小鼠 Shank 3 基因 cRNA 探针及原位杂交显色方法

摘要

本发明提供一种小鼠Shank 3基因cRNA探针及原位杂交显色方法：该cRNA探针包括与小鼠Shank 3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465‑4108位互补的核苷酸序列。将小鼠脑组织标本置于杂交液中；杂交完成后漂洗、封闭，与抗体结合；然后利用TSA‑biotin放大处理后进行荧光显色。本发明提出的cRNA探针针对Shank 3基因的特异性高，在不同个体的脑组织中均可以高效完成Shank 3基因的识别，可确保小鼠Shank 3基因原位杂交显色的特异性和高效性，显色效果更好，可与其他杂交或免疫荧光染色结合使用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体涉及一种Shank 3基因cRNA探针及其荧光原位杂交显色方法。

背景技术

Shank家族是一类新发现的支架蛋白，其可通过不同的结构域与细胞内多种蛋白相互作用，发挥多种作用。研究表明其中的Shank3基因与自闭症的发病密切相关，Shank3基因的突变可导致自闭症样行为的出现。蛋白相互作用等研究表明Shank3蛋白可能通过不同结构域与胞内多种蛋白相互作用，最终影响细胞骨架和突触的结构与功能等。但关于这方面的形态学证据明显不足，主要受限于目前商品化的抗体均不能清晰显示Shank3蛋白的细胞内定位。

基于cRNA探针的原位杂交显色方法在基因功能研究领域得到一定的应用，例如中国专利CN102559904A、CN106916886A。但是，筛选针对Shank家族，特别是Shank3基因的兼具杂交特异性和显色灵敏性的cRNA探针还是领域内的难题。尽管利用具有放大显色效果功能的试剂进行处理，更利于显色，但是，目前尚未见到适合于Shank家族，特别是Shank3的cRNA探针原位杂交显色用放大体系，这也是导致相应的cRNA探针一直未能获得的一个重要原因。此外，现有基于cRNA探针的显色方法存在显色试剂(例如放大用试剂，杂交液)组成复杂等不足之处，同时，显色效果仍有待提高。

目前尚未见到针对Shank3基因的cRNA探针及荧光原位杂交显色方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种小鼠Shank 3基因cRNA探针及原位杂交显色方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种小鼠Shank 3基因cRNA探针，该cRNA探针包括与小鼠Shank 3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465-4108位互补的核苷酸序列，或者包括该核苷酸序列的同源序列。

优选的，所述cRNA探针的序列如SEQ.ID.NO.3所示(尽管实际探针为该序列中T替换为U后的RNA序列，但是本领域通常以对应的U替换为T后的DNA形式表示cRNA，包括mRNA的参考序列也是如此)。

优选的，所述同源序列是以小鼠脑组织cDNA为模板，并使用以下引物扩增得到的：

上游引物：5’-ACCCGAGACTCTGAGAGAGG-3’；

下游引物：5’-AATGGTGCTTGTGGTCTCCA-3’。

优选的，所述cRNA探针上标记有地高辛。

一种小鼠Shank 3基因原位杂交显色方法，包括以下步骤：

1)制备用于原位杂交的小鼠脑组织标本(例如冰冻切片)；

2)将小鼠脑组织标本依次经过杂交前处理、杂交预处理后置于杂交液中进行原位杂交；所述原位杂交中采用的杂交液由杂交预处理中使用的预杂交液和小鼠Shank 3基因cRNA探针组成，所述cRNA探针包括与小鼠Shank 3基因mRNA参考序列NM_021423.3的3465-4108位互补的核苷酸序列，或者包括该核苷酸序列的同源序列；该cRNA探针上标记有地高辛；

3)杂交完成后依次进行漂洗、封闭，然后利用针对地高辛的抗体对结合在小鼠脑组织标本上的cRNA探针进行识别；然后利用TSA-biotin对结合在小鼠脑组织标本上的cRNA探针进行放大处理，然后进行荧光显色；TSA-biotin由0.05g BSA、5μL tyramide-biotin、15μL的1.0mg/mL葡萄糖氧化酶、50μL的200mg/mLβ-D-葡萄糖以及5mL0.1M PB组成；放大处理的条件为：经TNT以及0.1M PB漂洗后，于TSA-biotin中避光孵育20-40分钟。

优选的，所述杂交前处理中，将小鼠脑组织标本依次置于以下液体中进行处理：含体积分数1-3％H₂O₂的0.1M>

优选的，所述杂交预处理的条件为：于预杂交液中55-60℃孵育1-2小时；所述预杂交液由0.5mL的去离子甲酰胺、0.25mL的20×SSC、0.2mL的10％的封闭剂、0.01mL的10％SDS，以及0.05mL的2％的NLS组成。

