抗CD40‑HER2双特异性单链抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用

摘要

本发明公开了一种CD40‑HER2双特异性单链抗体，其核酸序列是由CD40 ScFv的VH片段、HER2 ScFv的VL片段，HER2 ScFv的VH片段，CD40 ScFv的VL片段依次拼接而成，核酸序列如SEQ ID NO：1 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。本发明双特异性单链抗体将肿瘤免疫治疗及分子靶向治疗结合在一起的同时，还使CD40相关的免疫激活具有了一定的肿瘤组织聚集性，从而降低了全身免疫激活的毒性，发挥了更好的抗肿瘤效果，具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及DNA重组技术，具体涉及一种抗CD40-HER2双特异性单链抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重要疾病之一，据最新恶性肿瘤发病情况统计表明，2012年全球恶性肿瘤新发病例数为1410万人，死亡病例数为810万人。伴随科技的发展，针对恶性肿瘤的治疗方式取得了巨大的进步，传统治疗方式逐渐被改良优化，新兴的治疗方式不断涌现推广。通过手术的方法直接切除病灶，是最初恶性肿瘤的有效治疗方式，也是当前实体肿瘤的主要治疗方式，历经多年发展，伴随对于疾病更加科学合理的分型分期，手术的切除范围及切除方式也日趋精准。但对于某些进展期患者，由于局部浸润及远处转移的发生，往往已失去手术时机。化学药物作为当前肿瘤治疗发展最快的领域之一，在改善生活质量，巩固手术治疗效果方面发挥了一定的作用，转化治疗方案的出现更是为已失去手术时机的患者带来了新的希望，但化疗药物缺乏肿瘤细胞及组织的特异性，其在杀伤肿瘤细胞的同时，也会干扰正常细胞的生物学活动，从而导致多种毒副作用的发生。因此，提高治疗的特异性，降低药物的毒性是肿瘤治疗的研究目标。

分子靶向治疗，作为一种新兴的肿瘤治疗方式，近年得到了迅猛的发展，并已在大量肿瘤治疗中发挥了显著效果。它多数是以肿瘤细胞表面特异性表达的标志物为靶点，通过小分子化合物或大分子的抗体与其特异性结合，阻断其功能形式的形成或抑制配体-受体的相互作用，从而抑制其下游信号通路网络的激活，最终达到抑制肿瘤增殖的效果。甲磺酸伊马替尼作为一种小分子酪氨酸激酶受体抑制剂，在胃肠间质瘤的治疗中发挥了显著疗效。人类表皮生长因子2（Human Epidermal Receptor 2，HER2），是表皮生长因子家族成员之一，其在胃癌，乳腺癌，结直肠癌及前列腺癌等上皮来源的肿瘤的均有表达，已有研究表明，HER2在胃癌中的表达往往预示不良的预后及更高的恶性程度。对其作用机制的深入研究发现，HER2并无天然配体，它可通过与表皮生长因子家族其他成员形成同源或异源二聚体激活下游通路，包括PI3K/Akt及MAPK/ERK1/2信号通路，从而影响肿瘤的增殖，转移等。因此，若能通过一定手段阻断HER2的二聚化，定能抑制其下游通路的激活，从而抑制肿瘤的增殖转移。曲妥珠单抗（Trastuzumab，Herceptin）是一种可靶向结合HER2的人源化的鼠单克隆抗体，其可通过与HER2胞外区结构域（extracelluar domain，ECD）特异性结合，抑制其同源或异源二聚体的形成，从而阻断其下游信号通路的激活。曲妥珠单抗在HER2阳性表达的乳腺癌及晚期胃癌中发挥了显著疗效，并作为晚期胃癌标准的靶向治疗疗法写入NCCN指南。但单克隆抗体类药物分子量较大，组织穿透性差，为达到满意的治疗浓度，往往需要较高的血药浓度维持，伴随治疗而来的肝肾代谢负担加重不容忽视，且长期使用导致的耐药往往限制了其远期功能的发挥。

伴随对恶性肿瘤发生发展机制研究的深入，人们发现了肿瘤微环境中免疫抑制状态的特点，肿瘤细胞可通过分泌一些抑制性细胞因子，抑制免疫细胞的功能，导致效应淋巴细胞无能，达到肿瘤免疫逃逸的效果。因此，激活肿瘤微环境中肿瘤特异性的免疫反应，或能成为一种新型的更广泛的肿瘤治疗方式，nivolumab作为程序性死亡受体-1（PD-1）的阻断性抗体，首先在进展期黑色素瘤治疗中的获得成功，肯定了免疫疗法在肿瘤治疗中的地位, 并在不同类型的肿瘤治疗中逐步推广。肿瘤相关免疫逃逸的发生是多环节多步骤的过程，其除可通过表达PD-L1诱导T淋巴细胞的凋亡外，还可通过某些途径干扰T淋巴细胞激活的相关免疫信号通路，导致T淋巴细胞无能。CD40/CD40L是重要的第二信号通路，CD40主要表达于树突状细胞等抗原提呈细胞表面。CD40L则主要表达于T淋巴细胞，且在抗原提呈细胞提呈的MHC-I抗原肽复合物与TCR结合后，其表达会显著上调，从而激活第二信号通路，促进树突细胞的成熟，并以正反馈的形式进一步促进肿瘤抗原的提呈及T淋巴细胞的激活。伴随对肿瘤免疫逃逸机制研究的深入，人们发现恶性肿瘤可通过抑制T淋巴细胞表达CD40L，抑制第二信号通路的激活，导致抗原提呈细胞成熟受阻，抑制肿瘤特异性免疫反应的发生。因此，若能通过合成激动型CD40抗体，与树突状细胞表面的CD40结合，促进树突状细胞的成熟，从而激活肿瘤特异性的T淋巴细胞，或能达到肿瘤杀伤的效果。当前，已有多项研究证实了CD40激动型抗体可通过激活肿瘤免疫抑制肿瘤的增殖。CP-870，893抑制胰腺癌的进展已进入I 期临床试验。SGN-40是一种激动型抗CD40单克隆抗体，其在多种血液系统肿瘤及淋巴系统肿瘤的治疗中发挥了显著疗效。但在使用过程中也出现了一些问题，首先其面临了单克隆抗体药物共同存在的问题，即分子量大，组织穿透性差。同时免疫激活剂高血药浓度的维持会导致全身免疫功能的紊乱及细胞因子释放综合征（Cytokine Release Syndrome，CRS）的发生。

