一种油用牡丹丹凤幼胚离体培养基及其培养方法

摘要

本发明公开了一种油用牡丹丹凤的幼胚离体培养的培养基配方，包含以下组分：改良MS培养基、TDZ、2,4‑D、GA3、Vc、活性炭、蔗糖和琼脂。利用本发明可以解决油用牡丹幼体离体培养发苗率低和褐化现象严重的问题，并且降低了幼胚在离体培养过程中的污染率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种培养基配方，特别涉及一种油用牡丹丹凤的幼胚离体培养的培养基配方。

背景技术

油用牡丹是具有增收效益较好的一种木本粮油植物，其籽油不饱和脂肪酸含量高达92％以上，多项指标均超过橄榄油，具有良好的市场前景。但是育种再经播种繁殖获得种苗的周期长，而且自然状态下的种子萌发率较低、很难获得整齐一致的种苗，利用幼胚离体培养可使油用牡丹种胚快速萌发成苗，提高种子萌发率。但是在油用牡丹幼胚离体培养的过程中，发现其对离体培养的条件要求苛刻，幼胚萌芽率低，容易出现褐化，且幼胚经离体培养后成苗率不稳定，差异较大。

发明内容

发明目的：本发明提供一种油用牡丹丹凤的幼胚离体培养的培养基配方，可以解决油用牡丹幼体离体培养发苗率低和褐化现象严重的问题。本发明的另一目的为提供油用牡丹丹凤幼胚离体配方方法。

技术方案：本发明所述一种油用牡丹丹凤的幼胚离体培养的培养基配方，包含以下组分：改良MS培养基、TDZ、2,4-D、GA₃、Vc、活性炭、蔗糖和琼脂。

所述配方包含以下组分：0.05-0.2mg/L TDZ、0.1-0.3mg/L2,4-D、0.25mg/L>3、0.15g/L>

所述TDZ为0.1-0.2mg/L；所述2,4-D为0.1-0.2mg/L；所述TDZ与2,4-D质量比为1:1。

所述改良MS培养基包含以下组分：

大量元素：825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、800-1000mg/L二水氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L磷酸二氢钾；

微量元素：22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.025mg/L硫酸铜、0.25mg/L钼酸钠和0.025mg/L六水氯化钴；

铁盐：18.65mg/L乙二胺四乙酸二钠和13.9mg/L硫酸亚铁；

有机物：0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸毗哆醇、l00mg/L肌醇和2mg/L甘氨酸。

所述培养基配方的pH为5.6-6.0。

利用上述培养基配方培养幼胚离体的方法为将剥离的幼胚在超净台上接种至配制好的灭菌的培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度25-27℃，每日光照时间为16小时。

有益效果：(1)本发明采用改良MS培养基作为油牡丹幼胚离体培养的培养基，可显著提高萌芽率；(2)本发明方法培养的油牡丹丹凤幼胚离体培养无褐化发生；(3)采用本发明的配方萌芽率高，褐化率为0，降低了污染率，为油用牡丹丹凤的扩繁提供有力保障，有利于工厂化生产。

具体实施方式

一、原料来源

本发明中所用的原料均为市购所得。

一、MS改良培养基的配制

1.1每升改良MS培养基中含大量元素：825mg硝酸铵、950mg硝酸钾、800-1000mg二水氯化钙、370mg硫酸镁、170mg磷酸二氢钾。

微量元素：22.3mg硫酸锰、8.6mg硫酸锌、6.2mg硼酸、0.83mg碘化钾、0.025mg硫酸铜、0.25mg钼酸钠、0.025mg六水氯化钴。

铁盐：18.65mg乙二胺四乙酸二钠、13.9mg硫酸亚铁。

有机物：0.5mg烟酸、0.5mg盐酸硫胺素、0.5mg盐酸毗哆醇、l00mg肌醇、2mg甘氨酸。

1.2MS改良培养基的配制

1.2.1 50倍大量元素母液的配制：分别称取41.25g硝酸铵、47.5g硝酸钾、18.5g硫酸镁，然后用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ。

称取44g二水氯化钙，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅱ。

称取8.5g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅲ。

使用时配制每升培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml。

1.2.2 200倍的微量元素母液的配制：称取4.46g硫酸锰、1.72g硫酸锌、1.24g硼酸、0.166g碘化钾、0.005g硫酸铜、0.05g钼酸钠、0.005g六水氯化钴，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅳ，使用时配制每升培养基取5ml母液Ⅳ。

