黑虎掌菌提取物在制备抗前列腺癌药物、保健品或食品中的应用

摘要

本发明公开了黑虎掌菌提取物在制备抗前列腺癌药物、保健品或食品中的应用。本发明经体外前列腺癌细胞实验研究发现，黑虎掌菌提取物能显著抑制前列腺癌细胞LNCaP，22Rv1，PC‑3和DU‑145等的生长。同时体内动物实验研究发现，黑虎掌菌提取物能显著抑制前列腺癌细胞LNCaP裸鼠移植瘤的生长；经细胞急性毒性实验证实，其安全剂量范围较大，可用于抗前列腺癌药物、保健品或食品等领域。

说明书

技术领域

本发明涉及黑虎掌菌提取物的新用途，具体涉及黑虎掌菌提取物在制备抗前列腺癌药物、保健品或食品中的应用。

背景技术

根据国家癌症中心的最新数据，前列腺癌自2008年起成为泌尿系统中发病率最高的肿瘤，2009年的发病率达到9.92/10万，在男性恶性肿瘤发病率排名中排第6位；死亡率达到4.19/10万，在所有男性恶性肿瘤中排第9位。因此，前列腺癌的防治在我国已经成为肿瘤领域的一项重大挑战。

前列腺癌的治疗方法很多，包括随访观察、经尿道前列腺切除（TransurethralResection of Prostate，TURP）、根治性前列腺切除、放射治疗、冷冻治疗、内分泌治疗、综合治疗等。激素撤除疗法(即通过睾丸切除术或者使用抗雄激素等降低体内激素水平)仍然是目前治疗前列腺癌的首选方法。目前临床常用的化疗药有:多西紫杉醇(DocetaxeD、米非司酮(Mifepristone)、苏拉明(Suramin)、酮康挫(Ketoconazole)、米托葱醌(Mitoxantrone)等。以多西紫杉醇为基础的全身化疗是唯一被证实可适当延长HRPC患者生存期的药物。但大约有50%的晚期前列腺癌患者对多西紫杉醇治疗不敏感,甚至产生明显的毒性反应。抗肿瘤药物开发重点已转向天然植物药及其主要单体成分，中医植物药物抗肿瘤作用一直以来被临床使用而验证有效。

黑虎掌菌性平味甘，有追风散寒、舒筋活血、清热、消炎、除菌之功效，能降低胆固醇、促进新陈代谢、提高人体免疫力，是身体虚弱者的高级滋补品，对胃溃疡、慢性胃炎胃痛、食道癌有一定疗效，其干品含17种氨基酸，其中有占总量41.46%的7种人体必需氨基酸，以及11种矿物质和微量元素，营养丰富。目前国内外对黑虎掌菌的研究主要集中增强免疫力、抗菌等方面，但对黑虎掌菌提取物在抗前列腺癌的应用的研究未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供黑虎掌菌提取物在制备抗前列腺癌药物、保健品或食品中的应用。

优选的，所述黑虎掌菌提取物的安全剂量范围为10-500 mg/kg。

优选的，所述黑虎掌菌提取物为黑虎掌菌的氯仿提取物。

优选的，所述黑虎掌菌的氯仿提取物的制备方法包括以下步骤：

（1）将黑虎掌菌，粉碎成粗粉；

（2）将黑虎掌菌粗粉装入渗漏装置，加入8~12倍量石油醚，浸泡1-2 h；

（3）取滤渣再加入8~12倍量氯仿，浸泡1-2 h，收集渗漏液，减压回收氯仿，得到黑虎掌菌的氯仿提取物。

本发明还提供了一种抗前列腺癌药物，包含黑虎掌菌提取物和药学上可接受的载体。

本发明所述药物的剂型可以为片剂、颗粒剂、粉剂、胶囊剂或口服液等，其制备方法采用常规的方法制备即可。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明经体外前列腺癌细胞实验研究发现，黑虎掌菌提取物能显著抑制前列腺癌细胞LNCaP，22Rv1， PC-3和DU-145等的生长；同时体内动物实验研究发现，黑虎掌菌提取物能显著抑制前列腺癌细胞LNCaP裸鼠移植瘤的生长；经细胞急性毒性实验证实，其安全剂量范围较大，可用于抗前列腺癌药物、保健品或食品等领域。

附图说明

图1为不同浓度黑虎掌菌提取物对前列腺癌LNCaP细胞形态影响的光学显微镜图(100倍)。

图2为黑虎掌菌提取物对LNCaP裸鼠移植瘤重量的影响的柱形图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

本发明所述的黑虎掌菌购买于云南昆明，学名枣翘鳞肉齿菌，菌帽肉质肥厚、香气浓郁，新鲜时为灰白色或灰褐色，干后变成暗灰白或灰褐色，形如虎爪，下表面长满一层纤细的灰白色刺状茸毛，菌柄粗壮多中空，长的有点偏。

