一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用

摘要

本发明公开了一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用。上述分子标记与粳稻、籼稻检测相关的核苷酸序列分别如Seq No.1‑2所示。利用J34F/J34R对待测水稻样品的基因组DNA进行PCR扩增；PCR扩增产物电泳分析，粳稻样品及籼稻样品PCR扩增产物大小均为156bp DNA片段；对PCR产物进行KpnI酶切并进行电泳分析；如果PCR产物能被KpnI酶切，酶切产物为29bp和127bp两条DNA片段的，则为粳稻；如果不能够被KpnI酶切，酶切产物为156bp片段的，则为籼稻。本发明可以对栽培稻中籼稻和粳稻进行有效、快速、可靠的鉴定，为水稻种质资源鉴定提供了重要手段。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用，属于植物生物技术领域。

背景技术

栽培稻(Oryza sativa L.)在其漫长的驯化栽培过程中，为了适应不同的生态环境，在自然和人工选择作用下，产生了明显的籼稻—粳稻分化(Vaughan,Lu et al.2008)，出现了适合高纬度或高海拔地区种植的粳稻和适合低纬度或低海拔地区种植的籼稻。籼稻和粳稻在形态特征、农艺性状以及生理生化特性等方面都具有明显的差异。鉴定籼稻和粳稻的传统方法主要基于水稻形态的差异(如株高、株型、植株被毛、粒型等)，同时结合一些生理生化指标(如抗寒性、酚反应等)(王象坤等，1997)。目前“程氏指数法”是鉴定籼稻和粳稻最常用的方法，包括稃毛、穗节长、稻壳颜色、叶片表皮毛、谷粒长宽比和酚反应等6个性状(陈侃声等，1984)。由于受环境条件的影响，通过形态性状鉴定差异较大，导致不同环境中获得的结果存在一定差异。并且进行形态鉴定的样品需要从水稻播种到成熟整个生育期进行统计分析，耗时长，同时需要一定的样本量，因此形态性状结合生理生化指标鉴定效率低。

随着20世纪80年代分子生物学的迅速发展，一些科学家开发了RAPD、RFLP以及微卫星(SSR)标记来对籼稻和粳稻进行快速鉴定，但是这些分子标记不是针对籼粳稻差异基因进行设计，因此对籼稻和粳稻鉴定的准确性差。因此，设计一种快捷且准确鉴定籼稻和粳稻的分子标记尤为重要。

发明内容

本发明的首要目的在于提供了一种简单、有效、成本较低的鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及引物。本发明的另一目的在于提供上述分子标记的应用。本发明申请人一直从事水稻光敏色素基因研究，测序发现光敏色素B基因(PHYB)在籼粳稻中存在1个相关联的SNP，进而设计了鉴别水稻栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记引物，并采用上述的分子标记引物来鉴别籼稻和粳稻，因此对于水稻种质资源鉴定具有重要的意义。

本发明的技术方案是：一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记，其特征是，

与粳稻检测相关的核苷酸序列如下(PHYB基因部分序列，Seq No.1)：

CACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTTGCTGATGCAGGCTACCCTGGTGCTGCTGCACTAGGAGATGCAGTGAGTGGAATGGCGGTAGCATATATCACGCCAAGTGATTATTTGTTTTGGTTCCGGTCACACACAGCTAAGGAGATAAAGTGGGGTGGTGCAAAGCATCATCCAGAGGATAAGGATGATGGACAACGAATGCATCCACGATCATCGTTCAAGGCATTTCTTGAAGTTGTGAAGAGTAGGAGCTTACCAT；

与籼稻检测相关的核苷酸序列如下(PHYB基因部分序列，Seq No.2)：

CACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTTGCTGATGCAGGCTACTCTGGTGCTGCTGCACTAGGAGATGCAGTGAGTGGAATGGCGGTAGCATATATCACGCCAAGTGATTATTTGTTTTGGTTCCGGTCACACACAGCTAAGGAGATAAAGTGGGGTGGTGCAAAGCATCATCCAGAGGATAAGGATGATGGACAACGAATGCATCCACGATCATCGTTCAAGGCATTTCTTGAAGTTGTGAAGAGTAGGAGCTTACCAT。

本发明还公开了一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记引物，其特征是，

上游引物J34F：5'–AGCACAGATAGCCTTGCTGATGCAGGGTAC-3'(Seq No.3)；

下游引物J34R：5'–ATGCTTTGCACCACCCCACTTTATCTCCTT-3'(Seq No.4)。

所述的鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记引物及引物，在水稻种质资源鉴定中将有重要作用。

