一种斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法

摘要

发明公开了一种斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法，包括以下步骤：提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎，再进行筛选，并在第一预定温度下用乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩后得到粗提物，富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，并将剩余部分进行过柱操作。本发明通过采用在线DPPH‑HPLC抗氧化活性成份筛选方法和采用高速逆流色谱仪的配合使用，使斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法非常便捷和迅速，从而缩短了斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离的时间，提高了生产效率，且节省了工艺中所使用有机溶剂的量，从而节省了生产成本。

说明书

技术领域

本发明涉及物质分离技术领域，具体为一种斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法。

背景技术

斑唇马先蒿，玄参科马先蒿属低矮草本，仅偶然升高，全身少毛。根束生，几不增粗，长者可达15厘米，下端渐细成须状。叶基出与茎出，常成密丛，有长柄，柄在基叶中较长，1-2厘米，在茎叶中较短，下半部常多少膜质膨大，时有疏长缘毛，叶片羽状浅裂至深裂，有时最下方之叶儿为全缘，披针形至狭长圆形，两面无毛，背面网脉显明而细，常有疏散的白色肤屑状物，裂片5-9对，有重锯齿，齿常有胼胝而反卷。花均腋生，有短梗；萼管状，长11-15毫米，前方开裂约至2/5，裂口多少膨膨，无毛，仅有极微的缘毛，脉约15条，其中仅2条较粗，然亦细弱，仅近管端处略有网结，齿2枚，有短柄，多少掌状开裂，裂片有少数之锯齿。

斑唇马先蒿中有六种抗氧化活性物质，传统的将这六种抗氧化活性物质分离的方法过程复杂，且需要的时间长，且在工艺过程中需要大量的有机溶剂，且分离成本高，效率低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法，以解决传统的将这六种抗氧化活性物质分离的方法过程复杂，且需要的时间长，且在工艺过程中需要大量的有机溶剂，且分离成本高，效率低的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法，包括以下步骤：

S1、提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎，再进行筛选，并在第一预定温度下用乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩后得到粗提物。

S2、富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，并将剩余部分进行过柱操作，用不同浓度的乙醇溶液对分离柱进行洗脱，得到洗脱液，将所述洗脱液减压浓缩，以得到含有目标成分的富集物。

S3、分离纯化：(1)、采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法从斑唇马先蒿正丁醇部分筛选出6个具有明显抗氧化活性的化合物。

其中，在线抗氧化筛选条件，采用Agilent 1100(250×4.6mmi.d.,5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇溶液，甲醇的质量浓度为45-50％，等度洗脱，梯度洗脱时间为0-45min，流动相流速为1ml/min，检测波长330，DPPH溶液浓度25μg/ml甲醇溶解，流动相流速为0.45ml/min，检测采用Agilent 1260，DPPH反应环长度15m，检测波长为517nm。

(2)、采用高速逆流色谱仪分离纯化出了这6种高纯度单体化合物。

其中，在通过高速逆流色谱仪进行分离时，在第二预定温度采用乙酸乙酯-正丁醇-水容积系统进行洗脱。

优选的，所述提取步骤中，筛选时，选用筛孔范围为20-100目筛，且斑唇马先蒿全草与乙醇溶液的料液比为1:3-1:30，且使用乙醇溶液中乙醇的质量浓度为0％-90％，且第一预定温度为20℃-80℃，且提取次数为1-5次，每次提取0.5h-3h。

优选的，所述富集步骤中，使用乙酸乙酯萃取的次数为3-10次，所述分离柱采用非极性大孔树脂柱，所述非极性大孔树脂柱包括D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、D3520型大孔树脂和X-5型大孔树脂。

优选的，所述富集步骤中，所述乙醇溶液的体积是所述分离柱中柱床的体积的5倍-20倍。

优选的，所述富集步骤中，所述乙醇溶液中乙醇的质量浓度为50％。

优选的，所述富集步骤中，在采用质量浓度为50％的乙醇溶液对分离柱进行洗脱前，依次用去离子水、质量浓度为30％的乙醇溶液和质量浓度为40％的乙醇溶液对分离柱进行洗脱，且所述去离子水的体积是所述分离柱中柱床的体积的5倍-20倍，所述质量浓度为30％的乙醇溶液的体积是所述分离柱中柱床的体积的5倍-20倍，所述质量浓度为40％的乙醇溶液的体积是所述分离柱中柱床的体积的5倍-20倍。