重组抗体技术的出现为抗体结构的改良带来了希望，人们可依照自身的需求对抗体的结构进行合理改造，单链抗体是当前重组抗体中研究热门的小分子抗体之一，它是使用一段柔性多肽将抗体中的VH及VL合理的连接而成，其在保证了抗体亲和能力的前提下，减小了其分子量，且去除了抗体的Fc段，降低了抗体药物的免疫毒性，目前，已有多种单链抗体用于临床恶性肿瘤的治疗。双特异性单链抗体是在单链抗体的基础上，使用柔性短肽将两种单链抗体的重链可变区及轻链可变区按照一定的特殊构象进行合理的拼接形成的一种新的抗体形式，Oberst构建的抗CD3-CEA的双抗MT111，在结肠癌的治疗中发挥了显著疗效，其可在招募淋巴细胞的同时，又发挥了针对CEA的靶向治疗效果。

伴随科学的发展，抗体的筛选技术也日趋成熟，传统的获取抗体的方法主要依赖杂交瘤的技术，但该技术工作量大，筛选效率低，获取的抗体的亲和力往往不尽人意。抗体库筛选技术是当前抗体筛选的重要技术之一，结合使用噬菌体展示技术，将构建抗体文库的克隆与噬菌体衣壳蛋白融合表达与噬菌体表面，并对其进行多轮的筛选，逐步提高克隆与抗原的亲和力。但受衣壳蛋白包装的影响，融合表达的蛋白分子量不能过大。因此，噬菌体展示技术更适合筛选获取小分子的单链抗体，由此筛选获取的单链抗体亲和力更为成熟。已有多项研究使用噬菌体展示技术筛选获取了高亲和力的单链抗体。因此，噬菌体展示技术或可为获取高亲和力双特异性单链抗体奠定基础。

发明内容

本发明就是为了解决单独靶向结合HER2的单克隆抗体类药物组织穿透性差，较高血药浓度的维持加重肝肾代谢负担，且长期使用导致耐药；而单独靶向结合CD40的激动型抗体组织穿透性差、免疫激活剂高血药浓度的维持会导致全身免疫功能紊乱及细胞因子释放综合征的发生的问题，所提出的一种抗CD40-HER2双特异性单链抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种抗CD40-HER2双特异性单链抗体，所述双特异性单链抗体核酸序列如SEQ IDNO：1 所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2 所示。

所述双特异性单链抗体核酸序列是由CD40 ScFv的VH及VL片段与HER2 ScFv的VH及VL片段通过Linker拼接而成。

所述双特异性单链抗体核酸序列依次将CD40 ScFv的VH片段、HER2 ScFv的VL片段，HER2 ScFv的VH片段，CD40 ScFv的VL片段进行拼接。

一种上述的抗CD40-HER2双特异性单链抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明获得了如下有益效果：

本发明的双特异性单链抗体同时具有抗CD40及HER2两种抗性，且单链抗体亲和力高，其将肿瘤免疫治疗及分子靶向治疗结合在一起的同时，还使CD40相关的免疫激活具有了一定的肿瘤组织聚集性，从而降低了全身免疫激活的毒性，发挥了更好的抗肿瘤效果。本发明的双特异性单链抗体为进一步探索肿瘤免疫逃逸机制奠定了基础，为肿瘤的抗体治疗开辟了新的思路。

附图说明

图1是本发明CD40×HER2 ScDb表达分析示意图；

图2是本发明CD40×HER2 ScDb蛋白三级结构预测示意图；

图3是本发明蛋白电泳检测不同浓度咪唑洗脱纯化蛋白图；

图4是本发明流式细胞术检测不同刺激下小鼠树突状细胞表面标志物的表达图；

图5是本发明不同刺激下树突状细胞IL-12分泌水平差异图；

图6是本发明不同组T淋巴细胞IFN-γ分泌水平差异图；

图7是本发明不同组T淋巴细胞对4T1细胞的杀伤率的比较图；

图8是本发明不同干预对4T1小鼠模型瘤体体积变化影响图；

图9是本发明不同干预对4T1肿瘤组织中IFN-γ表达水平影响图；

图10是本发明不同干预对4T1肿瘤组织IL-12表达影响图；

图11是本发明不同干预组4T1肿瘤组织淋巴细胞浸润及Cleaved-Caspase-3表达差异图 (IHC 200×)；

图12是本发明细胞免疫荧光检测CD40×HER2 ScDb的HER2靶向性图(200×)；

图13是本发明不同干预对T6-17细胞增殖及细胞形态的影响图(200×)；

图14是本发明不同干预对T6-17增殖抑制率的比较图；

图15是本发明Western Blot检测不同干预对T6-17细胞Akt及ERK磷酸化水平的影响图；

图16是本发明不同干预对T6-17细胞Akt、ERK表达及磷酸化的影响图；

图17是本发明T6-17肿瘤模型肿瘤生长曲线图；

图18是本发明HE染色观察不同组T6-17肿瘤细胞的形态差异图(400×)。

具体实施方式

为了进一步阐释本发明的技术方案及其所实现的技术效果，下面将结合附图及实施例对本发明进行进一步的说明。

1.抗CD40高亲和力单链抗体克隆的筛选

1.1免疫大鼠

按照本实验中设计的免疫程序，沿大鼠背部脊柱两侧消毒皮肤后，皮下多点注射已乳化好的小鼠重组CD40蛋白（购自北京义翘神州生物科技，50324-M03H-50），可见皮下形成小皮丘，并且皮下注射后液体不外溢，待施行下一次免疫程序前观察，大鼠背部皮肤已平坦，未见皮丘，可见背部皮肤稍有破损结痂，证明抗原吸收良好。

1.2免疫大鼠脾脏总RNA的提取及cDNA的合成

使用天根提取试剂盒提取大鼠脾脏总RNA，将提取产物进行电泳，电泳结果显示两条清晰、明亮的28S、18S。28S条带亮度大于18S，5S条带比较模糊，隐约可见。紫外微量分光光度计检测RNA浓度990.7ng/ul，A260/A280=2.06，实验结果满足实验要求。

1.3 PCR扩增抗体VH、VL及Linker基因

以获得的cDNA为模板，进行PCR扩增出VH及VL基因片段，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分别于340bp及320bp左右见一条带，碱基大小与预期结果一致。Linker序列由奥科生物合成，并以其为模板进行PCR扩增。因在(G1y4Ser)3的基础上两端添加了24bp重叠序列，使Linker长度约为90bp，PCR扩增产物进行电泳，100bp左右可见一条带。

