可杀伤布氏锥虫的化合物及其在锥虫病治疗方面的应用

摘要

本发明涉及可杀伤布氏锥虫的化合物及其在锥虫病治疗方面的应用，所述化合物为GSK2801，其特异靶向TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域，与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域的亲和力高，高效地杀伤布氏锥虫。

说明书

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及可杀伤布氏锥虫的化合物，包含所述化合物的药物组合物，及其在制备治疗锥虫病的药物方面的用途。本发明的的化合物可以作为治疗非洲锥虫病药物的前体分子进行开发或可直接用于锥虫病治疗。

背景技术

布氏锥虫是一种单细胞的真核寄生生物，包括布氏布氏锥虫、冈比亚布氏锥虫、罗德西亚布氏锥虫三个亚种，可以通过虫媒采采蝇感染人和其他动物，引起人的嗜睡病(sleeping sickness)和动物的拿干拿病(nagana disease)，统称非洲锥虫病。人感染布氏锥虫后如果缺乏及时治疗，在感染晚期具有很高的死亡率。目前用于治疗非洲锥虫病的药物容易产生耐药性，并且具有很强的副作用，因此迫切需要开发新的药物来克服这些困难。

对布氏锥虫等寄生生物表观遗传机制的研究显示多个与染色质有关的蛋白因子能够影响布氏锥虫的转录¹，而包括组蛋白修饰在内的染色体标签可直接参与基因转录起始和终止的调控。先前的研究报道布氏锥虫基因表达调控主要是转录后水平上进行，但近年来布氏锥虫中各类转录因子的发现暗示了布氏锥虫具有较为复杂的转录水平的调节方式，表观遗传就是这样一个调节方式。研究布氏锥虫的表观遗传学调控将为本发明人了解布氏锥虫转录调控，致病机理以及寻找治疗锥虫病的策略提供重要线索。

乙酰化赖氨酸结合结构域(bromodomain)是表观遗传调控过程中的重要蛋白结构域元件，在真核细胞的转录过程以及DNA损伤修复等过程中具有重要作用，鉴于这个结构域的重要性，目前已有很多针对乙酰化赖氨酸结合结构域的特异性抑制剂被开发出来，已有一些已经在美国开展癌症方面的临床试验。TbBDF2是布氏锥虫中的分子量为25500道尔顿的含有一个乙酰化赖氨酸结合结构域的蛋白质，研究显示TbBDF2在布氏锥虫感染过程中发挥重要的角色，这一特点使TbBDF2的乙酰化赖氨酸结合结构域成为筛选抑制剂的优质靶标²。

目前化合物I-BET151作为乙酰化赖氨酸结合结构域抑制剂已经被用于治疗非洲锥虫病的研究中²，但存在特异性差、亲和力低、机制不明确等缺点。因此急需寻找一种靶向特异性强，对哺乳动物等宿主低毒的小分子化合物。

发明内容

本发明通过计算机模拟筛选和实验验证的方法发现了化合物 GSK2801是TbBDF2，特别是其乙酰化赖氨酸结合结构域的特异性抑制剂。化合物GSK2801的分子式为：

本发明人发现化合物GSK2801能在较低浓度杀伤布氏锥虫。

通过蛋白质结构分析和核磁化学微扰实验，本发明人发现化合物GSK2801作用于TbBDF2分子，其机制为GSK2801能够高效地结合 TbBDF2中的乙酰化赖氨酸结合位点，从而抑制TbBDF2与乙酰化的组蛋白变体H2AZ的结合，干扰TbBDF2行使其细胞功能。较低浓度的GSK2801 (10μM)即能诱导TbBDF2的细胞定位发生变化，这也表明TbBDF2的正常功能受到影响。浓度为20～40μM的GSK2801处理布氏锥虫427细胞系，在24～96小时内可引起427细胞生长受到明显抑制，并出现大量细胞死亡。

本发明人还发现化合物GSK2801能够长效阻断TbBDF2与乙酰化的组蛋白变体H2AZ的结合，并且具有较强的阻断作用。

由此，本发明一方面提供化合物GSK2801在制备药物中的用途，所述药物用于杀伤锥虫。

在优选的实施方案中，所述锥虫是布氏锥虫。

本发明另一方面提供化合物GSK2801在制备药物中的用途，所述药物用于治疗锥虫病。

在优选的实施方案中，所述锥虫病是非洲锥虫病。

在优选的实施方案中，所述锥虫病包括嗜睡病(sleeping sickness)和拿干拿病(nagana disease)。

本发明的另一方面提供化合物GSK2801在制备药物中的用途，所述药物用于抑制TbBDF2的功能，特别是TbBDF2的乙酰化赖氨酸结合结构域。

在本发明中，TbBDF2蛋白是本领域技术人员已知的蛋白，存在于非洲锥虫中，其蛋白数据库Uniprot编号为Q38AM1，其具有乙酰化赖氨酸结合结构域(bromodomain)。