优选的，所述分离纯化步骤中，所述乙酸乙酯-正丁醇-水体系中氯仿、正丁醇、水的体积比为10-15：2-5：8-10，且第二预热温度为20℃-50℃，且高速逆流色谱仪的转速为500-1000r/min。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法和采用高速逆流色谱仪的配合使用，使斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法非常便捷和迅速，从而缩短了斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离的时间，提高了生产效率，且节省了工艺中所使用有机溶剂的量，从而节省了成产升本。

采用本发明方法获得的六种单体化合物boschnaloside、alyssonoside、leucosceptoside A、isoverbascoside、leucosceptoside B和verbascoside均采用¹H-NMR和¹C-NMR鉴定符合其化合物结构(参见图5)，同时，利用HPLC检测纯度均在95％以上(参见图4)。

附图说明

图1为本发明DPPH-HPLC在线设备流程图；

图2为本发明斑唇马先蒿粗提物HPLC色谱图和DPPH色谱图；

图3为本发明斑唇马先蒿粗提物HSCCC色谱分离图；

图4为本发明HPLC检测HSCCC分离得到的六个化合物纯度色谱图；

图5为本发明六种化合物的结构图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1-5，本发明提供一种技术方案：一种斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法，包括以下步骤：

S1、提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎，再进行筛选，并在第一预定温度下用乙醇溶液回流提取，将提取液减压浓缩后得到粗提物，提取步骤中，筛选时，选用筛孔范围为20-100目筛，且斑唇马先蒿全草与乙醇溶液的料液比为1:3-1:30，且使用乙醇溶液中乙醇的质量浓度为0％-90％，且第一预定温度为20℃-80℃，且提取次数为1-5次，每次提取0.5h-3h。

S2、富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，并将剩余部分进行过柱操作，用不同浓度的乙醇溶液对分离柱进行洗脱，富集步骤中，乙醇溶液中乙醇的质量浓度为50％，富集步骤中，乙醇溶液的体积是分离柱中柱床的体积的5倍-20倍，富集步骤中，在采用质量浓度为50％的乙醇溶液对分离柱进行洗脱前，依次用去离子水、质量浓度为30％的乙醇溶液和质量浓度为40％的乙醇溶液对分离柱进行洗脱，且去离子水的体积是分离柱中柱床的体积的5倍-20倍，质量浓度为30％的乙醇溶液的体积是分离柱中柱床的体积的5倍-20倍，质量浓度为40％的乙醇溶液的体积是分离柱中柱床的体积的5倍-20倍，得到洗脱液，将洗脱液减压浓缩，以得到含有目标成分的富集物，富集步骤中，使用乙酸乙酯萃取的次数为3-10次，分离柱采用非极性大孔树脂柱，非极性大孔树脂柱包括D101型大孔树脂、AB-8型大孔树脂、D3520型大孔树脂和X-5型大孔树脂。

S3、分离纯化：(1)、采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法从斑唇马先蒿正丁醇部分筛选出6个具有明显抗氧化活性的化合物。

其中，在线抗氧化筛选条件，采用Agilent 1100(250×4.6mmi.d.,5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇溶液，甲醇的质量浓度为45-50％，等度洗脱，梯度洗脱时间为0-45min，流动相流速为1ml/min，检测波长330，DPPH溶液浓度25μg/ml甲醇溶解，流动相流速为0.45ml/min，检测采用Agilent 1260，DPPH反应环长度15m，检测波长为517nm。

(2)、采用高速逆流色谱仪分离纯化出了这6种高纯度单体化合物，其中，在通过高速逆流色谱仪进行分离时，在第二预定温度采用乙酸乙酯-正丁醇-水容积系统进行洗脱，分离纯化步骤中，乙酸乙酯-正丁醇-水体系中氯仿、正丁醇、水的体积比为10-15：2-5：8-10，且第二预热温度为20℃-50℃，且高速逆流色谱仪的转速为500-1000r/min。

实施例一

S1、提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎筛选至20目后，以1:3斑唇马先蒿全草与乙醇溶液的料液比并在20℃的温度下用质量浓度为30％乙醇溶液回流提取1次，且提取时间为0.5h，将提取液减压浓缩后得到粗提物。

S2、富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，且萃取次数为3次，并将剩余部分上D101型大孔吸附树脂柱，依次用5倍柱床体积的去离子水、5倍柱床体积的质量浓度为20％的乙醇、5倍柱床体积的质量浓度为30％的乙醇和5倍柱床体积的质量浓度为40％的乙醇洗脱，其中40％的乙醇洗脱部分为含有目标成分的洗脱液，将含有目标成分的洗脱液经减压浓缩至恒重，即得含有目标成分的富集物。