1.4重叠PCR拼接ScFv序列

采用两步法重叠PCR拼接ScFv序列，第一步VH片段与Linker拼接；第二步将VH+Linker与VL片段连接。VH自身长度约340bp，减去与Linker存在24bp的重叠序列，拼接片段长度约420bp。回收第一步电泳产物，继续与VL片段进行拼接，获取ScFv序列碱基大小约为740bp左右，电泳结果表明ScFv构建成功。

1.5重组质粒pCANTAB5E-ScFv构建及双酶切鉴定

将扩增的pCANTAB5E质粒与ScFv同时使用SfiI和NotI双酶切，T4连接酶连接双酶切后的回收产物，构建重组质粒pCANTAB5E-ScFv，并将重组质粒转化TG1感受态细胞，涂板过夜培养挑取阳性菌株扩增后提取质粒并行SfiI和NotI双酶切鉴定，重组质粒双酶切后于4500bp、740bp左右各见一条带。双酶切鉴定及测序结果充分表明重组质粒构建成功。

1.6噬菌体文库库容及多样性评价

本实验构建的ScFv测序序列通过与IMGT编码系统中的大鼠抗体可变区结构及特征对比分析，结果表明通过PCR合成的ScFv序列与大鼠抗体的VH、VL基因结构比对度良好。表明PCR拼接合成的ScFv构建成功。将重组噬菌体侵染TG1感受态细胞，检测大鼠抗小鼠CD40-ScFv噬菌体文库容量约为:1.2×10⁷pfu/mL。噬菌体滴度10¹²。

从LB-A平板中随机挑取18个阳性单克隆，送测序。测序结果显示其中13个阳性克隆有基因插入，插入的ScFv上下游处均可见SfiI和NotI酶切位点序列，ScFv插入位置及DNA序列大小正确，重组率72.2%。

为评估文库多样性又随机抽取其中13组构建，结果表明，也将此13个阳性克隆测序结果在IMGT编码系统中进行比对分析可知，相应的VH及VL均与大鼠抗体的VH、VL基因结构对比度良好。将13组序列进行BLAST比对，互相比对结果未见重复序列，表明构建文库多样性良好。

1.7噬菌体展示各轮筛选筛选压力的测定

对于每轮筛选前后的噬菌体滴度采用梯度稀释，顶层胶培养，噬斑计数的方法对每轮投入及产出的噬菌体的量进行计算。通过该过程，文库中的克隆总体亲和力逐渐提高，持续增加的洗脱量证实了噬菌体展示对于克隆的富集效果（见表1）。

1.8噬菌体展示各轮筛选克隆随机测序及相互比对

实验中分别对原始文库，第二轮筛选及第三轮筛选产出的噬菌体进行了测序鉴定，测序结果表明，所有的克隆均有阳性插入，对多基因比对的相似度分组汇总后发现，伴随筛选的进行，文库内克隆的序列相似度逐渐提高。原始文库序列匹配度分布的峰值在81-85%的区间，占测序结果总数的37.2%。第二轮筛选后序列匹配度分布的峰值在86%-90%的区间，占测序结果总数的58.2%。第三轮筛选后序列匹配度分布的峰值在91%-95%的区间，同时出现了序列完全匹配的克隆，其中的8#、10#、13#序列匹配度为100%，6#与9#、12#与14#、15#与20#序列的匹配度也为100%，100%匹配度占测序结果的3.2%，反映了噬菌体展示的筛选对文库克隆序列的富集作用（见表2）。

1.9潜在阳性克隆的选择

对第三轮筛选后克隆相互比对结果分析发现，其中克隆匹配度在90%以上的结果特别聚集于某些克隆之间，其中包括了相互比对匹配度100%的克隆。该结果反映了噬菌体展示对文库的富集趋势，同时高相似度序列的聚集反映了潜在阳性克隆的存在。因此，拟将第三轮筛选后挑取的4#、6#、8#、9#、10#、12#、13#、14#、15#、16#、17#、19#、20#克隆作为潜在阳性克隆，去除序列完全相同的克隆，拟对4#、6#、8#、12#、15 #、16#、17#、19 #克隆继续进行筛选。

1.10 噬菌体 ELISA比较各克隆亲和力差异

对于潜在阳性克隆进行噬菌体 ELISA比较不同克隆与CD40抗原的亲和力差异发现，在蛋白本底包被浓度为5μg/mL，5%BSA 1:1稀释文库，相同洗板强度的前提下，8#克隆实验孔450nmOD最大，反映其与CD40抗原的亲和力最佳。（表3）。

1.11第1次梯度噬菌体 ELISA比较各克隆亲和力差异

首先以5μg/mL、2.5μg/mL、1.25μg/mL、0.625μg/mL、0.3125μg/mL的蛋白包被浓度梯度进行实验，结果表明：8#克隆在不同蛋白包被浓度梯度下与CD40抗原的亲和力最佳，但伴随蛋白包被浓度梯度下降变化并不显著，推测可能由于上样噬菌体滴度过高以及包被蛋白梯度设定过小所致。同时为证明阳性克隆与CD40亲和的特异性，于每一个克隆均另设BSA包被孔，并比较各克隆实验孔与BSA孔OD值得比值，结果表明，8#克隆与CD40亲和力明显强于BSA，且在蛋白包被浓度在0.625μg/mL浓度以上时，亲和力差值均在3倍以上（见表4）。

1.12第2次梯度噬菌体 ELISA比较各克隆亲和力差异

此次试验扩大了CD40蛋白包被的浓度梯度，分别为2.5μg/mL、0.5μg/mL、0.1μg/mL、0.02μg/mL。并提高了上样噬菌体颗粒的稀释比例，使用5%BSA 1:3稀释后上样。结果表明，所有克隆与CD40抗原的亲和情况伴随包被蛋白浓度梯度的下降，呈线性变化趋势。同样将不同浓度的OD值与BSA亲和的OD值的比值进行分析表明，8#克隆与CD40的亲和力显著强于与BSA的亲和，且在不同本底蛋白浓度时，其比值均高于其他克隆，证实8#克隆在各浓度梯度与本底蛋白的亲和力均强于其余克隆，拟将8#克隆作为最终的阳性克隆进行下一步实验（见表5）。

1.13 8#阳性克隆测序结果及分析

对最终筛选获取的8#克隆测序结果进行分析，序列全长714bp，其中包含了重链可变区（345bp），轻链可变区（324bp）及 (Gly4Ser)3 45bp。在序列的上游及下游可见基因插入的酶切位点Sfi I及Not I及连接重链可变区（VH）及轻链可变区(VL)的Linker，对其间的重链可变区及轻链可变区序列使用IMGT抗体结构在线比对

