一种高产特异性产物的木聚糖酶改良基因及其工程菌制备低聚木糖的应用

摘要

本发明提供了一种编码具有水解木聚糖底物高产特异木二、三糖产物的木聚糖酶的改良基因其大肠杆菌基因工程菌制备低聚木糖的应用。改良后的木聚糖酶其N端氨基酸序列的86位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺。重组酶XYNGH10酶学性质为：最适pH5.5，最适温度65℃，酶活为160U/ml，其水解木聚糖底物时产物中木糖含量大于14％；而构建的突变体GH10‑N86Q水解木聚糖底物时产物中木糖含量均低于2％以下，且水解产物以具较强益生功效的木二糖与木三糖组分为主。突变体酶最适pH为5.5，最适温度为55℃，其酶活为201U/ml较改造前提高了25.6％。本发明的改良基因其大肠杆菌基因工程菌具有良好的利用富含半纤维素农业废弃物酶法生产低聚木糖工业生产应用前景，可以广泛应用于食品、医药工业等领域。

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质工程领域涉及一种来源于链霉菌(Streptomyces sp. L10608)的具有水解木聚糖底物高产特异性木二、三糖产物的木聚糖酶改良基因及其工程菌株制备低聚木糖的应用。

背景技术

我国是一个农业大国，伴随着农产品的生产加工，每年产生大量的农业废弃物。这些农业废弃物资源再生利用率极低，大部分被浪费。大力开发利用这些资源可以缓解环境、资源和粮食危机，因此农业废弃物再利用成为近十几年各国研究的热点。农业废弃物中富含纤维素和半纤维素，其中半纤维素占到20％-30％，每年新生成的半纤维素有3×10¹⁰吨之多。木聚糖是结构比较复杂的半纤维素，为世界第二大可再生资源。由于木聚糖结构复杂，它的彻底水解需要一系列酶的协同作用，其中最关键的酶是木聚糖酶。木聚糖酶属水解酶类，在碳循环过程中发挥了不可替代的功能，具有重要的潜在应用价值，目前已成功应用于食品、饲料、酿造、造纸、医药和能源等领域。在众多应用中，以木聚糖制取有较高附加值的功能低聚糖是富含半纤维素材料的农业废弃物再生利用的有效增值途径，具有巨大的潜在经济效益和环保意义。

低聚木糖是由2～7个木糖分子以糖苷键连接成的功能性聚合糖，其中木二、木三糖为主要有效成分。它附加值高、市场前景好，70％的低聚木糖糖浆产品价格高达20万元人民币/t，而含量达95％的固体粉末价格则高达63万元人民币/t。低聚木糖可广泛应用于饮料、糖果、糕点、冰淇淋、乳制品及调味品等食品、医药行业中的无糖低能量产品，以供给肥胖症、糖尿病、高血压、动脉硬化、龋齿患者食用。目前因生物酶法具有环境友好、产物易于控制、产品特异性好等优点，逐渐成为利用农业废弃物生产低聚木糖的主要方法。而目前酶法生产采用的微生物来源的木聚糖酶水解木聚糖时产物中木二、木三糖等特异性成分含量大多低于30％且含大量木糖、阿拉伯糖等单糖和其他非功能性成分，后期需要较复杂的工艺和高额的成本来进行提纯，以提高功能低聚木糖纯度(60％-70％)。只有极少数菌株产的木聚糖酶水解底物时，产物中木二、木三糖比例超过了50％。因此酶法制取低聚木糖的生产中提高催化过程中木二糖、木三糖特异功效成分，消除和减少产生木糖，避免低聚木糖进一步转变为木糖是亟待解决的一关键问题。显著提高酶法生产低聚木糖过程中特异性功能成分的含量将降低酶法生产成本，减少后期纯化过程中的能耗、污水排放等，降低环境污染，实现高效利用低值农业废弃物生产高附加值低聚木糖的大规模工业化生产应用。

