格列本脲在制备防护放射性肺损伤药物中的应用

摘要

本发明涉及医药技术领域，提供了格列本脲或其衍生物在制备防护放射性肺损伤药物中的应用。进一步，本发明还提供了一种防护放射性肺损伤的药物组合物，由格列本脲或其衍生物以及药学上可接受的辅料组成。通过小鼠体内实验，格列本脲能明显减轻照射引起的血管内皮的破坏程度，从而抑制了红细胞渗出增加，减轻了照射后肺部出血的情况；通过体外细胞学实验，格列本脲能够减少细胞照后凋亡率，改善增殖抑制情况。说明照前运用格列本脲能减轻小鼠放射性肺损伤，保护血管内皮，降低血管内皮细胞对放射的敏感性，为格列本脲或其衍生物防护放射性肺损伤提供了新的依据。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及格列本脲或其衍生物在制备防护放射性肺损伤药物中的应用，以及含有格列本脲或其衍生物的药物组合物。

背景技术

随着核辐射在工业、医疗、军事等领域的广泛应用，放射工作人员和公众受照的几率大大增加，辐射损伤及防护更加受到学界及公众的关注。在核战争、核事故等突发情况下，相关人员暴露在大剂量照射下可发生急、慢性放射病，其中放射性肺损伤(Radiation-induced lung injury,RILI)因其发生率高、难预防、难治疗而日益受到关注。

此外，放射性肺损伤亦是胸部肿瘤放射治疗的常见并发症，胸部肿瘤放疗时有29.3％病人伴有放射性损伤发生，因此，寻找有效的防治放射性肺损伤的药物或方法，在军事医学领域和肿瘤放疗中均具有十分重要的意义和应用前景。

放射性肺损伤的发生机制主要为：高能射线的电离作用活化机体内的水分子，进而产生大量的自由基和活性氧(ROS)，对肺泡上皮细胞、血管内皮细胞等肺组织实质细胞造成损害，最终导致放射性肺损伤的发生(参见文献：Zhang Y,Zhang X,Rabbani ZN,JacksonIL,Vujaskovic Z.Oxidative stress mediates radiation lung injury by inducingapoptosis.Int J Radiat Oncol Biol Phys.2012；83(2):740-8)。

目前对于放射性肺损伤的治疗药物主要为活性氧(ROS)清除剂(如W2721)，以及抗炎药物(如激素)。但这些药物往往副毒作用较大，且缺乏特异性，限制了其在临床中的广泛应用。因此，找到一种新的、有效的、毒副作用小、特异性强的治疗药物，是目前放射生物学和放射医学研究的重点和难点。

格列本脲(Glibenclamide，CAS登录号10238-21-8)是一种经典的糖尿病治疗药物，其作用靶点为ATP敏感钾离子通道(ATP sensitive potassium channel，K_ATP通道)。过去对于格列本脲的研究主要集中在其促进胰岛素分泌的作用上(参见文献：Riefflin>ATP通道进而减少细胞内ROS含量(参见文献：LiDL,Ma>

目前尚未有文献报道格列本脲在放射性肺损伤中的防治作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种格列本脲或其衍生物的新的医药用途，以及含有格列本脲或其衍生物的药物组合物。

本发明的第一方面在于提供格列本脲或其衍生物在制备防护放射性肺损伤药物中的应用，该防护放射性肺损伤药物为减轻照射后肺出血、降低细胞照后凋亡率或减轻照射对细胞增殖抑制的药物。其中，所述减轻照射后肺出血的药物为减少肺组织血管内皮破坏的药物。

进一步，防护放射性肺损伤药物为减少细胞内活性氧(ROS)含量的药物。由前所述可知，ROS的增多是放射性肺损伤发生的关键环节，减少细胞内ROS含量有助于放射性肺损伤的防护。

本发明中的格列本脲衍生物指的是能够发挥药理作用的格列本脲化合物，如格列本脲二氟衍生物等。

为了验证格列本脲对于放射性肺损伤的防护效果，本发明通过对小鼠体内实验和细胞学的体外实验两个方面验证了格列本脲对小鼠肺组织和血管内皮细胞HUVEC的辐射防护作用。

对于小鼠体内实验选择C57/BL6，7周龄的雄性小鼠进行实验，照射前1小时予以小鼠腹腔注射格列本脲(10mg/kg)。防护小鼠的照射方式为单次胸部局部照射，剂量为30Gy，剂量率为1Gy/min，照射源采用60Coγ射线；对于细胞学的体外实验，照射前1小时，100μmol/L的格列本脲处理血管内皮细胞HUVEC，防护的HUVEC细胞所接受的照射剂量为8Gy，剂量率1Gy/min，照射源为60Coγ射线。