实施例1：黑虎掌菌提取物的制备

具体包括以下步骤：

（1）将黑虎掌菌，粉碎成粗粉；

（2）将黑虎掌菌粗粉装入渗漏装置，加入8~12倍量石油醚，浸泡1-2h；

（3）取滤渣再加入8~12倍量氯仿，浸泡1-2h，收集渗漏液，减压回收氯仿，得到黑虎掌菌的氯仿提取物。

将上述黑虎掌菌的氯仿提取物（CE）进行药效试验：

试验例一：黑虎掌菌的氯仿提取物对前列腺癌细胞增殖能力的抑制活性

应用不同浓度的黑虎掌菌的氯仿提取物（25μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL）作用于正常前列腺上皮细胞系（BPH）和4个前列腺癌（LNCaP、22Rv1、PC-3、DU-145）细胞48h，收集细胞，进行cell counting kit-8（CCK-8试剂盒）增殖实验检测黑虎掌菌的氯仿提取物对前列腺癌细胞的增殖抑制效果，如表1所示。同时应用Cell Death Detection ELISA kit（细胞凋亡检测酶免疫试剂盒）检测黑虎掌菌的氯仿提取物对前列腺癌细胞凋亡的影响，如图1所示。

由表1可以看出，黑虎掌菌的氯仿提取物抑制细胞生长在所有的5个细胞系以剂量依赖的方式。与比正常前列腺上皮细胞系(BPH)，4个前列腺癌细胞系(LNCaP，22 Rv1，PC-3，DU-145)对黑虎掌菌的氯仿提取物更敏感。当给药浓度达到50 μg/ml时，在4个前列腺癌细胞中，其细胞数量显著下降，而在BPH基本不变，提示黑虎掌菌的氯仿提取物具有抑制前列腺癌细胞增殖的能力，而对正常细胞影响不大。

由图1可以看出，随着黑虎掌菌的氯仿提取物浓度的升高和作用时间的延长，肿瘤细胞数量越来越少，而正常对照组的肿瘤细胞数量则增多，提示黑虎掌菌的氯仿提取物具有抑制前列腺癌细胞增殖的能力。

试验例二：黑虎掌菌的氯仿提取物对前列腺癌裸鼠移植瘤的抑制活性

建立LNCap裸鼠模型，口服给予黑虎掌菌的氯仿提取物，通过观察给药前后动物各项症状、肿瘤体积、检测动物血清中前列腺特异性抗原(PSA)水平等相关指标，研究黑虎掌菌的氯仿提取物的抗前列腺癌活性，并阐明其可能作用机制。

2.1 建模方法

（1）取对数生长期的人前列腺癌LNCap细胞株收集重悬至无血清培养基中，使浓度为1.0×10⁷cells/mL；

（2）40只裸鼠适应环境1周，其中30只（实验动物数根据相关文献，成瘤时间大约8-12周，造模成功率80%计），于肩胛处皮下接种0.2 mL LNCap 细胞悬液，接种量为1.0×10⁶cells/只，制备动物模型。另外10只为正常对照组。

2.2实验分组及给药

按黑虎掌菌的氯仿提取物给药剂量为250 mg/kg(CE-高剂量组)、100 mg/kg(CE-低剂量组)；每日给药一次，连续给药3周。模型组和空白对照组给予等体积的含0.5%羧甲基纤维素钠的蒸馏水。

造模3周后，用游标卡尺测量裸小鼠瘤块的最大瘤径和最小瘤径，选择肿瘤体积适中的裸鼠24只，随机分为3组，每组8只；另加一组正常对照组（未荷瘤的正常裸鼠），共4组。其中分组及给药方案见下表2：

2.3 试验指标和观察时间

（1）使用测量瘤径的方法，动态观察被试药物的抗肿瘤效应。给药当天开始测量肿瘤直径，每2天测量1次，观察时间至实验结束（d21）；

（2）每次测量瘤径的同时称量小鼠体重；

（3）取材

血样：实验结束后，摘眼球取血1 mL，离心后，用Total PSA 检测试剂盒测定血浆中PSA含量；用试剂盒检测血浆中相关细胞因子，结果见表3。

组织：脱颈椎处死小鼠，用数码相机对荷瘤裸鼠和瘤块拍照记录，计算肿瘤重量。结果图2所示。

统计方法

实验数据以平均值和标准差（±s）表示，采用SPSS18.0统计软件中的单因素方差分析进行统计学检验，p<0.05表示差异具有显著性意义，p<0.01表示差异具有极其显著性意义。

由表3可以看出，与正常组比较，模型组各炎性因子显著增加 （P<0.05）；而灌服黑虎掌菌的氯仿提取物后，各炎性指标显著下降（P<0.05），提示黑虎掌菌的氯仿提取物在肿瘤小鼠中具有抗炎作用。

由图2可以看出，与模型组比较，灌服黑虎掌菌的氯仿提取物后，其肿瘤的重量显著降低，其中，模型组（2.50.34），CE-高剂量组（0.150.04），CE-低剂量组（0.500.02），提示黑虎掌菌的氯仿提取物能显著抑制前列腺癌细胞LNCaP裸鼠移植瘤的生长。

安全性评价：

毒性试验，按照《中药、天然药物安评技术指导原则》，黑虎掌菌提取物的给药量范围为10-500mg/kg。最大给药量500mg/kg灌胃给予昆明小鼠，连续观察14天，未有动物死亡。表明黑虎掌菌提取物的安全剂量范围较大，用药安全。

应用例：含有黑虎掌菌提取物的胶囊剂的制备

有效成分：黑虎掌菌的氯仿提取物62份；

辅料：预胶化淀粉28份，微粉硅胶4份，硬脂酸镁6份。

制备工艺：将黑虎掌菌的氯仿提取物、预胶化淀粉、微粉硅胶、硬脂酸镁投入混合机中混合均匀。

将上述混合料通过全自动胶囊填充剂填充入胶囊，即得。