光敏保护基保护的5‑醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体及其制备方法和寡聚核苷酸的合成和应用

摘要

本发明涉及寡聚核苷酸的化学合成领域，公开了光敏保护基保护的5‑醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体及其制备方法和寡聚核苷酸的合成和应用。该光敏保护基保护的5‑醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的化学结构如式(1)所示，其中，R为甲基或苯基。本发明所述的5‑醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体用于制备5‑醛基胞嘧啶定点修饰的核苷酸，在研究5‑醛基胞嘧啶的生化性质特别是5‑醛基胞嘧啶与蛋白质相互作用方面有着广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及寡聚核苷酸的化学合成领域，具体涉及光敏保护基保护的5- 醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体以及寡聚核苷酸的合成与应用，更具体地，涉及 1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体以及1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸的合成与应用。

背景技术

5-醛基胞嘧啶是最近在真核细胞中发现的一种新的碱基存在形式[Science2011,333,1300‐1303]。5-醛基胞嘧啶一般被认为是5-甲基胞嘧啶在脱甲基过程中的中间体[Chem.Rev.2015,115,2225‐2239]，但是也有证据表明5-醛基胞嘧啶能够在活体内长期稳定存在，并对基因组DNA的结构和功能产生一定的影响[Nat.Struct.Mol.Biol.2015,22,44‐49；Nat.Struct.Mol. Biol.2012,19,831‐833；Genome Biol.2013,14,R119.]。

为了研究5-醛基胞嘧啶在DNA中的生化性质，需要制备5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸。常规的手段是先合成5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体，然后通过DNA固相合成的策略将5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体定点引入寡聚核苷酸，然后氨水脱保护并纯化得到纯的寡聚核苷酸用于后续的生化研究。 5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的醛基一般认为比较稳定，在常规的DNA固相合成及脱保护步骤中都保持不变，因此可以不用保护，直接用于DNA固相合成。最近也有报道称如果不保护5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的醛基，DNA 合成和脱保护过程有一些副反应发生，因此发展了1,3-丙二醇保护5醛基，氨水脱保护后通过酸处理恢复5-醛基[Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2014,53, 315‐318.]。

在某些情况下，比如研究5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体与蛋白质相互作用时，需要一个在DNA合成和纯化过程中稳定，但可以在较为温和的条件下高效定量脱除的5-醛基的保护基。

因此，发展新型可以和常规的DNA合成及脱保护程序相容、在温和的条件下高效定量脱除的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的5位醛基保护基很有必要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的缺陷，提供一种涉及光敏保护基保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体及其制备方法以及寡聚核苷酸的合成和应用，具体涉及一种1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体及其制备方法以及1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸的合成和应用。

为了实现上述目的，本发明第一方面提供了一种光敏保护基保护的5- 醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体，其中，该5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体化学结构式为：

其中，R为甲基或苯基。

本发明第二方面提供了一种光敏保护基保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：

(1)将3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶、1-(2-硝基苯基) 丙烷-1,3-二醇、原甲酸三乙酯和二氯甲烷进行第一混合后冷却，形成第一混合溶液；再将所述第一混合溶液与四氯化钛进行反应；然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到反应产物；

(2)将所述反应产物与所述四丁基氟化铵和所述四氢呋喃进行第二混合，形成第二混合溶液，然后将所述第二混合溶液旋蒸除去溶剂，柱层析得到5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶；

(3)将所述5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与三甲基氯硅烷、吡啶进行第三混合，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与乙酸酐进行反应；然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶；

(4)将所述4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯、吡啶进行反应，然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基-5-[4-(2- 硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶；

(5)将所述5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦、1H-四唑和二氯甲烷进行反应，将反应后得到的溶液旋蒸除去溶剂，然后进行柱层析。

优选地，在步骤(1)中，所述1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇、所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶、所述原甲酸三乙酯、所述二氯甲烷和所述四氯化钛的用量的摩尔比为1mmol:(3-5)mmol:(1.2-1.5)mmol: (5-7)mL：(0.4-0.5)mmol；