通过实验发现，小鼠照前1小时给药能明显减轻照射引起的小鼠肺部出血、红细胞渗出增加，并保护肺上皮细胞和肺血管内皮细胞，减少其凋亡；对血管内皮细胞HUVEC进行实验，照射能诱导血管内皮细胞发生凋亡、抑制细胞增殖，而照前予以格列本脲处理1小时能减少细胞照后凋亡率，改善增殖抑制情况。说明照前运用格列本脲能减轻小鼠放射性肺损伤，保护血管内皮，降低血管内皮细胞对放射的敏感性。

本发明所述的防护放射性肺损伤药物是格列本脲或其衍生物作为唯一活性成份或者是包含格列本脲或其衍生物的药物组合物。

本发明所述的药物或药物组合物可以和药学上常用的辅料制成任何剂型，例如其可以是为汤剂、散剂、丸剂、酒剂、锭剂、胶剂、膏药、茶剂、曲剂、糕剂、露剂、棒剂、线剂、条剂、钉剂，灸熨剂，膏剂、丹剂、微型胶囊、静脉乳剂、脂质体制剂、气雾剂、前体药制剂、注射剂、合剂、口服安瓿剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、乳剂、软膏剂、橡胶硬膏、膜剂、海绵剂、离子透入剂，或透皮吸收剂。

本发明的第二方面在于提供一种防护放射性肺损伤的药物组合物，由格列本脲或其衍生物以及药学上可接受的辅料组成。

本发明的格列本脲或其衍生物用于预防放射性肺损伤，特别适用于核战争、核事故、放射工作人员、胸部肿瘤放疗治疗患者等伴有的放射性肺损伤。本发明的格列本脲或其衍生物尤其可用于预防放射性肺损伤，即提前给药于可能遭遇放射性肺损伤的人群，给药方式不限于口服、注射等。

发明的作用与效果

通过小鼠体内实验，格列本脲能明显减轻照射引起的血管内皮的破坏程度，从而抑制了红细胞渗出增加，减轻了照射后肺部出血的情况；通过体外细胞学实验，格列本脲能够减少细胞照后凋亡率，改善增殖抑制情况，说明照前运用格列本脲能减轻小鼠放射性肺损伤，保护血管内皮，降低血管内皮细胞对放射的敏感性。因此，本发明为格列本脲或其衍生物防护放射性肺损伤提供了新的依据。

此外，由于格列本脲是成熟的糖尿病治疗药物，其商品名有优降糖、达安疗、达安宁等，其药理作用明确、毒副作用小，药物安全性已得到临床认可，本发明提供的格列本脲的新适应症可较快实现临床转化，并且格列本脲的靶点“K_ATP通道”在不同组织中表达差异较大(目前报道主要高表达于胰腺、肝脏、神经、肌肉、血管内皮等组织)，较其他抗放药而言，特异性较强，尽可能减少了对其他组织的毒性损伤，因此，格列本脲在临床放射性肺损伤的防护应用上具有巨大潜力。本发明也为预防和治疗核辐射带来的损伤提供了新的临床药物。

附图说明

图1是格列本脲对小鼠照射后肺出血的影响结果图，其中，A为格列本脲减轻小鼠照射后肺出血的结果图，B为肺泡壁厚测量的结果图，用于衡量肺组织内细胞渗出程度。

图2为格列本脲对照射引起的小鼠肺组织细胞凋亡的影响结果图。其中，A为TUNEL法标记凋亡细胞(阳性为棕色)的结果图；B为肺组织细胞凋亡率的定量统计结果图；C为肺组织血管内皮细胞凋亡率的定量统计结果图。

图3格列本脲对小鼠肺组织湿/干重比的影响结果图。

图4为格列本脲对血管内皮细胞系HUVEC照后的凋亡的影响结果图。其中，A为AnnexinV/PI试剂盒通过流式细胞仪检测的结果；B为格列本脲对细胞凋亡率影响的定量统计结果。

图5为格列本脲对血管内皮细胞系HUVEC的增殖抑制作用的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明进行详细描述。但下列实施例不应看作对本发明范围的限制。

实施例1：格列本脲能够减轻小鼠照射后肺损伤、肺出血

一、实验方法

选取C57/BL6、7周龄的雄性小鼠进行实验，将小鼠分为未照射组、格列本脲组以及对照组三组。未照射组既不进行注射也不进行照射，格列本脲组在照射前1小时予以小鼠腹腔注射格列本脲(10mg/kg)，因格列本脲用二甲基亚砜(DMSO)溶解，因此对照组小鼠予以腹腔注射相同剂量的DMSO溶液。

格列本脲组和对照组小鼠照射采用单次胸部局部照射，剂量为30Gy，剂量率为1Gy/min，照射源采用60Coγ射线。照射时肺部暴露于照射野，其余部分采用铅块遮挡，以免造成其他部位的损伤。