表明：重链可变区序列与“Ratnor IGHV5-29*01 F”匹配度为95.2%，轻链可变区序列与“Ratnor IGKV10S12*01 F”匹配度为98.57%，证实8#克隆的重链可变区及轻链可变区序列均与大鼠来源的IgG VH及VL有高度同源性。

8#克隆测序结果如下：

注：下划线+斜体：Sfi>及Not>酶切位点；灰背景色：8^#克隆的重链可变区及轻链可变区；下划线：(Gly₄Ser)₃>

2抗CD40×HER2双特异性单链抗体的构建及蛋白表达

2.1 PCR扩增8#克隆CD40 ScFv的VH及VL片段

以筛选出的8#克隆噬菌粒为模板，进行PCR扩增，分别获取CD40 VH及VL片段，VH的扩增产物的大小应在VH片段的基础上，添加酶切位点Nde I 及下游的拼接粘性末端，理论长度为366bp。琼脂糖电泳结果可于250-500bp间见一清晰单一条带，其大小与预期相符，证实VH片段扩增成功。同样方法进行CD40 VL片段的扩增，扩增产物的大小应在片段的基础上，添加了酶切位点SalI及上游的拼接粘性末端，理论长度为345bp，琼脂糖电泳结果可250-500bp间见一清晰单一条带，其大小与理论相符，证实VL片段扩增成功。

2.2 PCR扩增 HER2 ScFv序列全长

以插入HER2 ScFv序列全长的pUC57质粒为模板，进行PCR扩增获取HER2 ScFv序列全长，琼脂糖电泳可于750bp左右见一明亮单一条带，其大小与测序结果序列长度765bp相符，证实HER2 ScFv序列扩增成功。

HER2 ScFv基因序列

GCAGATATTCAGATGACTCAGAGCCCTTCTTCACTGTCAGCCAGCGTTGGAGACCGTGTTACAATCACTTGCCGCGCCAGCCAGGACGTGAACACCGCCGTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCAGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATTCAGCGAGCTTTCTGTACAGTGGCGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCTCGTAGTGGCACAGATTTTACACTGACTATCAGCTCCCTGCAGCCTGAAGACTTCGCAACCTATTACTGCCAGCAGCACTACACCACACCGCCCACATTTGGTCAGGGGACTAAGGTTGAGCTGAAACGGGCTACTCCGTCCCACAACTCTCATCAGGTCCCAAGCGCCGGCGGTCCAACCGCAAATTCCGGTGAAGTTAAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGTGGGAGCCTGCGTCTGTCCTGTGCCACCTCTGGCTTCAACATTAAGGATACATATATCCATTGGGTCCGCCAGGCACCAGGAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCTCGTATCTATCCTACCAATGGTTATACACGGTACGCCGATAGCGTGAAGGGGCGCTTCACCATCAGTGCAGACACTTCAAAAAACACCGCTTATCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGACACCGCTGTTTATTACTGCAGCCGGTGGGGAGGCGATGGCTTTTATGCGATGGATTACTGGGGTCAGGGGACTACCGTGACCGTTTCTAGTGGTGGGGGAGGCTCC

2.3重叠PCR拼接CD40×HER2 ScDb

依照OE-PCR拼接获取CD40×HER2 ScDb的实验设计，首先使用两步法重叠PCR拼接HER2ScFv+CD40VL，其理论长度为HER2 ScFv(765bp) +Gly4Ser Linker(15bp) + CD40 VL(324bp)=1104bp，琼脂糖电泳结果可于1000bp左右见一单一清晰条带，其大小与理论大小相符，证实序列拼接成功。

在以上基础上，继续进行CD40 VH与HER2 ScFv+CD40 VL的拼接，其理论长度为CD40 VH (345bp)+ Gly4Ser Linker (15bp) +HER-2 ScFv+CD40 VL (1104bp)=1464bp，琼脂糖电泳可于1000-2000bp之间见一单一清晰条带，其大小与CD40×HER2 ScDb理论大小相符，证实PCR扩增成功。

构象选择依据：特异性单链抗体的构象有多种，按照两种抗体V区的连接顺序及连接方式不同，可分为：Diabody、Single chain Diabody、Tandem ScFv、Tandem Diabody以及Dual-affinity retargeting molecules(DARTs)五种。 Tandem ScFv是一条单链蛋白，载体构建及蛋白的诱导表达过程简易，易于获取，且V区间的Linker长度充分，两种抗体的正确折叠不会相互干扰。但也有研究表明，Tandem ScFv因其连接Linker过长，往往会导致两种抗体间不可控的重链与轻链的交叉组合，对其功能的发挥产生影响。为弥补其缺点，Diabody及DART的设计将两种抗体的重链及轻链可变区交叉相连，同时缩短其间的Linker长度，使二者因距离过近而无法配对，迫使同种抗体间的重链及轻链可变区正确组合，但该构象是一种完全不同的双链结构的组合，对于蛋白表达过程中结构的修饰及正确折叠要求较高，且原核表达载体的构建及诱导表达较为复杂，因此限制了其广泛使用。Single chainDiabody（ScDb）属于Diabody的另一种改良，其使用两种长度的Linker将两种抗体的重链及轻链可变区相连，在将双抗体作为一条单链抗体表达的同时，又使得两种抗体的重链及轻链可变区不至于交叉组合，Tandem diabody即为ScDb自体的二聚化形式，在ScDb发挥功能时其二聚化形式也是广泛存在的，已有多项研究基于此构象进行双抗的构建，且在肿瘤的治疗中发挥显著疗效。本发明中同样选取了ScDb的构象进行双抗的构建，其中，HER2 ScFv完整序列为本实验室保存，其构象为VL-Linker-VH，其中Linker长度为45bp，这与多数的ScDb拼接的设计一致。其上下游分别与CD40的VH及VL拼接，其间的linker长度均为15bp的柔性短肽Gly4Ser，这种设计在较多ScDb设计中同样被广泛使用。双抗片段的拼接常用的方法有通过引入酶切位点形成特异性粘性末端进行拼接，或通过重叠PCR的方法进行拼接，在不同的研究中，两种方法均有使用，本研究首先使用酶切位点连接法进行实验，对于抗CD40-HER2双特异性单链抗体的序列，酶切位点的选择较为复杂，且共同的反应条件不易控制，实验结果不甚理想，因此更换重叠PCR的方法进行序列的拼接，阳性克隆测序结果证实序列拼接顺序正确，无密码子点突变及移码突变发生，证实CD40×HER2 ScDb拼接成功，为下一步CD40×HER2 ScDb蛋白的获取奠定了基础。

