一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测方法，属于甲基化DNA检测技术领域。本发明使用不同标记(地高辛，生物素)的甲基化特异性引物，通过聚合酶链式反应(PCR)鉴别亚硫酸氢盐修饰的基因组样品中的甲基化DNA而不是非甲基化等位基因；利用聚合酶的扩增能力，产生大量具有地高辛和生物素双标记的双链扩增子；通过修饰在金电极表面的地高辛抗体捕获这些双链扩增子；然后通过生物素‑亲和素结合作用捕获辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin‑HRP)，利用酶的催化过程产生电化学信号。该方法具有良好的灵敏度，能检测5pg的甲基化DNA分子，同时具有良好的特异性，能够在有大量非甲基化DNA干扰下检测出1％的甲基化DNA。

说明书

技术领域

本发明属于甲基化DNA检测技术领域，具体涉及一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测方法及试剂盒。

背景技术

DNA甲基化在哺乳动物中广泛存在，主要表现为在CpG二核苷酸处的胞嘧啶碱基5号碳原子上添加一个甲基。大量研究表明，DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性以及DNA与蛋白相互作用方式的改变，从而控制基因表达。因此，肿瘤抑制基因中启动子区域CpG岛的甲基化通常与癌症的发展有关。累积的证据表明这些甲基化的DNA可以在肿瘤的不同阶段释放到人体循环系统中，这些无细胞的循环DNA被认为是癌症早期检测的标志物和行为监测的预后指标。然而，来自癌症的甲基化DNA仅是复杂临床样本(例如血浆)中总DNA的一小部分，因而，对特异性甲基化DNA的精准分析仍是一项持久的技术挑战。

《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》指出“血液循环DNA片段通常较短，在晚期癌症患者血液中浓度极低，平均约为17μg/L”，因此如何高灵敏高特异地检测这些甲基化的DNA就显得尤为重要。目前，MSP是检测甲基化DNA的常用方法，相比于特异性酶切识别，MSP不局限于特异性的序列，应用更为广泛。MSP依赖于亚硫酸氢钠处理DNA，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不改变甲基化的胞嘧啶，从而将表观遗传学差异转化为序列差异，然后通过PCR用甲基化特异性引物扩增这些修饰后的DNA，产物用凝胶电泳鉴定。然而，这种MSP方法仅提供定性分析，检测灵敏度低。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测方法，该检测方法灵敏度高，选择性高，特异性好，能够实现微量检测。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测方法，包括以下步骤：

1)提取待检测血浆样品中的DNA，用亚硫酸氢盐修饰处理；

2)设计甲基化特异性引物，包括用地高辛标记正义链引物，用生物素标记反义链引物；

3)用步骤2)设计的甲基化特异性引物识别步骤1)中经亚硫酸氢盐修饰的待检测血浆样品中的甲基化DNA；

4)利用Taq聚合酶对经步骤3)处理的甲基化DNA及甲基化特异性引物进行识别与扩增，产生具有地高辛和生物素双标记的双链扩增子；

5)在金电极表面修饰地高辛特异性抗体，双链扩增子中标记有地高辛的一端能够被金电极表面修饰地高辛特异性抗体特异性识别捕获；

6)在待检测血浆样品中加入测试底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺，双链扩增子中标记有生物素的一端能够被辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白捕获，辣根过氧化物酶与测试底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺发生催化反应产生电化学信号，通过实时监测电化学信号变化，确定待检测血浆样品中甲基化DNA的含量。

所述正义链引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反义链引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

步骤4)中，识别和扩增的热循环条件为：

92℃ 15s；

64℃ 20s；

72℃ 15s；

共30个循环。

优选地，识别和扩增时，正义链引物和反义链引物的浓度为200nM。

步骤5)中，在金电极表面修饰地高辛特异性抗体的具体操作为：

首先，将金电极浸于MUA(11-巯基十一烷酸)的乙醇溶液过夜中，使得金电极表面包覆上MUA；

然后，依次用乙醇和水冲洗掉多余的MUA；

再次，在包覆有MUA的金电极表面加活化剂MES(2-(N-吗啉)乙磺酸一水合物)，室温静置处理活化羧基基团；

最后，在活化的金电极表面加地高辛抗体，室温静置，制得。

优选地，MUA的乙醇溶液的浓度为1mM；活化剂MES的浓度为0.1M；地高辛抗体的用量为200ng。

优选地，室温静置时间为30min。

本发明还公开了一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测试剂盒，包括：

亚硫酸氢盐修饰试剂包，用于修饰待检测血浆样品中的DNA；

甲基化特异性引物，包括地高辛标记的正义链引物和生物素标记的反义链引物；

Taq聚合酶及反应预混液，用于制备具有地高辛和生物素双标记的双链扩增子；

金电极及金电极表面修饰的地高辛抗体，用于捕获目标核苷酸正义链；

与辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白，用于捕获目标核苷酸反义链；

辣根过氧化物酶，用于与测试底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺发生催化反应产生电化学信号。

