结核感染T细胞的检测试剂盒及其检测方法

摘要

本发明提供一种结核感染T细胞的检测试剂盒及其检测方法。该试剂盒包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽。该检测方法包括步骤：(1)用Ficoll淋巴细胞分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；(2)向重悬后的细胞中加入序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入抗γ干扰素抗体进行抗原抗体反应；(3)对反应后的体系进行洗涤，加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。本发明的试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，极大地降低了成本，具有良好的商业化应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及一种结核感染T细胞的检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

人体感染结核杆菌后，结核杆菌被体内的抗原加工细胞加工，并提呈给体内本来就存在的、但数量极少的抗结核特异性T淋巴细胞，T-淋巴细胞受到刺激而复制扩增，此时，人循环外周血中的抗结核特异性T淋巴细胞就能被检测到。而未经结核感染的人血液中很难检测到抗结核特异性T淋巴细胞，因此根据循环外周血中抗结核特异性T淋巴细胞的数量，可以判断是否感染结核杆菌，用于结核感染的临床辅助诊断。

在检测时，将循环外周血淋巴细胞与致病性结核杆菌刺激物混合，于预包被了抗人IFN-γ单克隆抗体的培养板上培养，从而使外周血淋巴细胞中的抗结核特异性T细胞接受刺激，继而产生IFN-γ，IFN-γ被预包被在纤维素膜上的抗人IFN-γ单克隆抗体捕获，再用生物素标记的抗人IFN-γ抗体、AP酶标记链亲和素和显色液进行反应，从而在纤维素膜上留下可见的斑点，一个斑点即是代表一个抗结核特异性T细胞。根据斑点数的多少可以辅助判断受检者是否曾经遭到结核杆菌的感染。

然而，现有对结核感染T细胞的检测试剂盒存在制备方法复杂、耗时长、价格昂贵等问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种结核感染T细胞的检测试剂盒及其检测方法，以期解决上述现有技术中存在的至少部分技术问题。

为了实现上述目的，本发明提供一种结核感染T细胞的检测试剂盒，其包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽。

本发明中，所述的结核感染T细胞是其常规含义，即指受到结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染而产生的特异性T淋巴细胞。

本发明中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽在试剂盒中作为TB刺激物，用于检测反应。

优选地，在所述结核感染T细胞的检测试剂盒中，氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽中的每一条的含量为10mg。

优选地，所述结核感染T细胞的检测试剂盒还包括无血清培养基，更优选Gibco公司生产的AIM V培养基。

优选地，所述结核感染T细胞的检测试剂盒还包括Ficoll淋巴细胞分离液。

优选地，所述结核感染T细胞的检测试剂盒还包括抗γ干扰素抗体和/或结核感染T细胞阳性刺激物。

优选地，所述结核感染T细胞的检测试剂盒还包括用于酶联免疫斑点法(Enzyme-linked immunospot assay，Elispot)的显色试剂，如NBT/BCIP显色系统，最终显色蓝紫色斑点，或AEC显色系统，最终显色红色斑点。

本发明还提供利用前述结核感染T细胞的检测试剂盒对结核感染T细胞进行检测的方法，包括如下步骤：

(1)用Ficoll淋巴细胞分离液分离待测样本，将分离好的细胞重悬于无血清培养基中；

(2)向重悬后的细胞中加入氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽进行共孵育，然后向共孵育的体系中加入抗γ干扰素抗体进行抗原抗体反应；

(3)对抗原抗体反应后的体系进行洗涤，再加入显色底物进行显色反应，计数反应生成的斑点数。

步骤(1)中，所述将分离好的细胞重悬于AIM-V培养基中优选保持细胞浓度为1.0×10⁵～3.0～10⁵细胞/ml。

步骤(2)中，所述重悬后的细胞优选加入96孔板中，所述加入氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽优选加入96孔板中与重悬后的细胞混合以进行共孵育。所述重悬后的细胞的添加量更优选每个反应孔为100μL，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽的添加量优选每个反应孔中的终浓度为5μM。所述共孵育的时间优选16～20小时。

如本领域常规，步骤(2)在操作时，优选设置阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为结核感染T细胞阳性刺激物，即CD3单克隆抗体；所述阴性对照为AIM-V培养基留白，即反应孔中只添加AIM-V培养基，不添加任何其他试剂。

必须要指出的是，本发明所述的对结核感染T细胞进行检测的方法属于针对体外分离样本进行鉴定定性的检测方法，仅以获得待测样本中是否存在被结核杆菌刺激而感染的T淋巴细胞以及这些结核感染T细胞的数量为直接结果和目的，并不涉及对人体健康状况的判断，不属于与疾病诊断相关的方法。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明除特别说明之外，所用的百分比都是体积百分比。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：本发明提供的包括氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽的检测试剂盒能够人工全序列合成，生产方便快捷，稳定性和特异性高，且相比传统方法使用的检测蛋白而言分离纯化的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，具有良好的商业化应用前景。

附图说明

图1是本发明实施例1中检测阴性和阳性例数的结果图，其中A是阴性对照，B为待检样本孔，C为阳性对照。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。