2.4 CD40×HER2 ScDb原核表达载体的构建及鉴定

选用pET-28a为原核表达载体进行蛋白的表达，对载体及CD40×HER2 ScDb片段均进行双酶切处理后，T4 DNA连接酶进行质粒重组，对重组的质粒行琼脂糖电泳示可于3500bp~5500bp见一条带其大小略大于空pET-28a质粒，证实重组成功，并进一步对重组的质粒做双酶切鉴定，结果表明，重组质粒经Nde I 及Sal I双酶切后，分别可于1000bp~2000bp之间及5500bp左右见一单一条带，其分别与双特异性单链抗体片段（1464bp）及线性pET-28a质粒大小（5369bp）相符，证实CD40×HER2 ScDb基因插入位置正确，重组质粒pET-28a-CD40×HER2 ScDb构建成功。

2.5 CD40×HER2 ScDb基因测序及序列分析

对构建成功的pET-28a-CD40×HER2 ScDb重组质粒进行测序鉴定，有效序列全长1464bp，可于序列上下游分别找到用于原核表达载体构建插入的酶切位点NdeI 、Sal I，以及位于CD40VH与HER2 ScFv、CD40VL与HER2 ScFv之间的Linker，证实了基因序列插入顺序与预期相符。

2.6 CD40×HER2 ScDb基因序列翻译结果预测

使用DNASTAR软件对CD40×HER2 ScDb序列进行翻译结果的预测，包括两侧的酶切位点，基因序列全长1476bp，蛋白翻译后氨基酸个数为492个，其中插入的连接性LinkerGly4Ser翻译正确，表明CD40×HER2 ScDb序列阅读框完整，无密码子移码及缺失性突变，无终止密码子。

CD40×HER2 ScDb核酸序列如下：

CATATGGTCCAGCTGCAGCAGTCTGGTGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTAAAACTCCCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAACGAAGGGGCTGGAGTGGGTCGCAAGCATTAGTTATGATGGTAGTAGCACTTACTATCGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGATAATGCAAAAAGCACCCTATACCTGCAAATGGACAGTCTGAGGTCTGAGGACACGGCCACTTATTACTGCGGAAGACACAGTAGCTACTTTGATTACTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGCGGAGGCAGCGCAGATATTCAGATGACTCAGAGCCCTTCTTCACTGTCAGCCAGCGTTGGAGACCGTGTTACAATCACTTGCCGCGCCAGCCAGGACGTGAACACCGCCGTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCAGGCAAGGCCCCTAAACTGCTGATCTATTCAGCGAGCTTTCTGTACAGTGGCGTGCCATCACGCTTCTCCGGATCTCGTAGTGGCACAGATTTTACACTGACTATCAGCTCCCTGCAGCCTGAAGACTTCGCAACCTATTACTGCCAGCAGCACTACACCACACCGCCCACATTTGGTCAGGGGACTAAGGTTGAGCTGAAACGGGCTACTCCGTCCCACAACTCTCATCAGGTCCCAAGCGCCGGCGGTCCAACCGCAAATTCCGGTGAAGTTAAGCTGGTCGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTGCAGCCCGGTGGGAGCCTGCGTCTGTCCTGTGCCACCTCTGGCTTCAACATTAAGGATACATATATCCATTGGGTCCGCCAGGCACCAGGAAAAGGCCTGGAATGGGTGGCTCGTATCTATCCTACCAATGGTTATACACGGTACGCCGATAGCGTGAAGGGGCGCTTCACCATCAGTGCAGACACTTCAAAAAACACCGCTTATCTGCAGATGAATAGTCTGCGTGCAGAGGACACCGCTGTTTATTACTGCAGCCGGTGGGGAGGCGATGGCTTTTATGCGATGGATTACTGGGGTCAGGGGACTACCGTGACCGTTTCTAGTGGTGGGGGAGGCTCCGGCGGTGGTGGGTCTGACATTGAGCTCACCCAGTCTCCATCCACATTGCCTGCATCTCTGGGAGAGAGAGTCACCATCAGTTGCAGAGCAAGTCAGAGTATTAGCAATAGTTTAAACTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACGCCTGATCTACTCTACATCCACTTTAGAATCTGGTGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTATTCTCTCTCCATCAGCAGTCTTGAGTCTGAAGATTTTGCAATGTATTACTGTCTACAGTATGCTACTTATCCTCACACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGGGTCGAC

CD40×HER2 ScDb蛋白表达的氨基酸序列如下：

HMVQLQQSGGGLVQPGRSLKLPCAASGFTFSDYYMAWVRQAPTKGLEWVASISYDGSSTYYRDSVKGRFTISRDNAKSTLYLQMDSLRSEDTATYYCGRHSSYFDYWGQGTTVTVSSGGGGSADIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVELKRATPSHNSHQVPSAGGPTANSGEVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCATSGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSDIELTQSPSTLPASLGERVTISCRASQSISNSLNWYQQKPDGTVKRLIYSTSTLESGVPSRFSGSGSGTDYSLSISSLESEDFAMYYCLQYATYPHTFGSGTKLEIKRVD

2.7 CD40×HER2 ScDb蛋白理化性质分子结构预测

依据pET28a载体蛋白表达区域的情况分析CD40×HER2 ScDb诱导表达的结果。经IPTG诱导后，核糖体结合于307位的核糖体结合位点（ribosome-binding site RBS），在其后的第一个起始密码子ATG（294位）开始翻译，翻译长度为19个氨基酸时，到达酶切位点Nde I（238位），翻译插入的双特异性单链抗体492个氨基酸，至酶切位点Sal I（179位），继续延伸13个氨基酸到达终止密码子TGA（137位）翻译结束。综上分析，CD40×HER2 ScDb经IPTG诱导后实际蛋白表达的长度为524个氨基酸，其中包括了上游及下游用于蛋白标记的His-tag，用于蛋白的后续纯化（参见图1）。

使用ExPASy（http://web.expasy.org/protparam/）在线检测评估蛋白的理化性质，蛋白的分子量为56.548Kda，平均疏水指数（Grand average of hydropathicity,GRAVY）为-0.458，表明CD40×HER2 ScDb蛋白为亲水性蛋白，这与DNASTAR-protean对蛋白亲水区域的预测结果相符。等电点（point of isoelectric , PI）为8.58。

使用DNASTAR-protean对表达蛋白的二级结构进行预测。结果表明，CD40×HER2ScDb蛋白含有11个α螺旋，24个β折叠，呈区域性间隔分布于整个肽段，且在α螺旋及β折叠单元之间存在不同大小的β转角及不规则卷曲。对其亲疏水性的分析表明，亲水性区域在蛋白中的分布区域较多。