优选的，所述原位杂交的条件为：于杂交液中55-60℃孵育16-20小时，所述杂交液中cRNA探针的浓度为1-2μg/mL。

优选的，所述漂洗、封闭具体包括将杂交后小鼠脑组织标本依次置于以下液体中进行的处理：于漂洗液中55-60℃漂洗2-3次，每次20-30分钟，漂洗液由0.5mL的去离子甲酰胺、0.1mL的20×SSC、0.05mL的2％的NLS以及0.35mL的双蒸水组成；于RNase A终浓度为20μg/mL的RNase缓冲液中37℃孵育30-40分钟，RNase缓冲液由0.01mL的1M Tris-HCl(pH8.0)、0.002mL的0.5MEDTA、0.1mL的5M NaCl以及0.888mL的双蒸水组成；于含0.1％NLS的2×SSC中37℃漂洗2-3次，每次20-30分钟；于含0.1％NLS的0.2×SSC中37℃漂洗2-3次，每次20-30分钟；于TS7.5中孵育10-20分钟；于TBS中孵育1-2小时(封闭)；所述针对地高辛的抗体选自Anti-Digoxigenin-POD，识别采用的孵育条件为：于含Anti-Digoxigenin-POD的TBS中孵育12-16小时，Anti-Digoxigenin-POD:TBS的体积比为1:500-1000。

优选的，所述荧光显色具体包括以下步骤：将放大处理后的小鼠脑组织标本经TNT以及0.1M PB漂洗后，于含有标记FITC的avidin的TBS中避光孵育2-4小时，所述标记FITC的avidin选自Avidin,FITC conjugate，Avidin,FITC conjugate:TBS的体积比为1:500-1000。

本发明的有益效果体现在：

本发明提出的cRNA探针针对Shank 3基因的特异性高，在不同个体的脑组织中均可以高效完成Shank 3基因的识别，可确保小鼠Shank 3基因原位杂交显色的特异性和高效性。

进一步的，本发明提出的扩增引物具有极高的特异性，可以特异性地扩增出shank3的目的基因片段，经blastn比对，没有其他同源序列。

本发明对放大荧光显色效果中使用的反应试剂以及放大工艺条件(例如处理时间)进行了优化，可以特异性地放大杂交信号，实现了Shank 3基因的cRNA探针原位杂交显色。基于TSA-Biotin放大的荧光显色可以同其他荧光原位杂交或免疫荧光显色结合使用，从而实现多重荧光原位杂交或原位杂交与免疫组化的多重标记。

进一步的，本发明所用试剂组成更为简单，可分装放置，使用前再混合均匀，存放时间较长，经济便捷。

附图说明

图1为反义探针在小鼠大脑皮质的分布；

图2为正义探针在小鼠大脑皮质的分布。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例用于解释本发明，而非对本发明的限定。

本发明构建了小鼠Shank3基因的cRNA探针，并通过荧光原位杂交的方法清晰显示了小鼠Shank3基因在正常小鼠脑组织中的表达情况，为进一步进行双重标记提供了实验依据。

一、Shank 3基因cRNA探针制备

1.根据小鼠Shank 3基因mRNA在Gene bank中的参考序列(NM_021423.3)，采用blastn选择相对特异性片段，结合本发明提出的荧光原位杂交显色方法，最终确定了针对Shank3cRNA构建的特异性片段(nucleotides 3465-4108；GenBank accession No.NM_021423.3)。

2.针对该片段利用primer-blast工具，设计出特异性引物(设计完成时间2016年5月)，并且利用该引物的扩增产物(684bp的Shank 3片段)构建Shank 3基因的特异性探针序列(同Shank 3基因mRNA参考序列NM_021423.3比对结果为：max score＝1264，total score＝1264，query cover＝100％，E value＝0，Identities＝100％)。

特异性上游引物为：5’-ACCCGAGACTCTGAGAGAGG-3’(SEQ.ID.NO.1)

特异性下游引物为：5’-AATGGTGCTTGTGGTCTCCA-3’(SEQ.ID.NO.2)

特异性探针序列，即cRNA探针(SEQ.ID.NO.3，其中下划线部分为引物)：

3.以小鼠全脑cDNA为模板(小鼠来源：8周龄C57BL6小鼠，来自第四军医大学实验动物中心；样本采集时间：2016年7月)，使用上述引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳可见扩增产物单一、大小接近700bp。使用凝胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-01)进行回收。将回收产物与含有T7、SP6启动子的克隆载体(TOPA TA克隆试剂盒，Invitrogen，45-0640)室温下连接15分钟(按照克隆试剂盒说明书操作)。将连接好的质粒转化DH5α感受态细胞(TIANGEN，CB101)后进行培养、菌落PCR鉴定并同时测序(上海生工)，测序结果表明无突变，插入方向为：反义探针(即cRNA探针)位于T7下游，正义探针位于SP6下游。

