一种大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法

摘要

本发明公开了大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法。本发明方法从大黄药材中分离得到了三种二苯乙烯类化学对照品和两种苯丁酮类化学对照品，为3,5‑二羟基‑4’‑甲氧基芪‑3‑O‑β‑D‑葡萄糖苷以及两组同分异构体：白藜芦醇‑4'‑O‑β‑D‑(2”‑O‑没食子酰)‑葡萄糖苷和白藜芦醇‑4'‑O‑β‑D‑(6”‑O‑没食子酰)‑葡萄糖苷，莲花掌苷和异莲花掌苷。本发明方法稳定好、重复性高，非常适合大黄药材中上述五种化学对照品的制备。

说明书

技术领域

本发明涉及一种化学对照品的制备方法，尤其涉及一种大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法。

背景技术

掌叶大黄(Rheum palmatum L.)、唐古特大黄(Rheum tanguticum Maxim.ExBalf.)和药用大黄(Rheum officinale Baill.)为蓼科植物，是大黄药材的主要来源，主要化学成分有鞣质、苯丁酮类、二苯乙烯类、蒽醌类。具有较强的抗菌、解热、保肝、降血脂、止血、抗肿瘤、调节免疫等多重作用。然而，目前用于大黄药材及其产品质量控制的化学成分为5种游离蒽醌，不足以全面反映大黄药材的质量。因此，建立多种类多指标化学成分的质量控制方法对于大黄药材的综合开发利用具有重要意义，而化学对照品的缺乏严重制约了这方面的研究。主要原因是缺乏重复性及稳定性好的相关化学对照品的提取分离制备方法。

长期以来，传统的药材分离制备方法如硅胶层析等存在样品组分损失、玷污、变性、失活、拖尾，分离困难，收率低等问题。高速逆流色谱(HSCCC)是由美国国立卫生研究院(NIH)的Yoichiro Ito博士于上世纪80年代发明的一种基于液-液分配机理的新型色谱分离纯化技术，无需固体作固定相，不存在固体对样品组分的吸附、玷污、变性、失活、拖尾等现象，能实现很高的回收率，在天然产物有效成分的分离、纯化、制备方面显示出强大的优势，非常适合于化学对照品的制备。本发明建立了大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备方法，采用本发明方法分离得到了三种二苯乙烯类化学对照品和两种苯丁酮类化学对照品，为3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷以及两组同分异构体：白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷，莲花掌苷和异莲花掌苷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种稳定性和重复性好的大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法。

为解决上述问题，本发明所述的大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法，包括以下步骤：

(1)提取：将大黄药材干燥根粉碎，以1g：5mL～30mL的比例用体积浓度为30～95％的乙醇在提取温度为60～90℃、提取次数1～4次、每次1～4h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经除杂处理后经减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；所述提取步骤中大黄药材干燥根是指蓼科植物掌叶大黄、或唐古特大黄、或药用大黄的干燥根；

(2)富集：将所述提取物浓缩液用石油醚萃取，得到石油醚部位和水部位；将所述水部位上大孔树脂，先用10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，再用20％～60％乙醇溶液洗脱流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；将所述洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；

(3)分离纯化：将所述富含目标化合物的提取物粉末先用循环高速逆流色谱分离，未分离组分采用制备液相色谱分离，得到5种纯度高于98％的单体化合物。

(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过¹H-NMR和¹³C-NMR进行结构鉴定为3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷；所述白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷为同分异构体，莲花掌苷和异莲花掌苷为同分异构体。

进一步地，所述富集步骤中大孔树脂为D101、AB-8、S-8、X-5、D3520中的任意一种；

进一步地，所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为2～10次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为600～1000rpm，分离温度为20～40℃，流动相流速为1.5～4mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相。

进一步地，所述分离纯化步骤中制备液相色谱分离时采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为20％～50％的甲醇或乙腈溶液，检测波长为300nm；所述流动相流速为10～100mL/min。

本发明与现有技术相比具有以下优点：

1、本发明采用循环高速逆流色谱首次同时分离得到了3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷三种极性相近的苷类化学对照品，其中莲花掌苷和异莲花掌苷为同分异构体。