S3、分离纯化：(1)、采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法从斑唇马先蒿正丁醇部分筛选出6个具有明显抗氧化活性的化合物。

其中，在线抗氧化筛选条件，采用Agilent 1100(250×4.6mmi.d.,5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇溶液，甲醇的质量浓度为45％，等度洗脱，梯度洗脱时间为10min，流动相流速为1ml/min，检测波长330，DPPH溶液浓度25μg/ml甲醇溶解，流动相流速为0.45ml/min，检测采用Agilent 1260，DPPH反应环长度15m，检测波长为517nm。

(2)、采用高速逆流色谱仪分离纯化出6种高纯度单体化合物，其中，在通过高速逆流色谱仪进行分离时，采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水体系中氯仿、正丁醇、水的体积比为10：2：8，在20℃的温度下，采用乙酸乙酯-正丁醇-水容积系统进行洗脱，且高速逆流色谱仪的转速为500r/min，从而分离纯化出了6种高纯度单体化合物，且经过鉴定6种高纯度单体化合物的结构式如图5所示。

实施例二

S1、提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎筛选至40目后，以1：8斑唇马先蒿全草与乙醇溶液的料液比并在30℃的温度下用质量浓度为40％乙醇溶液回流提取2次，且提取时间为1h，将提取液减压浓缩后得到粗提物。

S2、富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，且萃取次数为5次，并将剩余部分上AB-8型大孔吸附树脂柱，依次用8倍柱床体积的去离子水、8倍柱床体积的质量浓度为20％的乙醇、8倍柱床体积的质量浓度为30％的乙醇和8倍柱床体积的质量浓度为40％的乙醇洗脱，其中40％的乙醇洗脱部分为含有目标成分的洗脱液，将含有目标成分的洗脱液经减压浓缩至恒重，即得含有目标成分的富集物。

S3、分离纯化：(1)、采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法从斑唇马先蒿正丁醇部分筛选出6个具有明显抗氧化活性的化合物。

其中，在线抗氧化筛选条件，采用Agilent 1100(250×4.6mmi.d.,5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇溶液，甲醇的质量浓度为46％，等度洗脱，梯度洗脱时间为20min，流动相流速为1ml/min，检测波长330，DPPH溶液浓度25μg/ml甲醇溶解，流动相流速为0.45ml/min，检测采用Agilent 1260，DPPH反应环长度15m，检测波长为517nm。

(2)、采用高速逆流色谱仪分离纯化出6种高纯度单体化合物，其中，在通过高速逆流色谱仪进行分离时，采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水体系中氯仿、正丁醇、水的体积比为11：2：8，在25℃的温度下，采用乙酸乙酯-正丁醇-水容积系统进行洗脱，且高速逆流色谱仪的转速为600r/min，从而分离纯化出了6种高纯度单体化合物，且经过鉴定6种高纯度单体化合物的结构式如图5所示。

实施例三

S1、提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎筛选至60目后，以1：10斑唇马先蒿全草与乙醇溶液的料液比并在40℃的温度下用质量浓度为50％乙醇溶液回流提取3次，且提取时间为1.5h，将提取液减压浓缩后得到粗提物。

S2、富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，且萃取次数为7次，并将剩余部分上D3520型大孔吸附树脂柱，依次用10倍柱床体积的去离子水、10倍柱床体积的质量浓度为20％的乙醇、10倍柱床体积的质量浓度为30％的乙醇和10倍柱床体积的质量浓度为40％的乙醇洗脱，其中40％的乙醇洗脱部分为含有目标成分的洗脱液，将含有目标成分的洗脱液经减压浓缩至恒重，即得含有目标成分的富集物。

S3、分离纯化：(1)、采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法从斑唇马先蒿正丁醇部分筛选出6个具有明显抗氧化活性的化合物。

其中，在线抗氧化筛选条件，采用Agilent 1100(250×4.6mmi.d.,5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇溶液，甲醇的质量浓度为47％，等度洗脱，梯度洗脱时间为30min，流动相流速为1ml/min，检测波长330，DPPH溶液浓度25μg/ml甲醇溶解，流动相流速为0.45ml/min，检测采用Agilent 1260，DPPH反应环长度15m，检测波长为517nm。

(2)、采用高速逆流色谱仪分离纯化出6种高纯度单体化合物，其中，在通过高速逆流色谱仪进行分离时，采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水体系中氯仿、正丁醇、水的体积比为13：3：8，在30℃的温度下，采用乙酸乙酯-正丁醇-水容积系统进行洗脱，且高速逆流色谱仪的转速为700r/min，从而分离纯化出了6种高纯度单体化合物，且经过鉴定6种高纯度单体化合物的结构式如图5所示。

