葛根素衍生物及其制备方法和在预防、治疗心脑血管疾病或糖尿病及其并发症中的用途

摘要

本发明公开了葛根素衍生物及其制备方法和在预防、治疗心脑血管疾病或糖尿病及其并发症中的用途。本发明涉及式(I)或式(II)所示的葛根素衍生物或其药学上可接受的盐，

说明书

技术领域

本发明涉及心脑血管和糖尿病治疗领域以及化合物的制备领域，具体的，本发明涉及葛根素新型衍生物的结构及其制备方法以及这类衍生物在治疗和预防心脑血管疾病或糖尿病及其并发症中的用途。

背景技术

葛根素是从分布于豆科植物野葛和甘葛藤根中的一种黄酮类化合物，是中药葛根的主要活性成分之一。研究表明，葛根素是一类β受体阻断剂和钙离子拮抗剂，具有扩张冠状动脉、降血压、抗心律失常、降血糖、降血脂、舒张平滑肌、抑制血小板聚集和抗氧化等药理作用，临床上主要用于高血压、冠心病、心绞痛、急性脑梗死和高粘血症等心脑血管疾病的治疗。此外，葛根素与降糖物质根皮苷结构相似，两者均为黄酮类化合物，有研究证明葛根素也具有一定的降血糖功能。葛根素因其毒性低、安全范围广、疗效好等特点而具有重要的临床应用价值。

目前，葛根素在临床使用过程中存在水溶性差和口服生物利用度低等缺点，限制了其在临床上的使用范围。尤其是葛根素的水溶性较低，仅为4.5g/L，在临床使用中葛根素注射液大多需要加入高浓度的丙二醇以及赖氨酸、精氨酸、组氨酸和烟酰胺等作为助溶剂，而且这类助溶剂效果有限，同时还可能会引起人体的过敏反应以及肝肾损伤等毒副作用。因此，对葛根素进行结构改造和修饰，开发新型心脑血管保护药物以及降血糖药物，以增强其水溶性，提高生物利用度和生物学活性，具有重大应用价值和市场潜力。现有技术也公开了多种对葛根素进行结构修饰或改造来增强其水溶性的衍生物及相应制备方法，如CN101712676A公开了通过设计和合成高水溶新葛根素衍生物前药如葛根素磷酸盐、磺酸盐等来增强药物水溶性；CN103382203A公开了通过增强药物靶点性修饰改善葛根素水溶性和脂溶性；CN103694229A制备了水溶性和脂溶性良好的葛根素衍生物。葛根素的8位上连有一个吡喃葡萄糖碳苷，7，4′位上各有一个酚羟基，为葛根素的活性基团，是目前葛根素结构修饰的集中位点。

发明内容

针对现有技术存在的问题，为了克服葛根素水溶性差的缺点和不足，本发明以葛根素为原料，首先通过对其骨架进行改造，还原C环α，β不饱和双键，破坏分子刚性结构，提高其溶解性；其次，通过进一步还原酮羰基为羟基，提高分子极性和水溶性。最终得到了若干个水溶性良好的葛根素衍生物。本发明提供了一种葛根素新型衍生物，该药物具有水溶性好，活性高，制备成本低廉等特点，可以作为预防和治疗心脑血管疾病很有前景的药物。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

首先，本发明的一个目的在于，提供一种式(I)或式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐，

其中，可代表是单键，也可代表双键；R¹代表：氧原子、氢原子、羟基、烷氧基和卤素原子；R²和R³分别代表：氢原子、羟基、羟甲基、卤素原子，-O(O)CR⁴、-OSO₃R⁴、-O(O)PO₂R⁴R⁵；R⁴和R⁵可以独立选自氢原子、(C₁-C₄)烷基、氨基、金属离子，如钠离子、钾离子、镁离子、钙离子或锌离子等。

本发明优选的实施方案中，仅代表是单键。

本发明所述葛根素衍生物，是对葛根素骨架进行改造，还原C环α，β不饱和双键，破坏分子刚性结构，提高了其溶解性；进一步的，通过还原酮羰基为羟基，提高分子极性和水溶性。其中示例性的，本发明葛根素衍生物(化合物1-10)的水溶性较葛根素有显著提高(4.5g/L)，其中化合物5至10的水溶性最好，为20-25g/L，化合物1至4的水溶性略低，均为10g/L左右，但较葛根素溶解性有明显提升。本发明所述葛根素衍生物，在保持或提高葛根素生理活性的同时，有效的改善了其水溶性，提高生物利用度，适于做注射剂。