1.2.3 100倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取1.865g乙二胺四乙酸二钠，加200ml蒸馏水进行溶解，称取1.39g硫酸亚铁加入溶解，溶解时需要用电热炉加热，当溶液呈浅棕色透明液体时，停止加热，加蒸馏水定容至1000mL，配成母液Ⅴ，使用时配制每升培养基取10ml母液Ⅴ。

1.2.4 100倍的有机成分母液的配制：称取0.05g烟酸，0.05g盐酸硫胺素，0.05g盐酸吡哆醇，10g肌醇，0.2g甘氨酸，用蒸馏水溶解后混合定容至1000ml，配成母液Ⅵ，使用时配制每升培养基取10ml母液Ⅵ。

二、激素母液的配制

2.1TDZ母液的配制

称取10mg TDZ，先用5ml 0.1mol·L^-1NaOH溶液溶解，然后加水定容至100ml，配成0.1mg·mL^-1的TDZ母液，使用时配制每升培养基取0.5-2mL>

2.2 2，4-D母液的配制

称取10mg 2，4-D，先用5ml体积浓度95％的酒精溶解，然后加水定容至100mL，配成0.1mg·mL^-1的2，4-D母液，使用时配制每升培养基取1-3mL2，4-D母液。

2.3GA₃母液的配制

称取10mg>3，先用5ml体积浓度95％的酒精溶解，然后加水定容至100ml，配成0.1mg·mL^-1的GA₃母液，使用时配制每升培养基取2.5mL>3母液。

2.4幼胚离体培养基的制备

取上述1.2.1、1.2.2、1.2.3、1.2.4配制的每升培养基的用量，再加入琼脂6g，蔗糖30g，2.2步骤中配制的2，4-D母液1-3mL，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L^-1盐酸或氢氧化钠调pH值至5.8，灭菌；待培养基温度降至60-70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加2.1和2.3步骤中配制的TDZ和GA₃母液，每升培养基加TDZ母液0.5-2mL，GA₃母液2.5mL，然后在接种台上分装培养基。

三、MS培养基

3.1每升MS培养基中的成分

大量元素：1650mg硝酸铵、1900mg硝酸钾、440mg二水氯化钙、370mg硫酸镁、170mg磷酸二氢钾。

微量元素：22.3mg硫酸锰、8.6mg硫酸锌、6.2mg硼酸、0.83mg碘化钾、0.025mg硫酸铜、0.25mg钼酸钠、0.025mg六水氯化钴。

铁盐：37.3mg乙二胺四乙酸二钠、27.8mg硫酸亚铁。

有机物：0.5mg烟酸、0.5mg盐酸硫胺素、0.5mg盐酸毗哆醇、l00mg肌醇、2mg甘氨酸。

3.2配制MS培养基

3.2.1 50倍大量元素母液的配制：分别称取82.5g硝酸铵、95g硝酸钾、18.5g硫酸镁，然后用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅰ。

称取22g二水氯化钙，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅱ。

称取8.5g磷酸二氢钾，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅲ。

使用时配制每升培养基取母液Ⅰ，母液Ⅱ，母液Ⅲ各20ml。

3.2.2 200倍的微量元素母液的配制：称取4.46g硫酸锰、1.72g硫酸锌、1.24g硼酸、1.66g碘化钾、0.005g硫酸铜、0.05g钼酸钠、0.005g六水氯化钴，用蒸馏水溶解后定容至1000ml，配成母液Ⅳ，使用时配制每升培养基取5ml母液Ⅳ。

3.2.3 100倍的EDTA-铁盐母液的配制：称取3.73g乙二胺四乙酸二钠，加200ml蒸馏水进行溶解，称取2.78g硫酸亚铁加入溶解，溶解时需要用电热炉加热，当溶液呈浅棕色透明液体时，停止加热，加蒸馏水定容至1000mL，配成母液Ⅴ，使用时配制每升培养基取10ml母液Ⅴ。