使用I-TASSER(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER)对蛋白的三级结构进行预测，其依据CD40×HER2 ScDb的一级结构，共给出了五种模拟预测结果，通过比较不同模型的C-score，选择其中模拟度最佳的model1作为最终预测的结果，结构如图2所示，建模的C-score值为-1.58，位于置信区间内，TM-score的估计值为0.52±0.15。同时由其三级结构图中可见大量的β折叠、β转角及无规则卷曲，相互折叠形成了多个沟槽的结构，这与二级结构的预测基本相符。

2.8 CD40×HER2 ScDb蛋白诱导表达及纯化

使用不同浓度的IPTG进行蛋白的诱导表达预实验，将各组诱导表达后的菌体裂解沉淀及上清同时上样进行SDS-PAGE变性电泳，结果表明，0.5mmol/L IPTG蛋白诱导可达最佳诱导效果，且蛋白的表达多以包涵体的形式表达，应先使用尿素变性溶解包涵体，后通过梯度降低尿素浓度缓慢复性。

2.9 Western Blot检测目的蛋白His-tag表达

对诱导表达后的菌体蛋白行Western Blot检测其中携带His-tag蛋白的表达，因His-tag仅在双特异性单链抗体蛋白中表达，故可由此明确目的蛋白表达的确切性。经蛋白电泳，半干法转膜，在Marker指示的25Kd-70Kd之间切膜并进行一抗及二抗的孵育。曝光结果标明，可于PVDF膜近55Kd端见一清晰单一条带，这与CD40×HER2 ScDb蛋白的预期大小相符，由此证实了IPTG诱导CD40×HER2 ScDb蛋白表达的确切性。

2.10 CD40×HER2 ScDb Ni-NTA琼脂糖蛋白纯化

使用Ni-NTA琼脂糖对带有His-tag标记的目的蛋白进行纯化，设立50、100、200 mmol/L的咪唑洗脱浓度，并进行SDS-PAGE变性电泳，结果表明（参见图3，其中1,2,3泳道分别为50、100、200 mmol/L的咪唑洗脱后蛋白电泳结果），经Ni-NTA琼脂糖纯化洗脱后的蛋白杂带明显减少，且在55Kd位置有一明显条带，纯化蛋白大小与目的蛋白分子量相符。同时，100mmol/L咪唑可获得最佳的洗脱效果。

3抗CD40×HER2双特异性单链抗体免疫激活作用

3.1流式细胞术检测不同干预组小鼠DC细胞表面标志物表达水平

流式细胞术检测结果表明，Ag+CD40×HER2 ScDb组：CD80 93.5%±3.1%、CD86 86.0%±3.2%、MHC-II 92.3%±2.8%，其表面标志物的表达明显高于，NS组（CD80 31.54%±2.6%、CD86 30.04%±4.1% 、MHC-II 40.10%±3.6%）及Ag组（CD80 62.79%±3.0%、CD86 49.30%±5.6%、MHC-II 88.4%±4.1%），二者差异具有统计学意义（P＜0.05）。但与Ag+TNF-α组（CD8094.76%±2.6%、CD86 87.0%±3.3%、MHC-II 93.5%±4.2%）相比，各指标的表达水平无统计学差异（P＞0.05）（见图4及表6）。

3.2 ELISA检测不同组小鼠DC细胞上清IL-12细胞因子水平

为检测不同干预对DC成熟促进作用，ELISA检测细胞上清中IL-12的表达水平。Ag+CD40×HER2 ScDb组，DC的IL-12的表达水平明显上调，与Ag组及NS组相比，差异有统计学意义（P＜0.05），与阳性对照组Ag+TNF-α组相比，IL-12的表达水平并无显著性差异（P＞0.05）。反映了双特异性单链抗体可促进树突状细胞的成熟，同时刺激IL-12的分泌（参见图5及表7）。

3.3 ELISA检测不同组T细胞共培养后IFN-γ表达水平的差异

为检测不同组DC对T淋巴细胞的激活功能，对于混合培养后的T淋巴细胞培养上清进行IFN-γ细胞因子表达水平的检测。Ag+CD40×HER2 ScDb组的DC可显著激活小鼠的CD3+ T淋巴细胞，并上调其IFN-γ细胞因子的表达，其细胞培养上清中IFN-γ的浓度为(549.96±27.10)pg/mL，与NS组及Ag组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与Ag+TNF-α组(575.53±41.98) pg/mL相比，IFN-γ的表达水平略低，但无统计学差异（P＞0.05）（参见图6及表8）。

3.4 肿瘤特异性T淋巴细胞对4T1肿瘤细胞的杀伤

分别回收经不同刺激激活的T淋巴细胞，与4T1肿瘤细胞共培养，CCK8检测不同组的T淋巴对肿瘤细胞的杀伤作用。Ag+CD40×HER2 ScDb组的杀伤率为（75.65±2.53）%，明显高于Ag组，且差异具有统计学意义（P＜0.05），与Ag+TNF-α相比，差异无统计学意义（参见图7及表9）（P＞0.05）。

3.5 不同组4T1小鼠肿瘤模型肿瘤生长曲线及比较

小鼠皮下种瘤后第5天，所有模型均稳定成瘤，给予第1次治疗，同时测量各组肿瘤体积大小，结果表明，各实验组初始肿瘤大小类似，差异无统计学意义（P＞0.05）。后续每3日治疗一次，同时记录肿瘤体积变化，在肿瘤第23天完成第7次治疗后3天，进行最后一次肿瘤大小测量并处死模型动物。结果表明，与NS组相比，CD40×HER2 ScDb1组（750μg/kg）、CD40×HER2 ScDb2组（1.5mg/kg）、及CD40mAb（5mg/kg）组均可减缓肿瘤的增长。且在第4次治疗（Day14）前，各组肿瘤大小无统计学差异。由第4次治疗开始，CD40×HER2 ScDb1组及CD40×HER2 ScDb2组在抑制肿瘤生长上出现了显著性差异，但CD40×HER2 ScDb2组与CD40mAb组相比，治疗效果仍无统计学差异（P＞0.05）。由此得出，CD40×HER2 ScDb在1.5mg/kg的用量下可达到CD40 mAb类似的抑瘤效果（参见图8及表10）。

3.6 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IFN-γ细胞因子的表达水平

ELISA法检测肿瘤组织单细胞悬液上清中IFN-γ的水平，结果表明，CD40结果表明，胞悬液上清2组肿瘤组织内IFN-γ内的浓度为 273.44±44.60pg/mL，与生理盐水组及HER2ScFv组以及CD40×HER2 ScDb1组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与CD40 mAb组相比，无统计学差异（P＞0.05）（参见图9及表11）。

