能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料及制备和应用

摘要

本发明提供了一种能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料及制备和应用。所述的能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料，其特征在于，包括硅片以及形成于硅片表面的能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的硅纳米线阵列结构。本发明能够实现利用机械应力诱导细菌形貌伸长。

说明书

技术领域

本发明属于纳米材料科学领域，具体涉及一类特殊形貌的硅纳米线阵列结构。

背景技术

微生物的发酵以及生成生物质的分离是工业生物工程技术的重要组成部分。微生物的极小尺寸形貌(1-2μm)严重阻碍了微生物从发酵介质中的高效分离。传统的分离方法包括高耗能和低效率的未过滤和持续离心以及低效率的重力沉降。细菌形貌工程可以将短小的细胞转化为超长的丝状细菌，并且已成为简化下游分离的高效手段，且有利于体内物质的积累。

绝大多数的细胞具有细胞壁结构，用以维持细胞形状并保护细胞免于渗透压裂解和外界压力。肽聚糖是细胞壁中主要的压力承载成分，提供机械强度以对抗渗透压和机械力。在不同的压力下，细胞分裂受信号通路的调节，表现出球状，长条状等不同细胞形貌。在分裂过程中，有多个蛋白参与，包括PBP3，FtsZ，RodZ，MinCD等。通过转基因生物工程，例如抑制PBP3活性，RodZ蛋白的过度表达，以及通过SulA的过度表达和MinCD激活来下调FtsZde的表达，可有效调控细胞形貌。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的纳米材料及方法，以解决细菌伸长技术单一的缺点，从而促进细菌形貌工程技术发展，提高下游生物工程的高效性。

为了达到上述目的，本发明提供了一种能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料，其特征在于，包括硅片以及形成于硅片表面的能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的硅纳米线阵列结构。

优选地，所述的硅纳米线的长度为5-8μm、直径为80-110nm，其长度方向垂直于硅片表面，相邻纳米线顶端之间相互依偎，形成团簇，纳米线的团簇之间相隔500-2500nm。

本发明还提供了上述的能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料的制备方法，其特征在于，包括：清洗硅片、去除表面的氧化层、通过金属辅助化学刻蚀在硅片表面形成能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的硅纳米线阵列结构。

优选地，所述的清洗硅片的具体步骤包括：将硅片浸泡于95％-98％以上的H₂SO₄和30wt％-40wt％H₂O₂以4∶1-3∶1体积比混合的溶液中，10-15分钟后取出并用去离子水清洗3-5次，然后将硅片依次用丙酮、酒精和去离子水超声清洗10-15分钟。

更优选地，所述的硅片为提拉法制备的单晶晶圆片。

优选地，所述的去除表面的氧化层的具体步骤包括将清洗干净的硅片浸泡于5％-10％HF中3-5min。

优选地，所述的金属辅助化学刻蚀的具体步骤包括：将硅片用去离子水清洗后浸泡于镀银溶液55s-60s，取出后用去离子水冲洗，后放入含有4.8M-5M HF和0.3M-0.4M H₂O₂的溶液中18-20min，得到刻蚀后的硅片；将刻蚀后的硅片浸泡于浓硝酸中5-20min，以去除硅表面残留的Ag纳米颗粒，最后用去离子水清洗并用氮气吹干，在硅片表面形成能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的硅纳米线阵列结构，即得能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料。

更优选地，所述的镀银溶液含有4.8M-5M HF和0.01M-0.015M AgNO₃。

本发明还提供了能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料的应用方法，其特征在于，包括：将转移质粒的大肠杆菌细胞置于能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料的表面，在室温下培养18-24小时。

优选地，所述的转移质粒的大肠杆菌细胞为含pET-28a质粒的大肠杆菌或含pGEX-6p-1质粒的大肠杆菌。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明对制备的硅纳米线阵列材料进行表面形貌和致细菌伸长性能检测。SEM对其表面形貌表征，观测到无序的密集纳米线阵列，尺寸在7μm长，直径在80-110nm，相邻纳米线顶端之间相互依偎，形成团簇，纳米线的团簇之间相隔500-2500nm。表明这是一种新型的纳米线阵列结构。细菌培养完成之后，对纳米阵列表面的细菌形貌SEM表征显示，p-28a和6p-1大肠杆菌的形貌由常规的1-3μm转变成为50-200μm的超长丝状细胞，并且相互交织堆叠。细菌培养液的荧光染色分析观测到纳米结构表面的两种细菌表现超长的丝状细胞形貌，并且内部出现大量的隔膜，表明在外界的物理刺激作用下细胞的分裂受到抑制。

附图说明

图1蚀刻的硅晶片的表面的SEM图像：(a)蚀刻表面45°俯视图；(b)纳米线结构的45°角外侧面视图；

图2经纳米Si表面培养后的细菌SEM不同放大倍数显微图像。(a)p-28a型放大倍数×1700；(b)6p-1型放大倍数×1700；(c)p-28a型放大倍数×15500；(d)6p-1型放大倍数×7200；

图3在各种硅衬底上培养的细菌的Hoechst和FM4-64染色(a)在硅纳米线阵列上培养的p-28a；(b)在硅纳米线阵列上培养6p-1；

图4为细菌培养装置使用状态图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

本发明中所述的各浓度，如无特殊说明，均为重量浓度。

实施例1

一种能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料，包括硅片以及形成于硅片表面的能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的硅纳米线阵列结构。