应用上述的引物鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的方法，其特征是，

(1)利用上游引物J34F和下游引物J34R对待测水稻样品的基因组DNA进行PCR扩增；

(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物，进行电泳分析；

粳稻样品及籼稻样品PCR扩增产物大小均为156bp DNA片段，继续进行下一步区分；

(3)对步骤(2)得到的PCR产物进行KpnI酶切并进行电泳分析；

如果PCR产物能被KpnI酶切，酶切产物为29bp和127bp两条DNA片段的，则为粳稻；

如果PCR产物不能够被KpnI酶切，酶切产物为156bp片段的，则为籼稻。

所述步骤(1)中的PCR扩增体系用PCR mix进行扩增，优选体系为20μL体系。本实验所用全式金公司的PCR mix为2×EasyTaq PCR SuperMix(+dye)，PCR反应体系包括如下组分：

步骤(1)所述的PCR扩增反应程序优选为：94℃预变性4min，94℃变性30s，63℃复性30s，72℃延伸30s，共38个循环，然后72℃后延伸15min。

本发明与传统的鉴定籼粳稻方法相比，具有如下的优点及效果：

(1)本发明的功能标记J34利用普通PCR技术，在PCR产物酶切所用的限制性内切酶KpnI为分子生物学常用工具酶，各公司都常规备货不会出现因为断货导致实验中断现象，大大降低时耗。

(2)本发明开发了一种用于区分籼稻和粳稻的分子标记引物J34，从而可以对栽培稻中籼稻和粳稻进行有效、快速、可靠的鉴定，为水稻种质资源鉴定提供了重要手段。

附图说明

图1为水稻光敏色素PHYB粳稻序列与籼稻序列差异位点比对结果图；

图2为利用本标记J34，利用2×GC buffer(TAKARA)、2×PCR Mix(TRANSGEN)和10×PCR buffer(TAKARA)进行PCR扩增的结果；其中M:500bp DNA ladder；1：日本晴；2：中花11；3：空育131；4：盐丰47；5：圣稻18；6：9311；7：浙辐802；8：黄华占；9：IR50；10：Kasalath；

图3为利用本标记J34用2×PCR Mix(TRANSGEN)进行PCR扩增，扩增产物用KpnI进行酶切的结果；M：500bp DNA ladder；1：日本晴；2：中花11；3：空育131；4：盐丰47；5：圣稻18；6：9311；7：浙辐802；8：黄华占；9：IR50；10：Kasalath。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种鉴别水稻栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记的建立

(1)引物设计

我们经测序发现PHYB基因在籼稻和粳稻内的序列存在1个SNP，其中在编码区1637处粳稻中的为C，籼稻中为T。我在此SNP处前后共选取404bp序列进行比对(图1)，根据序列差异，用在线设计软件dCAPS Finder 2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计引物，引物序列如下：

上游引物：5'–AGCACAGATAGCCTTGCTGATGCAGGGTAC-3'(Seq No.3)；

下游引物：5'–ATGCTTTGCACCACCCCACTTTATCTCCTT-3'(Seq No.4)。

(2)扩增片段理论分析

栽培稻品种基因组DNA均能扩增出一条156bp的片段；粳稻基因组DNA扩增片段能被KpnI酶切，产成29bp(Seq No.5)和127bp两条DNA片段(Seq No.6)，籼稻基因组扩增片段不能够被KpnI酶切，为156bp的片段(Seq No.7)。

Seq No.5：

AGCACAGATAGCCTTGCTGATGCAGGGTA；

Seq No.6：

CCCTGGTGCTGCTGCACTAGGAGATGCAGTGAGTGGAATGGCGGTAGCATATATCACGCCAAGTGATTATTTGTTTTGGTTCCGGTCACACACAGCTAAGGAGATAAAGTGGGGTGGTGCAAAGCAT；

Seq No.7：

AGCACAGATAGCCTTGCTGATGCAGGGTACTCTGGTGCTGCTGCACTAGGAGATGCAGTGAGTGGAATGGCGGTAGCATATATCACGCCAAGTGATTATTTGTTTTGGTTCCGGTCACACACAGCTAAGGAGATAAAGTGGGGTGGTGCAAAGCAT；

实施例2：利用水稻鉴定栽培稻品种的籼粳稻类型的分子标记，分析水稻栽培稻5个常规粳稻品种和5个常规籼稻品种的籼粳稻类型

(1)提取不同水稻品种的叶片中基因组DNA

试验材料包括日本晴(编号1)、中花11(编号2)、空育131(编号3)、盐丰47(编号4)、圣稻18(编号5)、9311(编号6)、浙辐802(编号7)、黄华占(编号8)、IR50(编号9)、Kasalath(编号10)。

选取不同水稻品种单株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取水稻的基因组DNA，具体步骤如下：