4.使用T7、SP6通用引物对鉴定正确的质粒进行PCR扩增，使用凝胶回收试剂盒(OMEGA，D2500-01)对扩增产物进行回收。针对回收产物，使用体外转录试剂盒(Invitrogen，AM1322)和DIG RNA探针标记试剂盒(ROCHE，11277073910)进行体外转录(分别转录正、反义探针)和探针标记(依据测序结果选择SP6或T7启动子，就可以分别转录并标记正义或反义探针)。用超微量核酸检测仪检测探针浓度并稀释至100μg/mL，分装并做好标记后置入-20℃冰箱备用。

二、Shank 3基因cRNA探针荧光原位杂交显色

1.标本制备：成年C57小鼠经心脏灌注30mL0.01M DEPC-PBS，给予100mL 4％多聚甲醛进行固定；取脑置入4％多聚甲醛中后固定不低于24小时；之后将脑置入30％蔗糖溶液中脱水不低于24小时；之后在恒冷箱切片机中将脑进行冠状位的冰冻切片，切片厚度30μm，置入0.01M DEPC-PBS中备用。

2.杂交前处理：依次将切片放入以下液体中：含2％H₂O₂的0.1M>

3.杂交：将切片放入预杂交液(每1mL预杂交液由0.5mL的去离子甲酰胺、0.25mL的20×SSC、0.2mL的10％的封闭剂、0.01mL的10％SDS，以及0.05mL的2％的NLS组成)中，置入杂交炉中58℃孵育1小时，杂交炉转速10-12次/分钟；之后将切片放入杂交液(上述预杂交液+探针，探针终浓度为1μg/mL)，置入杂交炉中58℃孵育16-20小时，杂交炉转速10-12次/分钟。

4.杂交后漂洗：将切片放入漂洗液(高浓度甲酰胺漂洗)中，每1mL漂洗液由0.5mL的去离子甲酰胺、0.1mL的20×SSC、0.05mL的2％的NLS以及0.35mL的双蒸水组成，置入杂交炉中58℃(同杂交温度)漂洗2次，每次20分钟，杂交炉转速20次/分钟；将切片放入含RNaseA终浓度为20μg/L的RNase缓冲液中(降解游离探针及其他mRNA)，RNase缓冲液由0.01mL的1M Tris-HCl(pH 8.0)、0.002mL的0.5M EDTA、0.1mL的5M NaCl以及0.888mL的双蒸水组成，置入杂交炉中37℃孵育30分钟，杂交炉转速10-12次/分钟；将切片放入含0.1％NLS的2×SSC中(高浓度盐溶液漂洗)，置入杂交炉中37℃漂洗2次，每次20分钟，杂交炉转速20次/分钟；将切片放入含0.1％NLS的0.2×SSC中(低浓度盐溶液漂洗)，置入杂交炉中37℃漂洗2次，每次20分钟，杂交炉转速20次/分钟；将切片放入TS7.5中孵育10分钟；将切片放入TBS中室温孵育1小时；之后将切片放入含Anti-Digoxigenin-POD(Roche，11207733910；1:500，抗体比TBS的体积比)的TBS中室温孵育过夜。

5.TSA-Biotin放大及荧光显色：将切片放入TNT中室温漂洗3次，每次10分钟；将切片放入0.1M PB中室温漂洗10分钟；将切片放入TSA-Biotin中(每5mL0.1M PB中添加0.05gBSA、5μL tyramide-biotin、15μL的1.0mg/mL葡萄糖氧化酶以及50μL的200mg/mLβ-D-葡萄糖)，室温避光孵育30分钟；将切片放入0.1M PB中室温漂洗10分钟；将切片放入TNT中室温漂洗3次，每次10分钟；之后将切片放入含Avidin,FITC conjugate(Invitrogen，AM9763；1:500，抗体比TBS的体积比)的TBS中室温避光孵育4小时。

6.裱片观察：将切片放入TNT中室温漂洗3次，每次10分钟；将切片裱在玻片上，用荧光封片剂封片后，荧光显微镜下观察结果如图1所示。通过图2正义探针作为参照，可以看出，反义探针可以特异性地清晰显示小鼠脑部Shank3基因的表达。