实施例四

S1、提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎筛选至80目后，以1：20斑唇马先蒿全草与乙醇溶液的料液比并在60℃的温度下用质量浓度为70％乙醇溶液回流提取4次，且提取时间为2h，将提取液减压浓缩后得到粗提物。

S2、富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，且萃取次数为8次，并将剩余部分上D3520型大孔吸附树脂柱，依次用15倍柱床体积的去离子水、15倍柱床体积的质量浓度为20％的乙醇、15倍柱床体积的质量浓度为30％的乙醇和15倍柱床体积的质量浓度为40％的乙醇洗脱，其中40％的乙醇洗脱部分为含有目标成分的洗脱液，将含有目标成分的洗脱液经减压浓缩至恒重，即得含有目标成分的富集物。

S3、分离纯化：(1)、采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法从斑唇马先蒿正丁醇部分筛选出6个具有明显抗氧化活性的化合物。

其中，在线抗氧化筛选条件，采用Agilent 1100(250×4.6mmi.d.,5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇溶液，甲醇的质量浓度为48％，等度洗脱，梯度洗脱时间为40min，流动相流速为1ml/min，检测波长330，DPPH溶液浓度25μg/ml甲醇溶解，流动相流速为0.45ml/min，检测采用Agilent 1260，DPPH反应环长度15m，检测波长为517nm。

(2)、采用高速逆流色谱仪分离纯化出6种高纯度单体化合物，其中，在通过高速逆流色谱仪进行分离时，采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水体系中氯仿、正丁醇、水的体积比为14：4：9，在40℃的温度下，采用乙酸乙酯-正丁醇-水容积系统进行洗脱，且高速逆流色谱仪的转速为850r/min，从而分离纯化出了6种高纯度单体化合物，且经过鉴定6种高纯度单体化合物的结构式如图5所示。

实施例五

S1、提取：将斑唇马先蒿全草干燥后粉碎筛选至100目后，以1：30斑唇马先蒿全草与乙醇溶液的料液比并在80℃的温度下用质量浓度为90％乙醇溶液回流提取5次，且提取时间为3h，将提取液减压浓缩后得到粗提物。

S2、富集：将提取步骤中得到的粗提物用去离子水溶解后，再用乙酸乙酯溶液萃取除去小极性化合物，且萃取次数为10次，并将剩余部分上X-5型大孔吸附树脂柱，依次用20倍柱床体积的去离子水、20倍柱床体积的质量浓度为20％的乙醇、20倍柱床体积的质量浓度为30％的乙醇和20倍柱床体积的质量浓度为40％的乙醇洗脱，其中40％的乙醇洗脱部分为含有目标成分的洗脱液，将含有目标成分的洗脱液经减压浓缩至恒重，即得含有目标成分的富集物。

S3、分离纯化：(1)、采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法从斑唇马先蒿正丁醇部分筛选出6个具有明显抗氧化活性的化合物。

其中，在线抗氧化筛选条件，采用Agilent 1100(250×4.6mmi.d.,5μm)反相色谱柱，流动相为甲醇溶液，甲醇的质量浓度为50％，等度洗脱，梯度洗脱时间为45min，流动相流速为1ml/min，检测波长330，DPPH溶液浓度25μg/ml甲醇溶解，流动相流速为0.45ml/min，检测采用Agilent 1260，DPPH反应环长度15m，检测波长为517nm。

(2)、采用高速逆流色谱仪分离纯化出6种高纯度单体化合物，其中，在通过高速逆流色谱仪进行分离时，采用的溶剂系统为乙酸乙酯-正丁醇-水体系中氯仿、正丁醇、水的体积比为15：5：10，在50℃的温度下，采用乙酸乙酯-正丁醇-水容积系统进行洗脱，且高速逆流色谱仪的转速为1000r/min，从而分离纯化出了6种高纯度单体化合物，且经过鉴定6种高纯度单体化合物的结构式如图5所示。

综上所述：本发明通过采用在线DPPH-HPLC抗氧化活性成份筛选方法和采用高速逆流色谱仪的配合使用，使斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离方法非常便捷和迅速，从而缩短了斑唇马先蒿中六种抗氧化活性成份的筛选及分离的时间，提高了生产效率，且节省了工艺中所使用有机溶剂的量，从而节省了成产升本。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。