3.7 ELISA检测不同干预小鼠肿瘤组织中IL-12(p70)细胞因子的表达水平

另取部分肿瘤组织单细胞悬液上清，ELISA检测其中IL-12(p70)的表达水平，并比较组间差异，结果表明：CD40×HER2 ScDb2组肿瘤组织内IL-12(p70)浓度为：448.85±51.10pg/mL，与NS组、HER-2ScFv组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与CD40 mAb组及CD40×HER2 ScDb1组相比，差异不具有统计学意义（P＞0.05），但与CD40 mAb相比，CD40×HER2ScDb1组的IL-12水平相对较低，且差异具有统计学意义（P=0.046）。以上结果表明，以1.5mg/kg的CD40×HER2 ScDb剂量可获得与CD40 mAb（5mg/kg）类似的免疫激活效果（参见图10及表12）。

3.8 HE染色检测不同组肿瘤组织中淋巴细胞浸润

对不同干预组的肿瘤组织行HE染色，镜下观察，可见4T1肿瘤细胞形态不规则，细胞体积相对较大，细胞核较大，部分细胞可见明显核仁，细胞排列紧密，形态完整。NS组及HER2ScFv组细胞形态良好，未见明显淋巴细胞浸润。CD40 ScFv组、CD40×HER2 ScDb组及CD40mAb组可见明显淋巴细胞浸润，淋巴细胞在镜下呈规则圆形，数量较多且聚集，细胞核呈规则圆形，小而深染。其周围的部分毛细血管中可见核染的单核细胞或淋巴细胞。相应区域的肿瘤细胞排列疏松，部分区域的肿瘤细胞形态不完整，甚可见无核的细胞坏死区域，证实双特异性单链抗体可通过激活淋巴细胞，并将其巢集于肿瘤组织内，杀伤肿瘤细胞（参见图11）。

3.9 IHC检测肿瘤细胞内Cleaved-caspase-3的表达水平

对肿瘤细胞中Cleaved-Caspase-3的表达行免疫组化染色，结果表明，CD40×HER2ScDb组、CD40 mAb及CD40 ScFv组的Cleaved-Caspase-3表达明显上调，其表达定位主要位于胞质，但也有些Caspase-3激活后可发生核转位，因此在某些细胞的胞核也有染色。HER2ScFv组及NS组4T1细胞中Cleaved-Caspase-3的表达均不显著。以上表明双特异性单链抗体可在肿瘤组织中激活肿瘤特异性效应T淋巴细胞，促进颗粒酶的分泌，从而上调肿瘤细胞内的Cleaved-Caspase-3的表达，诱导肿瘤细胞凋亡（参见图11）。

4 抗CD40×HER2双特异性单链抗体HER2靶向功能验证

4.1细胞免疫荧光检测CD40×HER2 ScDb与HER2的靶向性

分别使用量子点标记的曲妥珠单抗、HER2 ScFv、CD40 ScFv及CD40×HER2 ScDb进行T6-17细胞的免疫荧光实验，结果表明，经标记的曲妥珠单抗可与T6-17细胞表面的HER2结合，在蓝光通道的激发下呈红色。同时双特异性单链抗体及HER2 ScFv也可沿T6-17细胞膜分布。CD40 ScFv对T6-17细胞的表面分子不具有亲和力。以上结果证实，双特异性单链抗体可通过自身HER2抗体的部分与T6-17细胞表面的HER2结合，发挥HER2靶向性的相关作用（参见图12，A, 阴性对照组；B, CD40 ScFv组；C, HER2 ScFv组；D, CD40×HER2 ScDb组； E,曲妥珠单抗组）。

4.2不同干预对T6-17细胞增殖及形态的影响

予对数期生长的T6-17细胞不同干预，包括NS组、CD40 ScFv组（2.5μg/mL）、HER2 ScFv组（2.5μg/mL）、CD40×HER2 ScDb1组（2.5μg/mL）、CD40×HER2 ScDb2组（5μg/mL）以及曲妥珠单抗组（15μg/mL），镜下观察各组细胞形态，可见NS组T6-17细胞呈正常形态，细胞呈梭形或多边形，多呈贴壁生长，排列紧密。CD40×HER2 ScDb组伴随治疗剂量的增加，细胞密度逐渐降低，且细胞失去正常形态，部分细胞体积变大，核浆比失调（参见图13，A. NS组；B.CD40 ScFv组（2.5μg/mL）；C. HER2 ScFv组（2.5μg/mL）；D. CD40×HER2 ScDb1组（2.5μg/mL）；E. CD40×HER2 ScDb2 组（5μg/mL）；F.曲妥珠单抗组（15μg/mL））。

4.3 CCK8检测不同干预对T6-17细胞增殖的抑制率

使用CCK8试剂染色活细胞，检测不同干预对T6-17细胞增殖的抑制，结果表明，CD40×HER2 ScDb2组（5μg/mL）的抑瘤率为：(86.89±6.35)%，与HER2 ScFv（2.5μg/mL）(80.18±1.97)%及曲妥珠单抗（15μg/mL）(85.56±1.73)%，相比，差异不具有统计学意义（P＞0.05）（参见图14及表13）。

4.4WB检测不同组肿瘤细胞内PI3K/Akt信号通路相关分子的磷酸化水平

Western Blot检测HER-2相关酪氨酸激酶信号通路分子ERK及Akt的表达及磷酸化水平。结果表明，CD40×HER2 ScDb、HER-2 ScFv及曲妥珠单抗均可抑制Akt及ERK的表达，且可抑制其相应的磷酸化过程，且与NS组相比，差异有统计学意义（参见图15和16，图15中A: NS组； B:CD40 ScFv组（2.5μg/mL）；C:CD40×HER2 ScDb1组（2.5μg/mL）；D:CD40×HER2 ScDb2组（5μg/mL）；E: HER-2 ScFv组（2.5μg/mL）；F: 曲妥珠单抗组（15μg/mL），图16中*：不同指标在各实验组中的表达差异有统计学意义；#：不同指标在HER2 ScFv组中的表达与CD40×HER2 ScDb2组两两比较，差异无统计学意义；&：不同指标在曲妥珠单抗组中的表达与CD40×HER2 ScDb2组两两比较，差异不具有统计学意义）。继续对各组间的差异进行两两比较表明，伴随CD40×HER2 ScDb药物浓度的提高，p-ERK、ERK、p-Akt、Akt分子的表达水平也在逐渐下降，与CD40×HER2 ScDb1组及CD40×HER2 ScDb2组相比，CD40×HER2 ScDb3组各分子的表达水平相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。但与HER-2 ScFv组及曲妥珠单抗组相比，各指标差异无统计学意义（P＞0.05）。