所述第一混合的条件包括：温度为18-25℃，时间为0.5-1小时，搅拌速度为250-500转/分钟；

所述冷却的条件包括：温度为0-4℃，时间为0.1-0.5小时，搅拌速度为 250-500转/分钟；以及

所述四氯化钛以滴加的方式加入所述第一混合溶液中，且步骤(1)所述的反应过程包括两个阶段，第一阶段的反应条件包括：温度为18-25℃，时间为5-7小时，搅拌速度为250-500转/分钟，所述四氯化钛的滴加速率为 10-15滴/分钟；以及第二阶段的反应条件包括：温度为18-25℃，时间为5-7 小时，搅拌速度为250-500转/分钟，所述四氯化钛的滴加速率为10-15滴/ 分钟。

优选地，在步骤(2)中，所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶、所述四丁基氟化铵和所述四氢呋喃的用量的比为1mmol:(3-4)mmol: (5-7)mL；以及

所述第二混合的条件包括：温度为18-25℃，时间为9-11小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(3)中，所述5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′- 脱氧胞嘧啶与所述三甲基氯硅烷、所述吡啶和所述乙酸酐的用量的比为 1mmol:(5-7)mmol:(9-11)mL：(1.1-1.3)mmol；以及

所述第三混合的条件包括：温度为18-25℃，时间为1-2小时，搅拌速度为250-500转/分钟；以及所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为 3-5小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(4)中，所述4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯、吡啶的用量的比为 1mmol:(1.5-2)mmol:(9-11)mL；以及

所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为12-18小时，搅拌速度为250-500转/分钟。

优选地，在步骤(5)中，所述5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基-5-[4-(2- 硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦、1H-四唑和二氯甲烷的用量的比为1mmol:(1.3-1.6)mmol:(1.3 -1.6)mmol:(10-30)mL；以及

所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为2-4小时，搅拌速度为 250-500转/分钟。

本发明第三方面提供了一种1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸的制备方法，其中，该制备方法中的合成试剂包括上述所述的制备方法制备得到的光敏保护基保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体。

优选地，该制备方法在ABI 394DNA/RNA合成仪上进行，其中：

优选地，所述合成试剂还包括Ac-dC、Bz-dA、dmf-dG和dT；

优选地，三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；

优选地，Cap A试剂为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：(5-15体积％)：(75-85 体积％)；

优选地，Cap B试剂为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物，且所述N-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：(85-95体积％)；

优选地，活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物；

优选地，氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为0.02M：(1-2体积％)：(10-30体积％)：(75-85体积％)；以及所述

优选地，所述光敏保护基保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的偶合时间为4-6分钟；

优选地，将上述固相合成得到的寡聚核苷酸用1毫升AMA在60-70℃下处理1-2h，然后，取出上清液离心浓缩后，采用20重量％的变性聚丙烯凝胶电泳纯化；以及

优选地，所述AMA为40％甲胺水溶液和28％氨水的混合溶液，且所述甲胺水溶液和所述氨水的体积的比为1:(0.5-1.5)。

本发明第四方面提供了由上述所述的制备方法制备得到的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸在用于DNA操作上的应用，其中，该DNA操作上的应用包括用PNK酶进行5′磷酸化，连接酶进行连接，以及与蛋白进行DNA-蛋白复合体的组装。

本方面第五方面提供了一种含有5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸的制备方法，其中，该方法包括将上述所述的制备方法制备得到的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸在 340-360nm的光照下光照4-6分钟原位生成得到的。

本发明的优点是：(1)1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体合成方法简单；(2)5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护基在在寡聚核苷酸合成和纯化过程中都稳定；(3)得到纯的寡聚核苷酸后，1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护基可以通过光照实验将保护基定量脱除。该脱除条件温和，和几乎所有的生物体系相容。本发明所述的5-醛基胞嘧啶定点修饰的核苷酸的合成方法，在研究5-醛基胞嘧啶的生化性质特别是5-醛基胞嘧啶与蛋白质相互作用方面有着广泛的应用前景。

附图说明

图1为含有1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶修饰的寡聚核苷酸的5′磷酸化和DNA连接酶连接策略。

图2为寡聚核苷酸12和13的超高效液相分析图。

图3为寡聚核苷酸12和13的质谱图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明第一方面提供了一种5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体，其中，其化学结构式为：

其中，R为甲基或苯基。

式(1)所示的化合物可以称为3′-O-(N,N-二异丙基胺基-O-beta-氰乙氧基-膦基)-5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环 -2-基]-2′-脱氧胞嘧啶。