2、本发明重复性和稳定性好，非常适合大黄药材中3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷化学对照品的制备。

3、本发明操作简单、方便、易于实现自动化控制。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1为本发明3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷(1)、莲花掌苷(2)、异莲花掌(3)、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷(4)、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷(5)的HSCCC分离图。

图2为本发明白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷(4)和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷(5)的制备液相分离图。

图3为本发明3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷(1)的纯度检测图。

图4为本发明莲花掌苷(2)的纯度检测图。

图5为本发明异莲花掌(3)的纯度检测图。

图6为本发明白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷(4)的纯度检测图。

图7为本发明白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷(5)的纯度检测图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式详细描述本发明的大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法。

实施例1

大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法，包括以下步骤：

(1)提取：将大黄药材干燥根粉碎，以1g：5mL的比例用体积浓度为30％的乙醇在提取温度为60℃、提取次数1次、每次4h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经除杂处理后经减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；所述提取步骤中大黄药材干燥根是指蓼科植物掌叶大黄、或唐古特大黄、或药用大黄的干燥根；

(2)富集：将所述提取物浓缩液用石油醚萃取，得到石油醚部位和水部位；将所述水部位上大孔树脂，先用10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，再用60％乙醇溶液洗脱流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；将所述洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；所述富集步骤中大孔树脂为D101；

(3)分离纯化：将所述富含目标化合物的提取物粉末先用循环高速逆流色谱分离，未分离组分采用制备液相色谱分离，得到5种纯度高于98％的单体化合物，所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为2次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为600rpm，分离温度为20℃，流动相流速为1.5mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相，所述分离纯化步骤中制备液相色谱分离时采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为20％的甲醇或乙腈溶液，检测波长为300nm；所述流动相流速为10mL/min。

(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过¹H-NMR和¹³C-NMR进行结构鉴定为3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷；所述白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷为同分异构体，莲花掌苷和异莲花掌苷为同分异构体。

所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为2次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为600rpm，分离温度为20℃，流动相流速为1.5mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相。

实施例2

大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法，包括以下步骤：

(1)提取：将大黄药材干燥根粉碎，以1g：30mL的比例用体积浓度为95％的乙醇在提取温度为90℃、提取次数4次、每次1h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经除杂处理后经减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；所述提取步骤中大黄药材干燥根是指蓼科植物掌叶大黄、或唐古特大黄、或药用大黄的干燥根；

(2)富集：将所述提取物浓缩液用石油醚萃取，得到石油醚部位和水部位；将所述水部位上大孔树脂，先用10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，再用60％乙醇溶液洗脱流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；将所述洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；所述富集步骤中大孔树脂为AB-8；

(3)分离纯化：将所述富含目标化合物的提取物粉末先用循环高速逆流色谱分离，未分离组分采用制备液相色谱分离，得到5种纯度高于98％的单体化合物。所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为10次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为1000rpm，分离温度为40℃，流动相流速为4mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相，所述分离纯化步骤中制备液相色谱分离时采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为50％的甲醇或乙腈溶液，检测波长为300nm；所述流动相流速为100mL/min。

(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过¹H-NMR和¹³C-NMR进行结构鉴定为3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷；所述白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷为同分异构体，莲花掌苷和异莲花掌苷为同分异构体。

所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为10次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为1000rpm，分离温度为40℃，流动相流速为4mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相，所述分离纯化步骤中制备液相色谱分离时采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为50％的甲醇或乙腈溶液，检测波长为300nm；所述流动相流速为100mL/min。

实施例3

大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法，包括以下步骤：

(1)提取：将大黄药材干燥根粉碎，以1g：25mL的比例用体积浓度为60％的乙醇在提取温度为70℃、提取次数2次、每次3h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经除杂处理后经减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；所述提取步骤中大黄药材干燥根是指蓼科植物掌叶大黄、或唐古特大黄、或药用大黄的干燥根；

(2)富集：将所述提取物浓缩液用石油醚萃取，得到石油醚部位和水部位；将所述水部位上大孔树脂，先用10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，再用40％乙醇溶液洗脱流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；将所述洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；所述富集步骤中大孔树脂为S-8；