发明内容

本发明的第一个目的是获得一种具有水解木聚糖底物高产特异木二、三糖产物的木聚糖酶改良基因。

本发明的第二个目的是获得表达上述木聚糖酶改良基因的基因工程菌株。

本发明的第三个目的是对工程菌株制备低聚木糖进行初步应用。

本发明获得了一种木聚糖酶改良基因(xynGH10-N86Q)，其核苷序列如SEQ-1所示，其氨基酸序列如SEQ-2所示。

本发明获得一种具有水解木聚糖底物高产特异木二、三糖产物的木聚糖酶改良基因。作 为改良基础的木聚糖酶(XYNGH10)来源与链霉菌Streptomyces sp.10608(中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生中心，保藏编号CGMCC No.13271，地址：北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，保藏日期2016年11月14日)。该木聚糖酶最适pH5.5，最适温度65℃。 改良后的木聚糖酶和原始木聚糖酶相比，由原始木聚糖酶N端氨基酸序列的86位的天冬酰 胺突变为谷氨酰胺。

本发明提供了一种含有上述木聚糖酶改良基因的核苷酸编码序列的质粒。该质粒可以是原核或者真核质粒。将含有本发明的木聚糖酶改良基因编码序列通过常规方法克隆至载体的多克隆位点即可形成重组载体质粒。本发明的质粒可以是原核表达质粒，如大肠杆菌表达质粒PET21a，PET28a，PET30a等。该质粒也可以是真核表达质粒如pPIC9K，pPIC9等。

本发明还提供了含有原始木聚糖酶基因及该改良基因的重组大肠杆菌基因工程菌株。大肠杆菌表达的重组酶XYNGH10酶学性质为：最适pH5.5，最适温度65℃，酶活为160U/ml，其水解木聚糖底物时产物中木糖含量大于14％；而构建的突变体GH10-N86Q水解木聚糖底物时产物中木糖含量均低于2％以下，且水解产物以具较强益生功效的木二糖与木三糖组分为主。突变体酶最适pH5.5，最适温度55℃，其酶活为201U/ml较改造前提高了25.6％。

附图说明

图1 xynGH10选择的突变位点示意图。

图2重叠延伸PCR定点突变拼接序列。M：marker；道1、2为平行的N86Q拼接序列

图3位点突变前后重组酶N端86位氨基酸作用力预测。(A)突变前86位天冬酰胺作用力预测，(B)突变后86位谷氨酰胺作用力预测。

图4重组酶的最适pH。

图5重组酶的最适温度。

具体实施方式

本发明以下结合具体实例作进一步说明，但并不是限制本发明。下面结合附图对本发明进一步说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条，如J.萨姆布鲁克 (Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南 第三版》中所述的条件，或按照试剂盒生产商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。

1.普通试剂：刚果红；卡那霉素(美国AMRESCO)；琼脂糖(西班牙Biowest)；氨苄青霉素(美国AMRESCO)；桦木木聚糖(美国Sigma)；LB固体培养基；木聚糖-刚果红筛选平板；NaCl洗脱液：1M；燕麦木聚糖和玉米芯木聚糖(VETEC)；木糖标品(木糖、木二糖、木三糖、木四糖)国药集团化学试剂；LB固体培养基：胰蛋白胨1％(m/v)，酵母提取物0.5％(m/v)，NaCl1％(m/v)，琼脂粉1.5％(m/v)；其他试剂为国产分析纯。

2.生化试剂：细菌基因组提取试剂盒(美国OMEGA)；胶回收试剂盒(OMEGA，美国)； La Taq DNA聚合酶(with GC buffer)；限制性内切酶EcoRI、XhoI；1kb DNA Ladder Marker (日本TAKARA)；La Taq DNA聚合酶(with GC buffer)(TAKARA，日本)；200bp DNA ladder (美国Biomega)；PCR扩增引物(北京奥科鼎盛合成)；200bp DNA ladder(美国Biomega)； 1kbDNALadderMarker(日本TAKARA)；

3.菌株：链霉菌(Streptomyces sp.)10608；大肠杆菌DH5a和Transtetta(DE3)感受态细胞购自全式金公司

4.载体：T载体：pMD18-T购于TAKARA公司；pET-28a(+)购自Merk公司

5.引物：T载体用测序：M13+序列：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’，M13-序列：5’- CAGGAAACAGCTATGAC-3’；