其中，在式(1)中，“DMTrO-”为二甲氧基三苯甲基，“N(ⁱPr)₂-”为>

本发明第二方面提供了上述所述的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：

(1)将3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶、1-(2-硝基苯基) 丙烷-1,3-二醇、原甲酸三乙酯和二氯甲烷进行第一混合后冷却，形成第一混合溶液；再将所述第一混合溶液与四氯化钛进行反应；然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到反应产物；

其中，可以依次选用饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠溶液洗涤将经第一反应后的有机相，再选用无水硫酸镁干燥，然后将经过洗涤干燥后的所述第一混合溶液过滤后旋干滤液，柱层析得到淡黄色固体的反应产物。

(2)将所述反应产物与所述四丁基氟化铵和所述四氢呋喃进行第二混合，形成第二混合溶液，然后将所述第二混合溶液旋蒸除去溶剂，柱层析得到5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶；

其中，所述四氢呋喃为干燥的四氢呋喃，柱层析得到5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶为淡黄色固体。

(3)将所述5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与三甲基氯硅烷、吡啶进行第三混合，形成第三混合溶液；再将所述第三混合溶液与乙酸酐(苯甲酰氯)进行反应；然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶；

其中，所述吡啶为干燥的吡啶，可以依次选用二氯甲烷萃取、饱和碳酸氢钠水溶液洗涤经第三反应后的有机相，再选用无水硫酸镁干燥，然后过滤后旋干滤液，柱层析得到淡黄色固体的反应产物。

(4)将所述4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯、吡啶进行反应，然后将反应后得到的有机相洗涤、干燥、过滤、柱层析得到5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-乙酰基-5-[4-(2- 硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶；

其中，所述吡啶为干燥的吡啶，可以依次选用二氯甲烷萃取、饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化钠水溶液洗涤经第四反应后的有机相，再选用无水硫酸镁干燥，然后过滤后旋干滤液，柱层析得到淡黄色固体的反应产物。

(5)将所述5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦、1H-四唑和二氯甲烷进行反应，将反应后得到的溶液旋蒸除去溶剂，然后进行柱层析。

在本发明中，经上述的制备方法可以得到3′-O-(N,N-二异丙基胺基 -O-beta-氰乙氧基-膦基)-5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶；

其中，所述二氯甲烷为干燥的二氯甲烷。

根据本发明，其中，在步骤(1)中，所述所述1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3- 二醇、3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶、所述原甲酸三乙酯、所述二氯甲烷和所述四氯化钛的用量的摩尔比可以为1mmol:(3-5)mmol: (1.2-1.5)mmol:(5-7)mL：(0.4-0.5)mmol；也就是说，相当于1mmol 的所述1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇，所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基 -2′-脱氧胞嘧啶的用量为3-5mmol，所述原甲酸三乙酯的用量为1.2-1.5mmol，所述二氯甲烷的用量为5-7mL，所述四氯化钛的用量为0.4-0.5mmol；尽管所述1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇、所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′- 脱氧胞嘧啶、所述原甲酸三乙酯、所述二氯甲烷和所述四氯化钛的用量的摩尔比满足上述范围即可完成本发明，但是，优选地，所述1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇、所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶、所述原甲酸三乙酯、所述二氯甲烷和所述四氯化钛的用量的摩尔比为1mmol:4 mmol:1.2mmol:6mL：0.4mmol时；效果更好；

所述第一混合的条件可以包括：温度为18-25℃，时间为0.5-1小时，搅拌速度为250-500转/分钟；优选地，温度为20℃，时间为0.5小时，搅拌速度为400转/分钟；

所述冷却的条件可以包括：温度为0-4℃，时间为0.1-0.5小时，搅拌速度为250-500转/分钟；优选地，温度为0℃，时间为0.5小时，搅拌速度为 400转/分钟；以及

所述四氯化钛以滴加的方式加入所述第一混合溶液中，且步骤(1)所述的反应过程包括两个阶段，第一阶段的反应条件包括：温度为18-25℃，优选为20℃，时间为5-7小时，优选为6小时，搅拌速度为250-500转/分钟，优选为400转/分钟，所述四氯化钛的滴加速率为10-15滴/分钟，优选为10 滴/分钟；在优选条件下进行效果更好；以及