照射后分别于第1,3,5天摘取小鼠肺组织进行病理检测。病理检测包含两个方面：一是HE染色，显示肺组织结构及病变情况；二是TUNEL法(详细步骤参见：罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒说明书)检测细胞凋亡情况，通常凋亡细胞可被染色棕色，通过比较棕色细胞所占比例可反映细胞凋亡程度。除了病理检测，我们还测量了小鼠肺组织湿/干重比，即测量新取出的肺组织与烘干后的肺组织重量比值，通过该比值来指示肺组织的渗出情况，从而间接推测血管损伤程度。一般血管损伤严重，渗出增加，肺湿/干比重高。

二、实验结果

以上实验结果由图1～图3显示：(1)肺组织切片HE染色指示照射后第1天对照组(照射+DMSO组)的小鼠肺组织内即出现大量红细胞渗出，血管内皮破坏，而照射+格列本脲组较对照组，红细胞渗出明显减轻，血管内皮破坏减少(图1A)；在照射后第1天，对照组和格列本脲组的肺泡壁厚度均有所增厚，并随着照射时间的延长而不断增加，但格列本脲组的肺泡壁厚的增厚程度远低于对照组的壁厚增厚程度(图1B)。因此，格列本脲减轻了小鼠照射后肺出血，也减轻了肺组织内细胞的渗出程度。

(2)TUNEL染色显示照射引起细胞凋亡增加，表现为棕色细胞增多，尤其在血管内皮细胞上更为明显。格列本脲组较溶剂对照组，明显减少阳性细胞比例(图2)。

(3)肺组织湿/干重比结果显示，照射引起湿/干重比增加，而格列本脲能减轻湿/干重比，说明照射引起血管破坏，肺部渗出增加，而格列本脲减轻了肺部的渗出，保护了肺血管(图3)。

实施例2：格列本脲减轻血管内皮细胞系HUVEC照后的凋亡

一、实验方法：

为了验证格列本脲对照射后细胞凋亡的影响，对照射后的血管内皮细胞系HUVEC进行细胞凋亡检测。

细胞凋亡检测采用AnnexinV/PI双染(购自Invitrogen公司)流式检测法，其原理是：细胞凋亡是一个程序性启动的过程，可分为早期凋亡，晚期凋亡两个过程。在早期凋亡时，磷脂酰丝氨酸(PS)可由原来在细胞磷脂膜内侧的状态变为外翻，此时Annexin V可与外翻的PS结合，作为早期凋亡的一个检测标志。细胞在晚期凋亡阶段，细胞膜通透性增加，此时碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)作为一种核酸染料则可进入细胞内部与核酸结合，细胞核被染成红色。Annexin V标记上荧光素，与PI联合运用就可以通过流式细胞仪的分析来鉴定出细胞凋亡水平(包括早期凋亡和晚期凋亡)。

对HUVEC(购自生命科学院)细胞于照前予以格列本脲(100μM)或者DMSO处理1小时，然后对细胞进行照射，剂量为8Gy，剂量率为1Gy/min。照射后48小时后消化细胞，进行Annexin V/PI染色，进行流式细胞分析。

二、实验结果

如图4所示，照射+格列本脲组较照射+DMSO组凋亡率明显降低，表现为右上和右下象限细胞比例减少(图4A)。细胞凋亡率为坐标图右上象限加右下象限细胞比例之和，统计定量显示，格列本脲明显降低细胞照后凋亡率(图4B)。

实施例3：格列本脲减轻照射对血管内皮细胞系HUVEC的增殖抑制作用

一、实验方法：

细胞增殖能力的检测采用克隆形成实验，其原理为：单个细胞在传代6代以上会形成50个细胞左右的细胞团，称为一个克隆，根据克隆的数目和大小可以反映细胞增殖能力。

细胞接受照射后可有增殖死亡和间期死亡两种形式，因此用克隆形成试验可较好反映细胞的增殖能力。具体操作步骤为：照射前24小时，将HUEVC细胞进行铺板，尽量铺成单个细胞，细胞在增殖时会形成集落，予以染色可观察到染色点(蓝色)，细胞增殖越旺盛，染色点数目越多，面积越大，因此可用于评价细胞的增殖能力。待细胞贴壁后进行加药处理，予以格列本脲(100μM)和DMSO孵育1小时，然后照射。照射剂量分别为8Gy和12Gy，剂量率为1Gy/min，照后更换培养基继续培养，在第10天时对细胞进行结晶紫染色，计数克隆细胞数目。

二、实验结果

如图5所示，相比未照射组(0Gy组)，照射组细胞(8Gy和12Gy)克隆形成数明显减少，克隆面积也较小，且呈现照射剂量依赖性。但运用格列本脲，可显著增加细胞照后克隆数量，说明格列本脲减轻照射对细胞的抑制作用，促进照后细胞的增殖。

上述实施例以格列本脲为例探索了格列本脲对小鼠照射后肺损伤和肺出血、对血管内皮细胞系HUVEC照后凋亡以及对血管内皮细胞系HUVEC的增殖抑制作用的减轻作用，但本发明不限于格列本脲，能够起到同样药理作用的格列本脲衍生物也属于本发明的保护范围。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。