定点突变引物：xynGH10N86QF：5’-ACCGCCGAGGGCGAGATGAAG-3’， xynGH10N86QR：5’-CTTCATCTCGCCCTCGGCGGT-3’

实施例1：突变体的构建及原核表达

获得目的基因xynGH10后，用NcoR I和Xho I同时对表达载体pET28a和带有酶切位点的xynGH10进行双酶切，37℃反应3h。酶切过后通过1％(m/v)琼脂糖凝胶电泳检测并切胶回收带有粘性末端的xynGH10和线性化pET28a。尔后用T4DNA连接酶将回收的带有粘性末端的xynGH10和线性pET28a按摩尔比1∶7置于反应体系中连接，25℃中反应 1h，从而构建重组质粒pET28a-xynGH10。

已经连接了基因xynGH10的PET28a质粒作为突变的原材料。采用重叠延伸PCR的方法以设计好的N端第86位氨基酸的定点突变引物进行氨基酸定点突变。获得目的基因 xynGH10-N86Q后，用NcoR I和Xho I同时对表达载体pET28a和带有酶切位点的 GH10-N86Q进行双酶切，37℃反应3h。酶切切胶回收xynGH10-N86Q和线性化pET28a。尔后用连接构建重组质粒pET28a-xynGH10-N86Q。将重组质粒pET28a-xynGH10-N86Q突变序列导入感受态BL21(DE3)，然后进行突变序列的验证。由图1中可知所选择的突变位点在全序列中的位置，N86在序列中的位置较为靠前，未处于酶的催化域。

采用重叠延伸PCR的方法突变片段时，一条完整的基因片段从以突变位点为中点向两边延伸形成两条片段。如图2所示，道1、2均为拼接好的约1600bp长度的完整基因序列。

重组酶XYNGH10最适反应pH为5.5，最适温度为65℃，酶活力经DNS法测定为 160U/ml。而进过验证的突变重组酶GH10-N86Q经DNS法测定木聚糖酶活力为201U/ml。对改造的重组酶蛋白而言，保证其生物学活性是进行实际应用的基础，而突变体GH10-N86Q 将86位的天冬酰胺突变为谷氨酰胺后仍旧保持了原始酶蛋白分子中的非共价键的作用力，在一定基础上仍维持了空间构象。

实施例2：重组突变酶水解底物生成特异性产物性质研究

首先构建突变体酶水解底物体系。配置1ml反应体系：包括500μL浓度为20mg/ml的实验室自制水不溶性玉米芯木聚糖、玉米芯木聚糖(VETEC)、燕麦木聚糖(Biotopped)等不同底物，10U的酶液，用醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH＝5.5)补足至1ml。将配置好的1ml 反应体系于55℃水浴锅水浴加热反应12h，0.22μm水相膜注入进样瓶中等待检测。水解产物的检测条件为：氨基酸分析柱，流动相为乙腈∶水70∶30，流速为0.8ml/min，柱温箱温度 30℃，示差折光检测器温度30℃，进样量20μl。

分别吸取木糖、木二糖、木三糖、木四糖标准品溶于水中，依次稀释为浓度为： 0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.3mg/ml，0.4mg/ml，0.5mg/ml的标准溶液标制作准工作曲线，用0.45μm 微孔滤膜过滤，即得木糖、木二糖、木三糖、木四糖标准溶液系列。分别取20μl标准系列溶液进样分析，以木糖、木二糖、木三糖、木四糖浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制木糖、木二糖、木三糖、木四糖的峰面积-浓度标准曲线。