所述第二阶段的条件可以包括：温度为18-25℃，优选为20℃，时间为 5-7小时，优选为6小时，搅拌速度为250-500转/分钟，优选为400转/分钟，所述四氯化钛的滴加速率为10-15滴/分钟，优选为15滴/分钟，在优选的条件下进行效果更好。

根据本发明，在步骤(2)中，所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′- 脱氧胞嘧啶、所述四丁基氟化铵和所述四氢呋喃的用量的比可以为1mmol: (3-4)mmol:(5-7)mL；也就是说，相当于1mmol的所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶，所述四丁基氟化铵的用量为3-4mmol，所述四氢呋喃的用量为5-7mL；尽管各个用量满足上述范围即可完成本发明，但是，优选地，所述3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶、所述四丁基氟化铵和所述四氢呋喃的用量的比为1mmol:4mmol:6mL时，效果更好；以及

所述第二混合的条件可以包括：温度为18-25℃，时间为9-11小时，搅拌速度为250-500转/分钟；优选地，温度为20℃，时间为10小时，搅拌速度为400转/分钟。

根据本发明，在步骤(3)中，所述5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2- 基]-2′-脱氧胞嘧啶与所述三甲基氯硅烷、所述吡啶和所述乙酸酐(苯甲酰氯) 的用量的比为1mmol:(5-7)mmol:(9-11)mL：(1.1-1.3)mmol；也就是说，相当于1mmol的所述5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与所述三甲基氯硅烷，所述三甲基氯硅烷的用量为5-7mmol，所述吡啶的用量为9-11mL，所述乙酸酐(苯甲酰氯)的用量为1.1-1.3mmol；尽管各个用量满足上述范围即可完成本发明，但是，优选地，所述5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与所述三甲基氯硅烷、所述吡啶和所述乙酸酐 (苯甲酰氯)的用量的比为1mmol:6mmol:10mL：1.2mmol时，效果更好；以及

所述第三混合的条件可以包括：温度为18-25℃，时间为1-2小时，搅拌速度为250-500转/分钟；以及所述反应的条件包括：温度为18-25℃，时间为3-5小时，搅拌速度为250-500转/分钟；

优选地，所述第三混合的条件包括：温度为20℃，时间为1.5小时，搅拌速度为400转/分钟；以及所述反应的条件包括：温度为19-21℃，时间为 3.5-4.5小时，搅拌速度为350-450转/分钟。

根据本发明，在步骤(4)中，所述4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯、吡啶的用量的比可以为1mmol:(1.5-2)mmol:(9-11)mL；也就是说，相当于1mmol的所述4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶，所述4,4'- 二甲氧基三苯基甲基氯的用量为1.5-2mmol，所述吡啶的用量为9-11mL；尽管各个用量满足上述范围即可完成本发明，但是，优选地，所述4-N-酰基 -5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯、吡啶的用量的比可以为1mmol:2mmol:10mL时，效果更好；以及

所述反应的条件可以包括：温度为18-25℃，时间为12-18小时，搅拌速度为250-500转/分钟；

优选地，所述反应的条件包括：温度为20℃，时间为16小时，搅拌速度为400转/分钟。

根据本发明，在步骤(5)中，所述5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基 -5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与双(二异丙基氨基)(2- 氰基乙氧基)膦、1H-四唑和二氯甲烷的用量的比为1mmol:(1.3-1.6)mmol: (1.3-1.6)mmol:(10-30)mL；也就是说，相当于1mmol的所述5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶，所述双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦的用量为1.3-1.6mmol，所述1H- 四唑的用量为1.3-1.6mmol，所述二氯甲烷的用量为10-30mL；尽管各个用量满足上述范围即可完成本发明，但是，优选地，所述5′-(二甲氧基三苯甲基)-4-N-酰基-5-[4-(2-硝基苯基)-1,3-二氧六环-2-基]-2′-脱氧胞嘧啶与双(二异丙基氨基)(2-氰基乙氧基)膦、1H-四唑和二氯甲烷的用量的比为1mmol:1.5 mmol:1.5mmol:10mL时，效果更好；以及

所述反应的条件可以包括：温度为18-25℃，时间为2-4小时，搅拌速度为250-500转/分钟；

优选地，所述反应的条件包括：温度为20℃，时间为3小时，搅拌速度为400转/分钟。

本发明第三方面提供了一种1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸的制备方法，其中，该制备方法中的合成试剂包括上述所述的制备方法制备得到的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5- 醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体。