3.2.4 100倍的有机成分母液的配制：称取0.05g烟酸，0.05g盐酸硫胺素，0.05g盐酸吡哆醇，10g肌醇，0.2g甘氨酸，用蒸馏水溶解后混合定容至1000ml，配成母液Ⅵ，使用时配制每升培养基取10ml母液Ⅵ。

三、室内试验

1、钙离子浓度对丹凤幼胚离体培养的影响

利用2.4方法制备幼胚离体培养基，培养基中含有825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、二水氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L磷酸二氢钾、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.025mg/L硫酸铜、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L六水氯化钴、18.65mg/L乙二胺四乙酸二钠、13.9mg/L硫酸亚铁、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸毗哆醇、l00mg/L肌醇、2mg/L甘氨酸0.1mg/L TDZ、0.2mg/L2,4-D、0.25mg/LGA₃、0.15g/L>

表1 二水氯化钙对丹凤幼胚的影响

四、实施例

实施例1：利用2.4方法制备幼胚离体培养基，培养基中含有825mg/L硝酸铵、950mg/L硝酸钾、880mg/L二水氯化钙、370mg/L硫酸镁、170mg/L磷酸二氢钾、22.3mg/L硫酸锰、8.6mg/L硫酸锌、6.2mg/L硼酸、0.83mg/L碘化钾、0.025mg/L硫酸铜、0.25mg/L钼酸钠、0.025mg/L六水氯化钴、18.65mg/L乙二胺四乙酸二钠、13.9mg/L硫酸亚铁、0.5mg/L烟酸、0.5mg/L盐酸硫胺素、0.5mg/L盐酸毗哆醇、l00mg/L肌醇、2mg/L甘氨酸0.05mg/L TDZ、0.1mg/L 2,4-D、0.25mg/L>3、0.15g/L>

实施例2：TDZ为0.2mg/L，2,4-D为0.3mg/L，其余同实施例1。

30天后，油牡丹“丹凤”幼胚萌芽率达95.2％，褐化率为0，污染率为1.9％。

实施例3：TDZ为0.1mg/L，2,4-D为0.1mg/L，其余同实施例1。

实施例4：TDZ为0.2mg/L，2,4-D为0.2mg/L，其余同实施例1。

对照1：按照3.2.1、3.2.2、3.2.3、3.2.4中配制每升培养基的用量加入后，在加入琼脂6g，2，4-D母液3mL，加热溶解后定容至1L，用0.lmol·L-1盐酸或氢氧化钠调pH值至5.8，灭菌；待培养基温度降至60-70℃时，在接种台上采用过滤灭菌法添加2.1和2.3部分配制的TDZ和GA₃母液，每升培养基加TDZ母液2mL，GA₃母液2.5mL，然后在接种台上分装培养基。

对照2：利用2.4方法制备幼胚离体培养基，其中不添加TDZ、GA₃和2，4-D，pH为5.8，其余同实施例1。

对照3：利用2.4方法制备幼胚离体培养基，其中TDZ为0.05mg/L，2,4-D为0.1mg/L，活性炭2g/L，pH为5.8。在光照强度1000Lux的条件下培养，培养条件为：温度20℃，每日光照时间为8小时。

五、丹凤幼胚离体培养

利用制备的样品培养丹凤幼胚，将剥离的幼胚在超净台上接种至配制好的灭菌的培养基上，在光照强度3000Lux的条件下培养，培养条件为：温度25-27℃，每日光照时间为16小时，培养时间为30天。

幼胚萌芽率＝萌发幼胚数/接种幼胚数*100％

褐化率＝褐化幼胚数/接种幼胚数*100％

污染率＝幼胚污染瓶数/接种幼胚瓶数*100％

表2 培养基配方对丹凤幼胚离体培养的影响

样品幼胚萌芽率(％)褐化率(％)污染率(％)实施例185.601.2实施例295.201.9实施例396.401.1实施例497.200.8对照165.1023.9对照219.228.52.7对照335.601.8

由表2的结果可以看出，本发明通过改良的MS培养基，降低培养基中的糖含量，同时不影响幼胚的生长，糖含量的降低可以显著降低丹凤牡丹培养过程中的污染率，另外添加生长激素能够显著的促进油用牡丹丹凤幼胚在离体培养过程中的发芽率和培养的褐化率，此外，在TDZ与GA3质量比为1:1时，促进幼胚离体生长的效果最佳。