正常人体内的抗结核特异性T细胞一般处于休眠状态，数量很少，用一般的方法无法检出。而人感染结核杆菌后特意性的T细胞受到刺激而由休眠状态变成激活状态而繁殖，数量增加，有些细胞变成记忆细胞，有些为效应细胞。在体外，这些结核感染T细胞一旦受到结核特意性蛋白片段刺激后就会产生免疫应答反应而产生效应分子，γ干扰素是其中最常见的大效应分子。

本发明的研发人员基于结核杆菌的免疫应答机制对传统的检测方法进行了创新，研发出了能够人工全序列合成的7条多肽作为检测物(即序列表中的多肽1～多肽7，氨基酸编码序列对应为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7)，经过大量的实验验证，并经和现有的检测方法对比，具有明显优势，本发明的包含氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示的7条多肽的试剂盒及利用其对体外结核感染T细胞待测样本进行检测的方法具有方便快捷、准确度高、成本低等优势，具有良好的应用前景。

下面是具体的实施例，用于进一步阐述本发明的技术方案及技术效果。

实施例1

人外周血(PBMC)样本来源于结核病人及非结核人群，数量为127个待测样本。

每个采样个体身上用肝素钠收集管采集10ml血液，室温条件下6小时内运至实验室。

各待测样本的检测步骤如下：

1)用Ficoll淋巴细胞分离液将PBMC分离，分离好的细胞重悬于AIM-V培养基中，细胞浓度为2.5×10⁶细胞/ml；将重悬的细胞加入PVDF96孔板中，每个反应孔加入100μL，每个样品加入10孔中，即做10个重复；

2)向各反应孔中加入由AIM-V培养基和终浓度分别达到5μM的7条多肽(氨基酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示)组成的混合物50μl，混合均匀；检测设置阳性对照和阴性对照，阳性对照为检测孔中加入阳性刺激物CD3单克隆抗体，阴性对照为检测孔中不加刺激物，只加AIM-V培养基；

3)5％的二氧化碳培养箱37℃孵育16～20小时；

4)将反应孔中的细胞倒掉，用PBS缓冲液洗涤三次，拍干水份，然后每孔中加入碱性磷酸酶(AP)标记的γ-干扰素检测抗体，室温孵育1小时；

5)再用PBS缓冲液洗涤三次，拍干水份，加入AP标记的链霉亲和素，室温孵育0.5小时，加入底物显色液BCIP/NTP，室温孵育25～30分钟，孵育过程中观察斑点形成，用自来水冲洗板子，拍干板子，自然风干，用ELISPOT读数系统计数分析斑点。

结果分析：使用斑点分析仪计数斑点形成细胞(spot forming cells,SFCs)的数量，根据阴性和阳性判定标准的判定，分别统计检测阴性和阳性例数(如图1所示)。查询临床数据，分别统计实验人群中临床诊断阴性和阳性的数量，对统计的数据进行分析，可得阳性符合率，阴性符合率。

试验数据总结如下表1所示：

表1实施例1试验结果统计

阳性符合率：73/(73+7)＝91.25％，

阴性符合率：44/(44+3)＝93.62％，

实验结果表明，与现有使用相同方法的已上市产品相比较，有相类似的灵敏度及特异性，因此本发明的7种多肽混合物可以作为结核感染T细胞检测试剂盒(酶联免疫斑点法)中的TB刺激物使用，且成本低廉，具有很好的实际推广应用前景。

在本发明其他的具体实施例中，检测的结果具有与实施例1相当的灵敏度和特异性。

综上所述，本发明的多肽混合物、检测试剂盒及其相应的检测方法用于检测结核感染T细胞，具有生产方便快捷，稳定性和特异性高的特点，且相比传统方法使用的检测蛋白而言分离纯化的过程大大简化，极大地降低了成本。利用该试剂盒对分离的体外样本进行检测方便快捷，可控性和精确性均非常理想，具有良好的商业化应用前景。

以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南通表源生物技术有限公司

<120> 结核感染T细胞的检测试剂盒及其检测方法

<130> IB168911

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽1

<400> 1

Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly Val Gln Tyr Ser Arg Ala

1 5 1015

Asp Glu Glu Gln

20

<210> 2

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽2

<400> 2

Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys Gln Lys

1 5 1015

Gln Glu Leu Asp

20

<210> 3

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽3

<400> 3

Thr Ala Thr Glu Leu Asn Asn Ala Leu Gln Asn Leu Ala Arg Thr Ile

1 5 1015

Ser Glu Ala Gly

20

<210> 4

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽4

<400> 4

Glu Gly Lys Gln Ser Leu Thr Lys Leu Ala Ala Ala Trp Gly Gly Ser

1 5 1015

Gly Ser Glu Ala

20

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽5

<400> 5

Asn Leu Ala Arg Thr Ile Ser Glu Ala Gly Gln Ala Met Ala Ser Thr

1 5 1015

Glu Gly Asn Val

20

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽6

<400> 6

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala Ser

1 5 1015

Ala Ile Gln Gly

20

<210> 7

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 多肽7

<400> 7

Met Thr Glu Gln Gln Trp Asn Phe Ala Gly Ile Glu Ala Ala Ala

1 5 1015