如表1所示，选择以榉木、燕麦和桦木等不同种木聚糖为底物，验证重组突变酶的水解特性及其在工业领域应用的可能性。在以榉木木聚糖为底物时，原始XYNGH10水解底物后产物中木糖含量为20.66％，而改造后的GH10-N86Q水解产物中木糖的占比显著下降仅为2.49％，且木三与木四糖等低聚木糖的含量也有显著的提高，分别为56.53％与15.97％。在以燕麦木聚糖为底物时GH10-N86Q仍然保持较高的低聚木糖得率，原始XYNGH10水解底物后产物中木糖含量为14.20％，而改造后的GH10-N86Q水解产物中木糖的占比显著下降仅为1.45％，且木三与木四糖等低聚木糖的含量也有显著的提高，分别为52.76％与 24.22％。在以桦木木聚糖为水解底物时，水解产物中的木糖含量同样从原始XYNGH10产物中的21.23％显著下降为GH10-N86Q中的1.01％，木三与木四糖等低聚木糖的含量也显著提高为61.89％与11.42％。

依据突变体酶GH10-N86Q水解不同木聚糖生成产物的情况综合分析：原始重组酶 xynGH10的水解特点为产物中以木糖与木二糖为主，其对木三糖底物有很强的水解活性，导致产物中生成了大量的木单糖。而改造后的突变体GH10-N86Q应用于水解木聚糖时，保持了良好的水解特性，产物中主要为低聚木糖且木糖含量均低于2％以下，同时还保持了较高的催化活性，其活性为xynGH10的125.6％。该突变体具有良好的利用富含半纤维素的农业废弃物酶法生产低聚木糖工业生产应用前景。

通过软件分析N端86位酶蛋白突变体的空间结构发现，86位氨基酸主要构成两个氢键ASN86：N-GLU87：OE1，LYS89：N-ASN86：O，从空间位置及多序列比对上可以看得到 ASN86与LYS89均处于底物与酶的-2位结合位点，显然86的酰胺集团与羟基基团对-2底物与酶结合位点的空间稳定构建起到了重要构建作用(图3(A))。而突变体GH10-N86Q 不仅改善了水解产物组成同时还提升了酶活，这可能是由于该位置氨基酸距离催化位点较进，与众多的氨基酸都有相互左右，天冬酰胺被谷氨酰胺替代后，其酰胺基团的作用得到了保留，在改变酶与底物结合方式的同时，维持了整个酶分子空间构象的稳定(图3(B))。

表1水解不同木聚糖底物时重组酶的产物组成比例

实施例3：重组突变酶酶学性质研究

以最适pH缓冲液将重组酶GH10-N86Q以一定比例稀释，然后分别在40～90℃的不同温度下，反应10rnin，测定突变体木聚糖酶活力，以最大值为100％。同时以最适pH缓冲液将酶液以一定比例稀释，选取不同温度处理30min后立即冰水浴终止反应，与未经处理的酶相比较，计算相对酶活，测定突变体酶水解反应时的温度稳定性。

如图4所示，重组酶xynGH10与突变体酶GH10-N86Q的最适pH均为5.5，这可能是由于突变的酶与底物结合位点不涉及影响酶pH特性及其空间结构变化的关键位点，因此未导致整个蛋白质产生特别明显pH特性改变。

如图5所示在最适温度的测定中GH-N86Q的最适温度为55℃，而xynGH10未突变体的最适温度则为60℃。未突变体保持酶活的能力较好，经过突变后的重组酶在高温的体系下稳定性较差，可能是由于突变后破坏了酶的整体空间结构。

以榉木木聚糖作为底物检测该重组木聚糖酶的活性。另外，按照木聚糖酶活性检测标准条件，分别以终浓度为1、2、3、4、5、6和8mg/ml的榉木聚糖进行该重组木聚糖酶的活性检测，重组木聚糖酶催化反应中的工作浓度为1.5μg/ml。使用LineWeaver-Bur作图法，作酶活与底物浓度的双倒数(1/V-1/[S])曲线，根据米氏方程，计算得到该重组木聚糖酶的动力学参数(米氏常数Km、催化常数kcat和催化效率kcat/Km)。

如表2所示，由酶催动力学参数与突变前的重组酶进行对比结果可知：GH10-N86Q 改造后其对底物的亲合性并没有显著改变，且其反应常数Km相比xynGH10未明显增大，表明其亲和力较好，对底物的催化效率较高，说明该突变体在改造上有良好的优势，可进一步应用于工业生产。

表2以榉木木聚糖为底物时重组酶的酶促动力学