根据本发明，该制备方法可以在ABI 394DNA/RNA合成仪上通过常规程序和试剂进行寡聚核苷酸合成进行，其中：

优选地，所述合成试剂还可以包括Ac-dC、Bz-dA、dmf-dG和dT；

优选地，可以选用三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；

优选地，Cap A试剂可以为乙酸酐、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比可以为10体积％：(5-15体积％)：(75-85体积％)；也就是说，该组合物含有10体积％的乙酸酐，5-15体积％的吡啶，75-85体积％的四氢呋喃；优选地，所述乙酸酐、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：(8-12体积％)：(78-82体积％)；

优选地，Cap B试剂可以为N-甲基咪唑和四氢呋喃的组合物，且所述 N-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比可以为10体积％：(85-95体积％)；也就是说，该组合物含有10体积％的所述N-甲基咪唑，85-95体积％的四氢呋喃；优选地，所述N-甲基咪唑和所述四氢呋喃的体积比为10体积％：(88-92 体积％)；

优选地，活化剂为乙硫基四唑和乙腈的组合物，所述活化剂可以通过商购得到或者采用现有技术的方法合成得到，在本发明中，所述活化剂来自商购，且所述活化剂的浓度为0.25M，即，所述活化剂中乙硫基四唑的当量浓度为0.25M。

优选地，氧化剂为碘、水、吡啶和四氢呋喃的组合物，且所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比可以为0.02M：(1-2体积％)：(10-30 体积％)：(75-85体积％)；也就是说，该组合物含有0.02M的碘，水为1-2 体积％，吡啶为10-30体积％，四氢呋喃为75-85体积％；优选地，所述碘、所述水、所述吡啶和所述四氢呋喃的体积比为0.02M：(1.5-2体积％)：(15-25 体积％)：(76-80体积％)；以及

优选地，所述5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的偶合时间可以为4-6分钟，优选为4.5-5.5分钟；

优选地，将上述固相合成得到的寡聚核苷酸可以用1毫升AMA在 60-70℃下处理1-2h，然后，取出上清液离心浓缩后，采用20重量％的变性聚丙烯凝胶电泳纯化；以及

优选地，所述AMA为40％甲胺水溶液和28％氨水的混合溶液，且所述甲胺水溶液和所述氨水的体积的比为1：(0.5-1.5)，优选为1：(0.8-1.2)，更优选为1：1。

本发明第四方面提供了一种由上述所述的制备方法制备得到的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸在用于DNA操作上的应用，其中，该DNA操作上的应用包括用PNK酶进行5′磷酸化，连接酶进行连接，以及与蛋白进行DNA-蛋白复合体的组装。

本发明第五方面提供了一种5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸的制备方法，其中，该方法包括将上述所述的制备方法制备得到的1-(2-硝基苯基) 丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸在340-360nm的光照下光照4-6分钟原位生成得到的。优选地，在本发明中，在任何需要的时候通过在340-360nm的光照下光照4-6分钟，优选地，通过在345-355nm的光照下光照4.5-5.5分钟，即可定量脱除1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护基，恢复5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的完整形态，发挥5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的全部生化功能。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

3′,5′-(特丁基二甲基硅基)-5-醛基-2′-脱氧胞嘧啶(自制)、1-(2-硝基苯基) 丙烷-1,3-二醇(自制)、原甲酸三乙酯(天津市化学试剂供销公司，货号 HWMT818864)和二氯甲烷(天津市化学试剂供销公司，货号3975)、碳酸氢钠(天津市化学试剂供销公司，货号166)、氯化钠(天津市化学试剂供销公司，货号017)、四丁基氟化铵(TCI，货号T1338))、四氢呋喃(天津市化学试剂供销公司，货号2287)、三甲基氯硅烷(天津市化学试剂供销公司，货号110121000)、吡啶(阿拉丁，货号P111511)、乙酸酐(天津市化学试剂供销公司，货号282)、4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯(Adamas,货号24127C)、 1H-四唑(TCI，货号S014625)等原料为市售品。