①取适量叶片置于2mL离心管中，加入DNA提取液500μL，加入钢珠一枚，用组织破碎研磨仪震荡60s左右；

②将离心管置于65℃水浴30min，期间上下颠倒混匀2-3次；

③静置至室温，加入等体积的氯仿，上下剧烈摇动，充分混匀；

④12000rpm离心10min，吸上清约200μL到新的灭菌的1.5mL离心管中；

⑤加入2倍体积的无水乙醇上下颠倒混匀，-20℃放置30min左右，使DNA充分沉淀；

⑥12000rpm离心10min，倒掉上清，加入500μL 75％乙醇漂洗一次；

⑦12000rpm瞬时离心，倒掉上清后将离心管倒置在纸巾上，静置2min；

⑧通风厨内干燥DNA后，用ddH₂O溶解DNA；

⑨置于-20℃保存，备用。

(2)利用鉴别水稻栽培稻籼粳稻类型的分子标记分析10个水稻材料属于籼稻还是粳稻。

利用鉴定引物J34进行PCR扩增，反应体系为20μL体系：DNA模板2μL，10μM引物(J34F和J34R)各0.5μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 10μL，用ddH₂O补足20μL；PCR反应程序为：94℃预变性4min，94℃变性30s，63℃复性30s，72℃延伸30s，共38个循环，然后72℃后延伸15min。

(3)对扩增产物的进行琼脂糖凝胶电泳检测、酶切和基因型判定

PCR扩增产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳(1×TAE,120V,时间20min)，利用君意凝胶成像系统观察，结果发现本引物能够在籼稻和粳稻中扩增出单一的，清晰的、非常明亮的条带，片段大小与预期一致(图2)。

PCR扩增产物用KpnI(TAKARA)进行酶切，酶切体系为：10×buffer 2μL，PCR产物取10μL，KpnI 1U，用ddH₂O补齐至20μL，30℃酶切1h。然后用3％的琼脂糖凝胶进行电泳检测(1×TAE,120V,时间25min)，利用君意凝胶成像系统观察，结果发现籼稻类型仍然为一条单一，清晰的条带，而粳稻品种的带型明显小于籼稻类型品种的，这是因为酶切掉29bp，但是由于29bp条带太小在凝胶上无法显示(图3)。

上述的基因型跑胶结果与对应的材料的籼粳稻类型一致，与传统方法鉴定的籼粳稻类型一致。证明开发的标记能够有效的水稻栽培稻的籼粳稻类型。

综上所述，新标记的开发不仅能够有效的区分栽培稻的籼粳稻类型，而且与传统鉴别籼粳稻类型的方法相比更加的节省时间和成本，是一个有效、快速、低廉的鉴定水稻栽培稻籼粳稻类型的分子标记。

上述实施例是本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、简化等均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省水稻研究所

<120> 一种鉴别栽培稻品种籼粳稻类型的分子标记及应用

<130> 0

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 404

<212> DNA

<213> 粳稻

<400> 1

cacacaaagc cccagcatca tggaccttgt gaagtgtgat ggtgctgctc tgtattacca 60

tgggaagtac taccctcttg gtgtcactcc cacagaagtt cagattaagg acatcatcga 120

gtggttgact atgtgccatg gagactccac agggctcagc acagatagcc ttgctgatgc 180

aggctaccct ggtgctgctg cactaggaga tgcagtgagt ggaatggcgg tagcatatat 240

cacgccaagt gattatttgt tttggttccg gtcacacaca gctaaggaga taaagtgggg 300

tggtgcaaag catcatccag aggataagga tgatggacaa cgaatgcatc cacgatcatc 360

gttcaaggca tttcttgaag ttgtgaagag taggagctta ccat 404

<210> 2

<211> 404

<212> DNA

<213> 籼稻

<400> 2

cacacaaagc cccagcatca tggaccttgt gaagtgtgat ggtgctgctc tgtattacca 60

tgggaagtac taccctcttg gtgtcactcc cacagaagtt cagattaagg acatcatcga 120

gtggttgact atgtgccatg gagactccac agggctcagc acagatagcc ttgctgatgc 180

aggctactct ggtgctgctg cactaggaga tgcagtgagt ggaatggcgg tagcatatat 240

cacgccaagt gattatttgt tttggttccg gtcacacaca gctaaggaga taaagtgggg 300

tggtgcaaag catcatccag aggataagga tgatggacaa cgaatgcatc cacgatcatc 360

gttcaaggca tttcttgaag ttgtgaagag taggagctta ccat 404

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcacagata gccttgctga tgcagggtac 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgctttgca ccaccccact ttatctcctt 30

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agcacagata gccttgctga tgcagggta 29

<210> 6

<211> 127

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccctggtgct gctgcactag gagatgcagt gagtggaatg gcggtagcat atatcacgcc 60

aagtgattat ttgttttggt tccggtcaca cacagctaag gagataaagt ggggtggtgc 120

aaagcat 127

<210> 7

<211> 156

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agcacagata gccttgctga tgcagggtac tctggtgctg ctgcactagg agatgcagtg 60

agtggaatgg cggtagcata tatcacgcca agtgattatt tgttttggtt ccggtcacac 120

acagctaagg agataaagtg gggtggtgca aagcat 156