在优选的实施方案中，所述化合物GSK2801以低浓度施用。

在优选的实施方案中，所述化合物GSK2801的浓度为10～40μM。

本发明另一方面提供一种药物组合物，其包含化合物GSK2801和药用载体，所述药物组合物用于杀伤锥虫或治疗锥虫病。

根据本发明，化合物GSK2801特异靶向TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域，与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域的亲和力高，抑制剂作用机制清楚，并且具有高效的杀伤布氏锥虫的能力。

附图说明

图1TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域识别组蛋白变体H2AZ的氮端多乙酰化氨基酸残基。

A-B通过纯化TbBDF2来富集与其相互作用的蛋白(A)，并通过液质联用质谱技术鉴定出TbBDF2结合的组蛋白变体上的乙酰化修饰位点(B)。

C-D通过等温滴定微量热实验筛选TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域具体识别的H2AZ上的乙酰化赖氨酸位点，最终发现TbBDF2特异性识别多乙酰化的H2AZ的氮端(C)，而未修饰H2AZ的氮端不被TbBDF2识别(D)。

图2GSK2801特异性结合TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域。

A，等温滴定微量热实验表明GSK2801与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域具有很高的亲和力。

B，等温滴定微量热实验表明GSK2801与TbBDF5蛋白(另外一个含有乙酰化赖氨酸结合结构域的蛋白，表达目的蛋白的载体来自本实验室，属于常规表达载体)的第一个乙酰化赖氨酸结合结构域无结合。作为阴性对照。

图3GSK2801抑制TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域(TbBDF2-BD)结合氮端多乙酰化的H2AZ。

A，核磁化学微扰实验显示N端多乙酰化的H2AZ(上)和GSK2801(下) 都结合到TbBDF2的乙酰化赖氨酸结合位点(发生明显化学位移的位点是直接或间接的结合位点)。

B，等温滴定微量热实验。氮端多乙酰化的H2AZ小肽分别滴定TbBDF2 乙酰化赖氨酸结合结构域(上)和TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域 -GSK2801的混合物(下，混合物前后两者浓度比为1∶3)。结果证实了 GSK2801对TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域的阻断作用。

图4GSK2801对细胞生长的影响

A，不同浓度的GSK2801对细胞生长的影响，每种浓度的GSK2801都保持DMSO(二甲亚砜)浓度一致。

B，刃天青(Resazurin)染色法测量GSK2801对细胞活力的影响。不同浓度的GSK2801处理细胞72小时，后加入刃天青(终浓度22.88mg/ml)6 小时，用spectra MAXgemini EM检测。数据用OriginPro 8.0处理。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均从生工生物工程(上海)股份有限公司购得。

前循环型布氏锥虫427细胞系(下文也称为“427细胞”)来自美国德州大学休斯顿医学中李子银副教授实验室的赠予。携带EYPF和PTP (proteinA-TEV-proteinC)蛋白标签的TbBDF2细胞系均按照Schimanski B 等人的方法³制备。乙酰化赖氨酸结合结构域的小分子抑制剂(例如本发明的GSK2801)购自APExBIO>

实施例1化合物GSK2801抑制氮端多乙酰化的H2AZ与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域的结合

(一)TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域可结合氮端多乙酰化的H2AZ

运用蛋白亲和纯化和液质联用质谱学方法⁴鉴定TbBDF2结合的组蛋白。收取0.5升培养的碳端带有PTP纯化标签的TbBDF2细胞重悬于裂解缓冲液(20mM>2，2％glycerol，1>

根据以上鉴定得到的结果，本发明人从上海吉尔生化公司订购合成了乙酰化或多乙酰化的多肽，运用等温滴定微量热实验筛选鉴定TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域可结合的乙酰化的H2AZ肽段。具体实验步骤如下，每隔120秒滴定1.8微升2.0毫摩的多肽到0.1毫摩TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域(把TbBDF2表达基因1-330bp的表达框克隆到pET22载体中，用BL21表达得到目的蛋白)中，共滴定20次。最终鉴定出TbBDF2 乙酰化赖氨酸结合结构域可结合氮端多乙酰化的H2AZ多肽 (H2AZ_27-63hKAc)(解离常数为K_d＝460微摩)，见表1、表2、图1C-D。

表1等温滴定微量热实验用到的小肽，下划线表示乙酰化的K。

*多乙酰化小肽

表2等温滴定微热量实验检测结果

小肽K_dH2AZK31Ac不结合H2AZK35Ac不结合H2AZK43Ac不结合H2AZK45Ac不结合H2AZK47Ac不结合H2AZK49Ac不结合H2AZK51Ac不结合H2AZK55Ac不结合H2AZK59Ac不结合H2BV_3-23hKAc2500μMH2BV_29-45hKAc不结合H2AZ_163-178hKAc不结合H2AZ_27-63不结合H2AZ_27-63hKAc460μM