所述的能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料的制备方法包括：

(1)清洗硅片：将40ml浓硫酸溶液(99％)和10ml30wt％过氧化氢溶液的混合溶液加入到250ml的玻璃器皿中，立即将4英寸提拉法制备的单晶Si晶圆片浸泡于混合溶液中，10min后取出，用大量去离子水清洗Si片表面3次去除残留混合液，将得到的硅片浸泡于50ml的丙酮中，并置于超声仪超声清洗10min，取出并用大量去离子水清洗后浸泡于50ml无水乙醇中，并超声清洗10min，最后置于50ml去离子水中超声清洗10min，后取出在高纯氮气下吹干。

(2)去除表面的氧化层：将100ml5％HF加入300ml聚四氟乙烯器皿中，将步骤(1)中的清洗干净的硅片浸泡于5％HF中3min以去除表面氧化物；

(3)金属辅助化学刻蚀：将硅片取出后用大量去离子水快速冲洗，并加入盛有含有5M HF和0.01M AgNO₃的混合溶液的聚四氟乙烯器皿中反应浸泡1min，取出后去离子水快速冲洗以除去表面残留AgNO₃溶液，并立即加入盛有含有4.8M>2O₂的混合溶液的聚四氟乙烯器皿中，浸泡20min后取出，得到刻蚀后的硅片，将刻蚀后的硅片浸泡于40ml(68％)浓HNO₃中10min以去除样品表面残留的Ag纳米颗粒，最后用大量去离子水清洗并用高纯氮气吹干，在硅片表面形成能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的硅纳米线阵列结构，即得能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料。其表面显微结构如附图1所示，可知该结构为无序的密集纳米线阵列，硅纳米线的尺寸在7μm长，直径在80-110nm，其长度方向垂直于硅片表面，相邻纳米线顶端之间相互依偎，形成团簇，纳米线的团簇之间相隔500-2500nm。表明这是一种新型的纳米线阵列结构。

上述能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料的应用方法，具体步骤为：

将100ml无水乙醇加入200ml玻璃器皿中，将能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料浸泡于无水乙醇中1小时，以去除Si表面可能存在的微生物细菌。将取出的Si片用大量去离子水清洗，高纯氮气下吹干，并置于紫外光下灭菌处理1小时。

含pET-28a质粒的大肠杆菌制备方法为：取50μL大肠杆菌感受态细胞(诺唯赞，C502-03)，加入2μL pet 28a质粒(柯雷生物，KL-ZL-0061)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；取5.0g酵母粉提取物(Oxoid，USA)，10.0g胰胨(Oxoid，USA)，10.0gNaCl与1000mL H₂O并调PH为7.2制备得到LB培养基，加400μL>

含pGEX-6p-1质粒的大肠杆菌制备方法为：取50μL大肠杆菌感受态细胞(诺唯赞，C502-03)，加入2μLpGEX-6p-1质粒(GE/Amersham/whatman，28954648)冰浴30min后，42℃热激90s，马上放回冰上，冰浴2min；取5.0g酵母粉提取物(Oxoid，USA)，10.0g胰胨(Oxoid，USA)，10.0g NaCl与1000mL H₂O并调PH为7.2制备得到LB培养基，加400μL>

从冻存管内取10μL冻存菌加入1mLLB液体培养基中重新复苏，于37℃，转速为200rpm培养8h细菌培养至对数期。将10μL处于指数生长期的细菌接种物，重新悬浮在新鲜的990μL液体培养基中进行培养至对数期。将新鲜的细菌利用LB液体培养基进行稀释至100colony forming units per mL。

如图4所示，所述的细菌培养装置，包括从下到上依次设置的不锈钢底板1、PDMS缓冲层2和不锈钢顶板3，细菌培养基片5设于不锈钢底板1和PDMS缓冲层2之间，当细菌培养基片5设于不锈钢底板1和PDMS缓冲层2之间时，不锈钢底板1和不锈钢顶板3之间通过螺栓固定连接并将细菌培养基片5与PDMS缓冲层2夹持固定，PDMS缓冲层2和不锈钢顶板3皆设有9个用于容纳含有细菌的培养液的半径相同的圆形的通孔4。PDMS缓冲层2和不锈钢顶板3上通孔4的位置相对应。所述的细菌培养基片5采用上述的能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料。

取1mL稀释后的细菌加入到通孔4中，使转移质粒的大肠杆菌细胞接触能够利用机械应力诱导细菌形貌伸长的材料的表面，放置于摇床上在室温(25℃)10,000rmp转速下培养20小时。

将培养完成的细菌用Phenom Pro扫描电镜和荧光染色法进行细菌形貌表征。细菌培养结果SEM表征如附图2，可知该纳米结构表面培养的细菌出现大量50-200μm超长丝状细胞。细菌培养上清液荧光染色结果附图3，可知纳米结构表面培养后的细菌培养液中同样出现大量超长丝状细菌，并且可观测到细胞体内大量隔膜，说明该种纳米结构对细菌的生长产生刺激，并抑制细胞的正常分裂。