实施例1

本实施例在于说明本发明的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的合成。

其合成步骤如下：

化合物(4)的制备：称取1.31g(2.71mmol，1.0eq(当量))式(2) 所示的单体(其中，在式(2)中，“TBS-”为特丁基二甲基硅基)，在氩气保护下用20mL干燥二氯甲烷溶解；然后向反应体系中加入2.14g(10.84 mmol，4eq)1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇和537uL(3.25mmol，1.2eq)原甲酸三乙酯，并在冰浴条件(温度为0℃)下逐滴加入1.08mL(1.08mmol， 0.4eq，1M的二氯甲烷溶液(即，二氯甲烷中含有1M的四氯化钛))四氯化钛溶液，升至室温(20℃)。搅拌6h后，滴加542μL(0.54mmol，0.2eq， 1M的二氯甲烷溶液)四氯化钛溶液继续反应6h。选用饱和碳酸氢钠水溶液淬灭反应，用二氯甲烷(80mL)萃取，分出的有机相用饱和NaCl溶液(20 mL)水洗。无水硫酸镁干燥，旋蒸除去溶剂得到粗产物式(3)所示的单体。将获得的产物在氩气保护下溶于20mL干燥的四氢呋喃，加入4.34mL(4.34 mmol，1M的四氢呋喃溶液)四丁基氟化铵，室温下搅拌10h。旋蒸除去溶剂，用甲醇/二氯甲烷(梯度洗脱，v/v,3％～6％～10％)柱层析，得590mg 淡黄色固体(4)(1.36mmol,产率50重量％)。产物为一对非对映异构体(1： 1)。

¹H>4-CD₃OD):δ(ppm)8.22(s,1H),8.18(s,1H),7.95(d,J>13C>4-CD₃OD):δ(ppm)164.9,157.6,148.9,142.2,142.2,137.4,134.9,129.9,>19H₂₂N₄O₈,[M+H]⁺cal.>

化合物(5)的制备：称取594mg(1.37mmol，1.0eq)式(4)所示的单体,用干燥的吡啶共旋2次后，氩气保护下用15mL吡啶溶解。向反应体系加入1.27mL(3.5mmol，6eq)三甲基氯硅烷并在常温条件下搅拌1.5h 后加入150μL(1.51mmol，1.1eq)乙酸酐，常温(25℃)下继续反应4h 后，用5mL蒸馏水淬灭，旋蒸除去溶剂。加入适量饱和碳酸氢钠溶液并用二氯甲烷(60mL)萃取，合并有机相，无水硫酸镁干燥。旋蒸除去溶剂，用甲醇/二氯甲烷(v/v,3％～4％～6％)进行柱层析，得350mg淡黄色固体如式(5)所示的单体(0.73mmol，54％)。产物为一对非对映异构体(1：1)。

¹H>3):δ(ppm)9.03(br,1H),8.43-8.42(m,1H),>13C>6-DMSO):δ(ppm)170.7,158.8,153.3,147.3,142.3,143.6,135.3,135.2,>21H₂₄N₄O₉,[M+H]⁺cal.477.1622,found>

化合物(6)的制备：称取0.33g(0.95mmol，1eq)式(5)所示的单体(在式(5)中，“DMTr-”是二甲氧基三苯甲基),氩气保护下用10mL 干燥的吡啶溶解。然后缓慢加入470mg(1.38mmol，2eq)4,4'-二甲氧基三苯基甲基氯，室温搅拌16h。TLC监测反应完全后，加入10mL饱和碳酸氢钠淬灭反应，并用二氯甲烷萃取，合并有机相后用饱和的NaCl溶液洗涤一次，无水硫酸镁干燥。旋蒸除去溶剂，用甲醇/二氯甲烷(梯度洗脱，v/v，1％～2％～3％，+0.5％,v/v三乙胺)进行柱层析，得淡黄色固体(6)350mg(0.45 mmol,65％)。产物为一对非对映异构体(1：1)。

¹H>3):δ(ppm)9.12-9.11(m,2H),8.53(s,1H),8.46(s,>13C>3):δ(ppm)172.71,159.24,159.20,158.73,154.35,146.82,146.53,144.57,144.10,143.72,143.47,136.44,136.26,135.57,135.36,135.34,135.29,134.36,134.32,130.10,130.04,130.01,128.62,128.54,128.27,128.18,128.14,128.04,128.00,127.26,127.18,124.55,113.39,105.42,105.21,99.83,87.26,87.01,86.92,86.90,86.85,86.39,77.24,75.49,>42H₄₂N₄O₁₁,[MH]⁺cal.779.2928；found>