4.5CD40×HER2 ScDb 对裸鼠体内T6-17肿瘤增殖的影响

裸鼠皮下种瘤后第4天，所有模型均稳定成瘤，给予第一次治疗，同时测量各组肿瘤体积大小，结果表明，各实验组初始肿瘤大小类似，差异无统计学意义（P＞0.05）。后续每4日治疗一次，同时记录肿瘤体积变化，于种瘤后第16天给予最后一次治疗，并于4天后进行最后一次肿瘤大小的测量并处死模型小鼠。分析不同组肿瘤生长趋势结果表明，与NS相比，CD40×HER2 ScDb1组、CD40×HER2 ScDb2组、HER2 ScFv及曲妥珠单抗组均可减缓肿瘤体积的增加。同时，CD40×HER2 ScDb2组、HER2 ScFv组及曲妥珠单抗组发挥了类似的抑瘤作用，其差异无统计学意义（P＞0.05）（参见图17及表14）。

4.6HE染色检测不同干预对T6-17肿瘤细胞形态的影响

对各组肿瘤组织行病理切片，并进行HE染色，观察各组肿瘤细胞形态的差异，结果表明，NS组的T6-17细胞呈正常细胞状态，胞核完整，细胞连接紧密，部分细胞可见核仁，证实其增殖活跃。CD40 ScFv组多数肿瘤组织区域细胞形态完整，部分区域细胞失去正常形态，其间可见少量单核细胞及炎性细胞浸润。观察多个CD40×HER2 ScDb组的细胞视野，可见肿瘤组织内呈弥漫性坏死，多数区域的细胞已失去正常形态，核固缩现象明显，并可见散在的核碎片，甚至有些区域细胞仅可见细胞核轮廓，染色质不可及。HER2 ScFv组及曲妥珠单抗组的细胞呈类似的细胞形态（参见图18，A,NS组；B,CD40 ScFv组；C,HER-2 ScFv组；D,CD40×HER2 ScDb1组；E,CD40×HER2 ScDb2组；F,曲妥珠单抗组）。以上结果证实，双特异性单链抗体、HER2 ScFv及曲妥珠单抗均可显著抑制T6-17在小鼠体内的增殖。

序列表

<110> 天津医科大学总医院

<120> 抗CD40-HER2双特异性单链抗体及其在制备抗肿瘤药物中的应用

<130> 12

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1476

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> N_region

<222> (1)..(1476)

<400> 1

catatggtcc agctgcagca gtctggtgga ggcttagtgc agcctggaag gtccctaaaa 60

ctcccctgtg cagcctcagg attcactttc agtgactatt acatggcctg ggtccgccag 120

gctccaacga aggggctgga gtgggtcgca agcattagtt atgatggtag tagcacttac 180

tatcgagact ccgtgaaggg ccgattcact atctccagag ataatgcaaa aagcacccta 240

tacctgcaaa tggacagtct gaggtctgag gacacggcca cttattactg cggaagacac 300

agtagctact ttgattactg gggccaaggg accacggtca ccgtctcctc aggtggcgga 360

ggcagcgcag atattcagat gactcagagc ccttcttcac tgtcagccag cgttggagac 420

cgtgttacaa tcacttgccg cgccagccag gacgtgaaca ccgccgttgc gtggtatcag 480

cagaaaccag gcaaggcccc taaactgctg atctattcag cgagctttct gtacagtggc 540

gtgccatcac gcttctccgg atctcgtagt ggcacagatt ttacactgac tatcagctcc 600

ctgcagcctg aagacttcgc aacctattac tgccagcagc actacaccac accgcccaca 660

tttggtcagg ggactaaggt tgagctgaaa cgggctactc cgtcccacaa ctctcatcag 720

gtcccaagcg ccggcggtcc aaccgcaaat tccggtgaag ttaagctggt cgagtctggg 780

ggaggcctgg tgcagcccgg tgggagcctg cgtctgtcct gtgccacctc tggcttcaac 840

attaaggata catatatcca ttgggtccgc caggcaccag gaaaaggcct ggaatgggtg 900

gctcgtatct atcctaccaa tggttataca cggtacgccg atagcgtgaa ggggcgcttc 960

accatcagtg cagacacttc aaaaaacacc gcttatctgc agatgaatag tctgcgtgca 1020

gaggacaccg ctgtttatta ctgcagccgg tggggaggcg atggctttta tgcgatggat 1080

tactggggtc aggggactac cgtgaccgtt tctagtggtg ggggaggctc cggcggtggt 1140

gggtctgaca ttgagctcac ccagtctcca tccacattgc ctgcatctct gggagagaga 1200

gtcaccatca gttgcagagc aagtcagagt attagcaata gtttaaactg gtatcagcag 1260

aaaccagatg gaactgttaa acgcctgatc tactctacat ccactttaga atctggtgtc 1320

ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctggg acagattatt ctctctccat cagcagtctt 1380

gagtctgaag attttgcaat gtattactgt ctacagtatg ctacttatcc tcacacgttc 1440

ggttctggga ccaagctgga aataaaacgg gtcgac 1476

<210> 1

<211> 492

<212> PRT

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<220>

<221> VARSPLIC

<222> (1)..(492)

<400> 1

His Met Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

1 5 1015

Arg Ser Leu Lys Leu Pro Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp

202530

Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp

354045

Val Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser

505560

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Thr Leu

65707580

Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

859095

Cys Gly Arg His Ser Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Asp Ile Gln Met Thr

115 120 125

Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile

130 135 140

Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln

145 150 155 160

Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe

165 170 175

Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr

180 185 190

Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr

195 200 205

Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Lys Val Glu Leu Lys Arg Ala Thr Pro Ser His Asn Ser His Gln

225 230 235 240

Val Pro Ser Ala Gly Gly Pro Thr Ala Asn Ser Gly Glu Val Lys Leu

245 250 255

Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

260 265 270

Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp

275 280 285

Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr

290 295 300

Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

305 310 315 320

Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn

325 330 335

Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly

340 345 350

Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

355 360 365

Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

370 375 380

Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Pro Ala Ser Leu Gly Glu Arg

385 390 395 400

Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Ser Leu Asn

405 410 415

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Arg Leu Ile Tyr Ser

420 425 430

Thr Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly

435 440 445

Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Ser Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp

450 455 460

Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Thr Tyr Pro His Thr Phe

465 470 475 480

Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Val Asp

485 490

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