(二)化合物GSK2801特异性结合TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域

本发明人利用多维核磁共振技术解析了TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域的核磁溶液结构(蛋白数据库PBD的检索号：2N9G)，并利用小分子筛选软件PYRX对常用的乙酰化赖氨酸结合结构域抑制剂进行模拟筛选，结合等温滴定微量热实验的结果，本发明人最终确定GSK2801这个小分子能够高亲和地，特异地结合TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域(解离常数K_d＝15微摩)。见图2。PYRX软件使用方法见http：//pyrx.sourceforge.net/。等温滴定微量热的实验步骤如下：每隔120s滴定1.8微升0.80毫摩>

(三)化合物GSK2801抑制氮端多乙酰化的H2AZ与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域的结合

组蛋白H2AZ氮端多乙酰化的多肽(是上述吉尔生化合成的)以及 GSK2801分别与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域进行核磁化学微扰实验⁵，其中TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域浓度为0.3毫摩，H2AZ氮端多乙酰化多肽和GSK2801对蛋白的摩尔浓度比分别为1∶10和1∶0.5。最后通过公式计算统计得到氢¹和氮¹⁵化学位移变化，发现H2AZ的氮端多乙酰化的多肽以及GSK2801都可以结合到>

根据以上结果，本发明人利用等温滴定微量热仪实施了H2AZ氮端多乙酰化的多肽与小分子GSK2801的竞争性结合实验。在同样的DMSO浓度的条件下，进行了多肽与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域的滴定和 H2AZ氮端多乙酰化的多肽与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域-GSK2801 混合物的滴定实验，见图3B。结果显示小分子GSK2801能够有效抑制氮端多乙酰化的H2AZ与TbBDF2乙酰化赖氨酸结合结构域结合。

实施例2化合物GSK2801可导致TbBDF2在布氏锥虫体内的定位发生变化

分别用DMSO(作为阴性对照)和10微摩的GSK2801处理带有EYFP 标签的TbBDF2的细胞系48小时，然后利用荧光显微镜对其细胞内定位进行观察发现，对照组TbBDF2主要定位在细胞核仁内，而GSK2801处理后的细胞内TbBDF2的定位由核仁变为整个细胞核，同样的现象也发生在20μM处理的细胞内。这说明小分子GSK2801能够导致TbBDF2在布氏锥虫细胞的定位发生变化，从而诱导TbBDF2蛋白的功能缺失。

实施例3化合物GSK2801可有效杀伤布氏锥虫

在相同的DMSO浓度条件下，分别用0，10，20，30，40微摩的GSK2801 处理427细胞，并每天进行细胞计数。发现用浓度为20～40μM的GSK2801 处理427细胞系后，在24～96小时可诱导427细胞明显的生长抑制，并出现大量细胞死亡，见图4A。

小分子GSK2801按照浓度梯度稀释((35，30，25.6，12.8，6.4，3.2，1.6， 0.8，0.4，0.2，0.1，0微摩))并加入96孔板中，孔中再加入含有2×10⁵个>

参考文献

以下参考文献的内容通过参考结合于本文。

¹Figueiredo>

²Jeffers>

³Schimanski>

⁴Liao>

⁵Mei>

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学技术大学

<120> 可杀伤布氏锥虫的化合物及其在锥虫病治疗方面的应用

<130> IB178633

<160> 14

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

His Lys Ser Leu Glu Lys Lys Ile Ile Lys Lys Ser Lys Arg Gly Ser

1 5 1015

<210> 2

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Leu Thr Gly Gly Lys Leu Gly Gly Lys Ala Val Gly Pro Ala His Gly

1 5 1015

Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Gly

202530

Lys Ala Gly Arg Arg

35

<210> 3

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ala Leu Thr Gly Gly Lys Leu Gly Gly Lys Ala Val Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Thr Gly Gly Lys Leu Gly Gly Lys Ala Val Gly Pro Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Gly Pro Ala His Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly

1 5 10

<210> 6

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

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1 5 10

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

His Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Arg Gly

1 5 10

<210> 8

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Arg Gly Gly

1 5 10

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Lys Gly Lys Gly Lys Gly Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly

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<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Gly Lys Gly Lys Arg Gly Gly Lys Thr Gly Gly Lys Ala Gly

1 5 10

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<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Ser Ser Ser Arg Lys Lys Ser Gly Ala Arg Arg Gly Lys Lys Gln Gln

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Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

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20

<210> 14

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Leu Thr Gly Gly Lys Leu Gly Gly Lys Ala Val Gly Pro Ala His Gly

1 5 1015

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202530

Lys Ala Gly Arg Arg

35