本发明优选的实施方案中，所述化合物可以是选自下列结构的化合物：

更为优选的实施方案中，本发明所示的化合物选自化合物5、6、10。

优选的实施方案中，本发明所述化合物药学上可接受的盐，也是本发明的保护范围，所述化合物药学上可接受的盐为所述化合物与无机碱，例如氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、氯化钙、醋酸钙或氯化镁形成的盐，或者与有机碱，例如氨基丁三醇、氨基乙醇、赖氨酸或精氨酸等形成的盐。

其次，本发明的目的之二在于提供上述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，所述化合物的制备方法包括如下反应，

通过式(III)或(V)所示的化合物经催化氢化反应得到式(IV)或式(VI)所示的化合物，其中可代表是单键，也可代表双键；R¹代表：氧原子、氢原子、羟基、烷氧基和卤素原子。

优选的实施方案中，式(IV)或式(VI)所示的化合物的制备分别是以葛根素(III)或式7,2”-脱水葛根素(V)为起始原料，通过以下方法制得：葛根素或脱水葛根素在钯碳催化下，在甲醇或乙酸乙酯溶液中，通过控制反应时间得到不同还原程度的如式(IV)或式(VI)所示的化合物，其中可代表是单键，也可代表双键；R¹代表：氧原子、氢原子和羟基。

本发明的再一个目的在于，提供一种包含上述化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。既可以作为单体使用，也可以作为异构体的混合物使用。医药组合物所用的辅料可为固态或液态。固态形式的制剂包括粉剂、片剂、分散颗粒、胶囊、药丸及栓剂。粉剂及片剂可包含约5％至约95％的活性成分。适当的固体辅料可以是碳酸镁、硬脂酸镁、滑石粉、糖或者乳糖。片剂、粉剂、药丸及胶囊为适于口服用的固态剂型。液态形式的制剂包括溶液、悬浮液及乳液，其实施例为非经肠注射用水溶液或水-丙二醇溶液，或添加甜味剂及造影剂的口服溶液。此外，还可制成注射用小水针、注射用冻干粉针、大输液或小输液。

本发明的另一个目的在于，提供上述式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗心脑血管疾病药物或降血糖药物中的用途。这些心脑血管疾病包括高血压、心绞痛、心脏衰竭、心肌梗死、中风和脑出血疾病等，此外还有糖尿病及其并发症。

本发明的又有一个目的在于，包括上述式(I)或式(II)化合物或其药学上可接受的盐与至少一种其它心血管疾病药物或降糖药物合用。所涵盖的其它心血管疾病药物或降糖药物的原子组成或结构均异于式(I)或式(II)的化合物。可与本发明新颖化合物组合使用的其它心血管疾病药物包括具有抗血栓形成、抗血小板聚集、抗动脉粥样硬化、抗再狭窄症及/或抗凝血、血管舒张活性的药物，以及糖尿病及其并发症。

本发明取得了以下有益效果：

(1)本发明以葛根素为原料，通过对其骨架进行改造，还原C环α，β不饱和双键，破坏分子刚性结构，提高其溶解性；其次，通过进一步还原酮羰基为羟基，提高分子极性和水溶性，最终得到了若干个水溶性良好的葛根素衍生物。

(2)通过动物实验证实，本发明所述组合物能增加豚鼠的冠脉血流量、对去甲肾上腺素所致的动脉收缩有舒张作用、对大鼠局灶性脑缺血再灌住损伤具有保护作用，在提高葛根素生物利用性的同时，有效的保持或提高了葛根素生理活性。

(3)本发明所述化合物制备简单易行，具有化合物活性高，制备成本低廉等特点，可以作为预防和治疗心脑血管疾病很有前景的药物。

附图说明

图1：去甲肾上腺素对动脉收缩的影响—空白对照

图2：葛根素对由去甲肾上腺素引起的动脉收缩的舒张作用

图3：化合物10对由去甲肾上腺素引起的动脉收缩的舒张作用

图4：化合物5和6混合物对由去甲肾上腺素引起的动脉收缩的舒张作用

具体实施方式

本发明列举实施例如下,对本发明作进一步详细说明,但本发明的实施方式不限于此。对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换或改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