优选地，目标核苷酸正义链的序列如SEQ ID NO.1所示；目标核苷酸反义链序列如SEQ ID NO.2所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明公开的基于双标记扩增的循环甲基化DNA电化学检测方法，使用不同标记(地高辛，生物素)的甲基化特异性引物，通过聚合酶链式反应(PCR)鉴别亚硫酸氢盐修饰的基因组样品中的甲基化DNA而不是非甲基化等位基因；利用聚合酶的扩增能力，产生大量具有地高辛和生物素双标记的双链扩增子；通过修饰在金电极表面的地高辛抗体捕获这些双链扩增子；然后通过生物素-亲和素结合作用捕获辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP)，利用酶的催化过程产生电化学信号。本发明将连续的识别过程(甲基化特异引物退火和抗原抗体特异结合)和级联的信号放大过程(甲基化特异PCR和HRP酶催化反应)进行良好的整合，使得该方法具有良好的灵敏度，能检测5pg的甲基化DNA分子，同时具有良好的特异性，能够在有大量非甲基化DNA干扰下检测出1％的甲基化DNA。

本发明公开的基于双标记扩增的循环甲基化DNA电化学检测试剂盒，使用方便，操作简单，具有良好的特异性，检测灵敏度高，适用范围广。

附图说明

图1为本发明的方法流程示意图；

图2为加入不同量甲基化DNA的电流值响应；

图3为加入不同比率甲基化DNA的电流值响应；

图4为本方法检测11个非小细胞肺癌患者200微升血浆样本中游离甲基化DNA的结果。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提供的基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测试剂盒及方法，是一种基于双标记扩增与抗原抗体特异结合的连续识别和聚合酶过氧化物酶级联放大策略的血浆循环甲基化DNA检测。

参见图1，本发明通过甲基化特异性引物识别经亚硫酸钠反转后的甲基化DNA序列，由聚合酶扩增出大量带有双标记的目标分子；特异性识别地高辛的抗体修饰在金电极表面，通过抗原抗体结合作用捕获目标分子；同时目标分子含有生物素，暴露在结构上端，特异性捕获加入的辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP)，此蛋白能够催化测试底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)的氧化还原反应，进而产生级联放大的电化学信号。

具体方法，包括以下步骤：

1)提取待检测血浆样品中的DNA，用亚硫酸氢盐修饰处理；

2)设计甲基化特异性引物，包括用地高辛标记正义链引物，用生物素标记反义链引物；

3)用步骤2)设计的甲基化特异性引物识别步骤1)中经亚硫酸氢盐修饰的待检测血浆样品中的甲基化DNA；

4)利用Taq聚合酶对经步骤3)处理的甲基化DNA及甲基化特异性引物进行识别与扩增，产生具有地高辛和生物素双标记的双链扩增子；

5)在金电极表面修饰地高辛特异性抗体，双链扩增子中标记有地高辛的一端能够被金电极表面修饰地高辛特异性抗体特异性识别捕获；

6)在待检测血浆样品中加入测试底物TMB，双链扩增子中标记有生物素的一端能够被辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白捕获，辣根过氧化物酶与测试底物TMB发生催化反应产生电化学信号，通过实时监测电化学信号变化，确定待检测血浆样品中甲基化DNA的含量。

本发明公开的基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测试剂盒，包括：

①亚硫酸氢盐修饰试剂包，用于修饰待检测血浆样品中的DNA，DNA序列经过亚硫酸氢钠修饰反转后，正常的胞嘧啶变为尿嘧啶(在后续扩增与识别中可视为胸腺嘧啶，与腺嘌呤互补配对)，甲基化的胞嘧啶及其他碱基不变，这样，表观遗传学上的差异就变成了碱基序列上的差异；