(3)分离纯化：将所述富含目标化合物的提取物粉末先用循环高速逆流色谱分离，未分离组分采用制备液相色谱分离，得到5种纯度高于98％的单体化合物，所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为5次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为800rpm，分离温度为20～40℃，流动相流速为4mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相，所述分离纯化步骤中制备液相色谱分离时采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为40％的甲醇或乙腈溶液，检测波长为300nm；所述流动相流速为50mL/min。

(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过¹H-NMR和¹³C-NMR进行结构鉴定为3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷；所述白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷为同分异构体，莲花掌苷和异莲花掌苷为同分异构体。

实施例4

大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法，包括以下步骤：

(1)提取：将大黄药材干燥根粉碎，以1g：15mL的比例用体积浓度为60％的乙醇在提取温度为80℃、提取次数3次、每次2h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经除杂处理后经减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；所述提取步骤中大黄药材干燥根是指蓼科植物掌叶大黄、或唐古特大黄、或药用大黄的干燥根；

(2)富集：将所述提取物浓缩液用石油醚萃取，得到石油醚部位和水部位；将所述水部位上大孔树脂，先用10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，再用40％乙醇溶液洗脱流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；将所述洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；所述富集步骤中大孔树脂为X-5；

(3)分离纯化：将所述富含目标化合物的提取物粉末先用循环高速逆流色谱分离，未分离组分采用制备液相色谱分离，得到5种纯度高于98％的单体化合物，所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为8次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为800rpm，分离温度为30℃，流动相流速为3mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相，所述分离纯化步骤中制备液相色谱分离时采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为40％的甲醇或乙腈溶液，检测波长为300nm；所述流动相流速为60mL/min。

(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过¹H-NMR和¹³C-NMR进行结构鉴定为3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷；所述白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷为同分异构体，莲花掌苷和异莲花掌苷为同分异构体。

实施例5

大黄药材中二苯乙烯类和苯丁酮类化学对照品的制备新方法，包括以下步骤：

(1)提取：将大黄药材干燥根粉碎，以1g：5mL～30mL的比例用体积浓度为30～95％的乙醇在提取温度为60～90℃、提取次数1～4次、每次1～4h的条件下进行热回流提取，合并提取液；所述提取液经除杂处理后经减压浓缩到无醇味，得到提取物浓缩液；所述提取步骤中大黄药材干燥根是指蓼科植物掌叶大黄、或唐古特大黄、或药用大黄的干燥根；

(2)富集：将所述提取物浓缩液用石油醚萃取，得到石油醚部位和水部位；将所述水部位上大孔树脂，先用10％乙醇溶液洗脱至流出液无色，再用20％～60％乙醇溶液洗脱流出液无色，得到富含目标化合物的洗脱液；将所述洗脱液减压浓缩至恒重，得到富含目标化合物的提取物粉末；所述富集步骤中大孔树脂为D3520；

(3)分离纯化：将所述富含目标化合物的提取物粉末先用循环高速逆流色谱分离，未分离组分采用制备液相色谱分离，得到5种纯度高于98％的单体化合物，所述分离纯化步骤循环高速逆流色谱分离中循环洗脱次数为5次，采用的两相溶剂系统为正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(1～4:4～10:1～4:4～10,v/v)，主机转速为700rpm，分离温度为30℃，流动相流速为2.5mL/min，检测波长为300nm；所述流动相为两相溶剂系统的下相，所述分离纯化步骤中制备液相色谱分离时采用的色谱柱为C18色谱柱，流动相为40％的甲醇或乙腈溶液，检测波长为300nm；所述流动相流速为30mL/min。

(4)结构鉴定：将所述单体化合物通过¹H-NMR和¹³C-NMR进行结构鉴定为3,5-二羟基-4’-甲氧基芪-3-O-β-D-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷、莲花掌苷和异莲花掌苷；所述白藜芦醇-4'-O-β-D-(2”-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇-4'-O-β-D-(6”-O-没食子酰)-葡萄糖苷为同分异构体，莲花掌苷和异莲花掌苷为同分异构体。