgggttc 1740

cgcaggaccc cacgttcgac accgaattac tgcgtcagcc caatttccgc cgggtccggc 1800

tgagtcctct gagcctcgtc ggcgtggccg gaatgctctc ggcgcatccc gatgtggaag 1860

ccgacgcgga gctgacgagc gatttgcatg ccgccagcgg cggtaatccg ctgctgctgc 1920

gcgccctcgt cgaggaccac ctggccgccc gctggttccc gggcacctcc ggtgaacgcg 1980

cggagcccgg tgtctcgttc agccgggccg tgctcacctg tctgcaccgc ggcggcaccc 2040

gtatgcgcga cgccgccgcg gcgctggccg tcctgggcga gtccgagtac cgcgagttgc 2100

tcgggccgct cgccgggctg tcggcgaatg acctggtcca ggcccagcac gccctcgacg 2160

gcgccggcat caccgagaac cgccgctttc 2190

<210> 5

<211> 522

<212> PRT

<213> 链霉菌（Streptomyces sp.）

<400> 5

Met Asp Ala Asp Met Ala Val Ser Ser Ala Arg Arg Trp Trp Ala Val

1 5 1015

Gly Ala Leu Ala Leu Ser Ala Leu Val Val Gly Leu Asp Thr Thr Val

202530

Leu Asn Val Ala Leu Pro Thr Leu Ala Thr Asp Leu Gln Ala Ser Thr

354045

Ser Gln Leu Gln Trp Phe Ala Asn Ala Tyr Asn Leu Val Phe Ala Ala

505560

Val Leu Leu Pro Ala Gly Leu Ser Gly Asp Arg Phe Gly Arg Lys Lys

65707580

Leu Leu Val Ala Ala Leu Val Leu Phe Gly Ala Ala Ser Val Gly Cys

859095

Ala Tyr Ser Gly Ser Thr Asp Ala Leu Ile Trp Trp Arg Ala Leu Leu

100 105 110

Gly Leu Gly Ala Gly Phe Ile Phe Pro Leu Ser Leu Ser Val Leu Pro

115 120 125

Val Met Phe Asp Asp Glu Glu Arg Pro Lys Ala Ile Gly Met Val Val

130 135 140

Thr Ala Ser Ala Leu Gly Leu Pro Leu Gly Pro Ile Val Gly Gly Trp

145 150 155 160

Leu Leu Asp Asn Phe Trp Trp Gly Ser Val Phe Leu Ile Asn Val Pro

165 170 175

Met Val Ala Leu Ala Ile Val Ala Val Ala Leu Leu Met Pro Asp Ser

180 185 190

Arg Ser Pro Glu Pro Pro Gly Leu Asp Leu Val Gly Val Leu Leu Ser

195 200 205

Ser Ala Gly Leu Ala Gly Val Thr Tyr Gly Ala Ile Glu Ala Gly Glu

210 215 220

Lys Gly Trp Gly Asn Gly Thr Thr Leu Ala Leu Leu Ile Gly Gly Leu

225 230 235 240

Val Leu Val Leu Leu Phe Val Ala Trp Gln Arg Met Leu Gly Ala Arg

245 250 255

Pro Gly Gly Lys Pro Leu Val Asp Leu Ser Leu Phe Arg Ala Pro Ala

260 265 270

Phe Thr Trp Gly Ala Val Met Ala Ile Val Leu Ser Phe Ala Leu Phe

275 280 285

Gly Leu Leu Phe Thr Val Pro Gln Tyr Tyr Gln Ala Val Leu Gly Thr

290 295 300

Asp Ala Leu Gly Thr Gly Leu Arg Leu Leu Pro Ile Ile Gly Gly Ile

305 310 315 320

Ile Val Gly Ala Arg Val Gly Gly Lys Val Ala Pro Lys Ala Gly Ser

325 330 335

Lys Gly Leu Ile Ser Ala Gly Phe Leu Leu Met Ala Val Gly Leu Phe

340 345 350

Met Gly Ala Val Thr Lys Thr Gly Thr Ser Tyr Gly Tyr Ala Ala Thr

355 360 365

Trp Ile Ala Ile Val Gly Leu Gly Thr Gly Leu Ala Leu Pro Leu Ala

370 375 380

Val Asp Ser Ala Leu Gly Ala Leu Pro Thr Glu Arg Ser Gly Val Gly

385 390 395 400

Ser Ala Val Ile Gln Thr Val Arg Gln Val Gly Gly Thr Val Gly Val

405 410 415

Ala Ile Leu Gly Thr Val Leu Thr Asn Ala Tyr His Ser His Leu Glu

420 425 430

Val Gly Ala Ile Pro Ala Pro Ala Gly Asp Ala Ala Arg Glu Ser Val

435 440 445

Ser Ala Gly Val Val Val Ala Lys Lys Leu His Ser Thr Ser Leu Leu

450 455 460

Ser Asn Val Gln Asp Ser Phe Val His Gly Met Asn Val Met Leu Ile

465 470 475 480

Val Cys Gly Ala Ile Ala Val Val Gly Thr Val Leu Ala Val Ala Phe

485 490 495

Ile Pro Arg Gln Thr Val Arg Ala Asp Gln Gly Ala Asp Gly Val Ala

500 505 510

Pro Thr Asp Ala Gln Ala Arg Gly Ala Leu

515 520