三、实验补充说明

(1)实施例所用试剂来源如下：

封闭剂，公司：Roche，货号：1096176；葡萄糖氧化酶，公司：sigma，货号：G7141；1MTris-HCl(pH 8.0)，公司：invitrogen，货号：15568-025；1M Tris-HCl(pH7.5)，公司：invitrogen，货号：15567-027；20×SSC，公司：invitrogen，货号：15557-044；Biotin-NHS，公司：Merck，货号：203112；BSA，公司：Genview，货号：DH016-1.1；DEPC，公司：MP，货号：150902；DMSO，公司：Genview，货号：DH105-7；0.5M EDTA，公司：Amresco，货号：E552；NLS，公司：sigma，货号：61739；RNase A，公司：cwbio，货号：CW0600S；10％SDS，公司：西安森物生物，货号：WB024；Triton X-100，公司：Genview，货号：DH351-1；Tween 20，公司：Amresco，货号：0777。

(2)实施例所用溶液配方如下：

①0.01M DEPC-PBS(pH 7.4)：2.8g Na₂HPO₄·12H₂O、0.3g>2PO₄·2H₂O以及9gNaCl溶于900mL双蒸水中，最终定容至1000mL，NaOH调节pH值为7.4，然后加入1ml>2HPO₄·12H₂O和0.3g>2PO₄·2H₂O溶于900mL双蒸水中，最终定容至1000mL，NaOH调节pH值为7.4。0.1M>

②0.1M三乙醇胺(pH 8.0)：1.36mL的三乙醇胺溶于100mL的DEPC-DDW中，HCl调节pH值为8.0；

③5M NaCl：292.2g NaCl溶于900mL双蒸水，最终定容至1000mL。

④TS7.5：100mL1M Tris-HCl(pH7.5)、30mL 5M NaCl溶于870mL双蒸水中。

⑤TNT：0.5mL Tween 20溶于1000mL1M Tris-HCl(pH7.5)中。

⑥10％的封闭剂：0.1g封闭剂溶于1mL 0.1M的马来酸缓冲液中，NaOH调节pH值为7.5，高压灭菌备用。

⑦TBS：10mL 10％的封闭剂溶于90mL TS7.5中。

⑧2％的NLS：0.02g的NLS溶于1mL的DEPC-DDW。

⑨1.0mg/mL的葡萄糖氧化酶：1mg的葡萄糖氧化酶溶于1mL双蒸水中，分装放置在-20℃。200mg/mL的β-D-葡萄糖：200mg的β-D-葡萄糖溶于1mL双蒸水中，分装放置在-20℃。

⑩tyramide-biotin：15mg的对羟基苯乙胺盐酸盐溶于300μL的DMSO中制成对羟基苯乙胺盐酸盐溶液；3.5mg的Biotin-NHS溶于36.5μL的DMSO中制成Biotin-NHS溶液；将36.5μL的对羟基苯乙胺盐酸盐溶液溶于等体积的Biotin-NHS溶液中，室温避光孵育过夜；加入7.3μL乙醇胺，室温孵育4-5小时，分装放置在-20℃。

四、本发明的优势

所选用探针特异性高；优化了杂交步骤，所用杂交液配方组成更为简单，引入了TSA-Biotin放大，显色效果更好；可与其他杂交或免疫荧光染色结合使用。

序列表

<110> 中国人民解放军第四军医大学

<120> 小鼠Shank 3基因cRNA探针及原位杂交显色方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

acccgagact ctgagagagg 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 2

aatggtgctt gtggtctcca 20

<210> 3

<211> 684

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 3

acccgagact ctgagagagg accgttggct tccccagcct tctcccctcg gagtccagcg 60

tggattccag tgcctgctcg gagagaggca gagaagcccc ctcgggaaga gcggaagtca 120

ccagaggaca agaagtccat gatcctcagc gtcttggaca cgtccttgca acggccagct 180

ggcctcattg ttgtgcatgc caccagcaat gggcaggagc ccagcaggct gggggctgaa 240

gaggagcgcc ccggtactcc ggagctggcc ccagccccca tgcaggcagc agctgtggca 300

gagcccatgc caagcccccg ggcccagccc cctggcagca tcccagcaga tcccgggcca 360

ggtcaaggca gctcagagga ggagccagag ctggtattcg ctgtgaacct gccacctgct 420

cagctgtcct ccagcgatga ggagaccaga gaggagctgg cccgcatagg gctagtgcca 480

ccccctgaag agtttgccaa tgggatcctg ctgaccaccc cgcccccagg gccgggcccc 540

ttgcccacca cggtacccag cccggcctca gggaagccca gcagcgagct gccccctgcc 600

cctgagtctg cagctgactc tggagtagag gaggctgaca ctcgaagctc cagtgacccc 660

cacctggaga ccacaagcac catt 684