②甲基化特异性引物，包括地高辛标记的正义链引物和生物素标记的反义链引物；

正义链引物5’端修饰有地高辛，反义链引物5’端修饰有生物素，反应时通过加入适合浓度(200nM)的引物，扩增后产生大量带有地高辛和生物素双标记的双链扩增子，被抗体捕获后将生物素暴露在最上面，能与抗生物素蛋白结合；其中：

正义链引物核苷酸序列为5'-TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC-3'，5’端标记有地高辛；

反义链引物核苷酸序列为:5'-GACCCCGAACCGCGACCGTAA-3'，5’端标记有生物素；

③Taq聚合酶及反应预混液，用于产生带有地高辛和生物素双标记的双链扩增子；

④金电极及金电极表面修饰的地高辛抗体，用以捕获目标核酸链；

⑤辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP)，用以捕获目标核酸链；

⑥辣根过氧化物酶，用于与测试底物TMB发生催化反应产生电化学信号。

以下为采用本发明方法及试剂盒的应用实例：

检测对象：本发明检测目标基因组为肺癌患者200微升血浆样本中的循环甲基化DNA。

检测方法：

首先提取血浆中的DNA，然后由亚硫酸氢钠处理，以此为样本进行检测。检测信号与标准加入量产生的信号进行对比，确定患者血浆样本中甲基化DNA的含量。

使用地高辛标记的正义链引物和生物素标记的反义链引物识别与扩增甲基化模板序列。

金电极表面地高辛特异性抗体修饰过程为：首先将金电极浸于1mM MUA的乙醇溶液过夜使得金电极表面包覆上MUA；依次用乙醇和水冲洗掉多余的MUA；金电极表面加活化剂0.1M MES室温放置30分钟用来活化羧基基团；活化的电极表面加200ng地高辛特异性抗体(1×PBS稀释获得)室温放置30分钟；

通过生物素-亲和素结合作用，与辣根过氧化物酶缀合的抗生物素蛋白(Avidin-HRP)被捕获在金电极表面，利用过辣根过氧化物酶对测试底物中加入的TMB的催化过程产生电化学信号；

电化学信号与待测甲基化DNA含量之间的转换关系见图2，图3。图2为检测不同含量的甲基化DNA，从图2中可以看出，电化学信号随着甲基化DNA含量的增加而增加。如图本方法可以检测到低至5pg的DNA，说明本发明方法具有很高的灵敏度。

图3为检测不同比率的甲基化DNA，从图3中可以看出，电化学信号随着甲基化DNA比率的增加而增加。如图本方法能从100倍过量的非甲基化干扰中检测出甲基化分子，说明本发明方法具有高的特异性。

另外，本发明中电化学信号值与样品中甲基化DNA的含量之间不是绝对定量的，需要根据加入的标准量DNA进行相对定量。

在检测实际病人样本时，针对肺癌患者微量(200微升)血浆样本中循环DNA的检测，本发明提供的方法准确检测了这11个确诊病人的甲基化DNA。参见图4，可以看出，利用本方法对11个病人血浆样本中循环甲基化DNA进行检测，确定了11个非小细胞肺癌患者血浆样本(200微升)中p16INK4a基因的甲基化，其结果与临床诊断和治疗反应监测完全一致。

综上所述，本发明提供一种血浆循环甲基化DNA电化学检测方法及试剂盒，优势如下：

1、本发明采用不同标记的特异性引物，经扩增产生具有双标记的双链扩增子，采用了两步识别过程，具有较高的选择性，能够特异性地扩增及检测目标分子；

2、本发明采用了级联放大的设计思路，整合了聚合酶和过氧化物酶的催化放大体系，具有高灵敏度；

3、本发明提供的基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测试剂盒及方法，设计简单，对于其他基因的甲基化检测，只需要改变引物序列；

4、与传统的实时荧光甲基化特异性PCR(qMSP)方法相比，本发明上样量很少，可以实现微量检测，尤其有利于检测血浆中循环的甲基化DNA，具有很高的适用范围。经实验结果验证，本发明可以检测低至5pg的甲基化DNA分子；该检测方法具有高的特异性，能从100倍过量的非甲基化干扰中检测出甲基化分子，从而解决了现有检测方法中由于特异性不强灵敏度不高导致的无法准确检测微量核酸样本的难题。

以上给出的实施例是实现本发明较优的例子，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。

核苷酸序列表

<110> 西安交通大学

<120>一种基于双标记扩增的血浆循环甲基化DNA电化学检测方法

<160>2

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<400> 1

ttattagagg gtggggcgga tcgc 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<400> 2

gaccccgaac cgcgaccgta a 21