化合物(7)的制备：称取100mg(0.13mmol，1eq)式(6)所示的单体(在式(6)中，N(ⁱPr)₂-”为N,N-二异丙基氨基)，13.5mg(0.19mmol,>

³¹P>3)δ(ppm)149.4(s,3P),149.0(s,3P)148.7(s,1P),>51H₅₉N₆O₁₂P,[MH]⁺cal.979.4007；found>

实施例2

本实施例在于说明由实施1制备的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的 5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体(7)进行DNA固相合成DNA序列8： CGTTT7AGCGGTGCTAG(如图1所示)。

在ABI 394 DNA/RNA合成仪上通过常规程序和试剂进行1mol寡聚核苷酸合成。合成试剂包括Ac-dC,Bz-dA,dmf-dG,dT和实施1制备的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体；3重量％三氯乙酸/二氯甲烷用于脱保护；Cap A试剂： 10体积％乙酸酐/10体积％吡啶/80体积％四氢呋喃(v/v/v)，Cap B试剂： 10体积％N-甲基咪唑/90体积％四氢呋喃(v/v)；活化剂：0.25M乙硫基四唑/乙腈；氧化剂：0.02M碘/2体积％水/20体积％吡啶/78体积％四氢呋喃(v/v/v)。5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体的偶合时间是5分钟。

上述固相合成得到的载体用1毫升AMA(40重量％甲胺水溶液：28重量％氨水(体积比1:1))在65℃下处理1h.取出上清离心浓缩后，20重量％变性聚丙烯凝胶电泳纯化得到含有1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶修饰的寡聚核苷酸8，如图1所示。

可见，实施1制备的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体(7)可以用于常规的DNA固相合成与纯化。

实施例3

本实施例在于说明由实施2制备的1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的 5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸的5′磷酸化和DNA连接酶连接(如图1 所示)。

将200μL包含3nmol寡聚核苷酸9(如图1所示),1×CutSmart buffer(20 mM Tris-Ac pH 7.9，5mM DTT，1mM ATP)和40U of T4 PNK的反应体系在37℃下孵育4h后，95℃条件下加热20min淬灭反应。然后向反应体系分别加入3.5nmol寡聚核苷酸10(如图1所示)和3.5nmol寡聚核苷酸11 (如图1所示),95℃条件下加热2min后自然冷却至室温。后加入1.5μL 100 mM ATP和T4 DNA ligase(1600U)，在16℃下孵育12h。最后用乙醇沉淀法分离出DNA，并用HPLC纯化(如图2所示)。

可见，上述得到的含有1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸可以用于常规的DNA操作，包括PNK酶进行5′磷酸化和DNA连接酶连接。

实施例4

光照脱掉寡聚核苷酸的5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体上的1-(2-硝基苯基) 丙烷-1,3-二醇保护基。

将寡聚核苷酸11的水溶液(100μM)置于配有16根发射峰值为350nm 灯管的Rayonet光反应器(RPR-100)中，光照5min，得到脱除了1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护基的5-醛基胞嘧啶亚定点修饰的寡聚核苷酸12和 13。将5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸12和13进行超高效液相和质谱分析，如图2和图3所示，显示的是经过5分钟光照后，定量脱掉了1-(2- 硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护基的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸12和 13，由此可见，通过350nm的光照5分钟，即可定量脱除1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护基，能够恢复5-醛基胞嘧啶的完整形态，能够发挥5-醛基胞嘧啶的全部生化功能。

由上述实施例可知，本发明基于1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护5-醛基胞嘧啶的醛基，通过DNA固相合成制备1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护的5-醛基胞嘧啶定点修饰的寡聚核苷酸。1-(2-硝基苯基)丙烷-1,3-二醇保护基在合成和纯化过程中都稳定，得到纯的寡聚核苷酸后，该1-(2-硝基苯基) 丙烷-1,3-二醇保护基可以通过350nm的光照5分钟定量脱除，得到5-醛基胞嘧啶亚磷酰胺单体定点修饰的寡聚核苷酸链，可以用于生化研究。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。