实施例一：本发明所述化合物的结构如下：

上述化合物药学上可接受的盐为所述化合物与无机碱，例如氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钾、碳酸钠、氯化钙、醋酸钙或氯化镁形成的盐，或者与有机碱，例如氨基丁三醇、氨基乙醇、赖氨酸或精氨酸等形成的盐。

实施例二：化合物1和2的制备

称取化合物葛根素(III)置于干燥圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯加以溶解，随后加入10％鈀碳，室温下搅拌反应6小时，TLC监测反应进程，反应结束后，滤除鈀碳，蒸除溶剂，所得产物过Flash反相柱，流动相为甲醇/水梯度洗脱，最后减压蒸去溶剂，得白色固体化合物1和2。

化合物1：MS m/z:419(M+1)；¹H>

化合物2：MS m/z:419(M+1)；¹H>

实施例三：化合物3和4的制备

称取化合物脱水葛根素(V)置于干燥圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯加以溶解，随后加入10％鈀碳，室温下搅拌反应6小时，TLC监测反应进程，反应结束后，滤除鈀碳，蒸除溶剂，所得产物过Flash反相柱，流动相为甲醇/水梯度洗脱，最后减压蒸去溶剂，得白色固体化合物3和4。

化合物3：MS m/z:401(M+1)；¹H>3OD)δ7.92(d,J＝8.6Hz,1H),7.08(d,J＝8.6Hz,2H),6.77(d,J＝8.6Hz,2H),6.68(d,J＝8.6Hz,1H),5.18(d,J＝3.3Hz,1H),4.70–4.55(m,3H),4.00-3.97(m,2H),3.84(dd,J＝12.1,2.5Hz,1H),3.64(dd,J＝12.1,5.7Hz,1H),3.60(t,J＝9.4Hz,1H),3.35(ddd,J＝9.3,5.7,2.3Hz,1H).

化合物4：MS m/z:401(M+1)；¹H>3OD)δ7.92(d,J＝8.6Hz,1H),7.09(d,J＝8.6Hz,2H),6.74(d,J＝8.6Hz,2H),6.68(d,J＝8.5Hz,1H),5.18(d,J＝3.3Hz,1H),4.71–4.63(m,3H),3.98(dd,J＝9.5,4.8Hz,1H),3.88(dd,J＝7.4,5.3Hz,1H),3.84(dd,J＝12.0,2.4Hz,1H),3.64(dd,J＝12.1,5.8Hz,1H),3.59(t,J＝9.4Hz,1H),3.35(ddd,J＝8.0,5.8,2.4Hz,1H).

实施例四：化合物5-8的制备

称取化合物葛根素(III)置于干燥圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯加以溶解，随后加入10％鈀碳，室温下搅拌反应48小时，TLC监测反应进程，反应结束后，滤除鈀碳，蒸除溶剂，所得产物过硅胶反相柱，流动相为甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，减压蒸去溶剂，得化合物5、6、7和8的混合物。最后通过HPLC反相柱，流动相为乙腈/水，分别得到化合物5、6、7和8纯品。

化合物5：MS m/z:421(M+1)；¹H>

化合物6：MS m/z:421(M+1)；¹H>

化合物7：MS m/z:421(M+1)；¹H>

化合物8：MS m/z:421(M+1)；¹H>

实施例五：化合物9和10的制备

称取化合物3置于干燥圆底烧瓶中，加入乙酸乙酯加以溶解，随后加入10％鈀碳，室温下搅拌反应36小时，TLC监测反应进程，反应结束后，滤除鈀碳，蒸除溶剂，所得产物过硅胶反相柱，流动相为甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，减压蒸去溶剂，得化合物9和10的混合物。最后通过HPLC反相柱，流动相为乙腈/水，分别得到化合物9和10纯品。

化合物9：MS m/z:403(M+1)；¹H>3OD)δ7.36(d,J＝8.3Hz,1H),7.08(d,J＝8.5Hz,2H),6.73(d,J＝8.6Hz,2H),6.53(d,J＝8.3Hz,1H),5.07(d,J＝3.3Hz,1H),4.80(d,J＝7.3Hz,1H),4.52(dd,J＝4.7,3.4Hz,1H),4.35(dd,J＝11.1,3.7Hz,1H),4.27(dd,J＝11.1,8.4Hz,1H),3.93(dd,J＝9.5,4.8Hz,1H),3.84(dd,J＝12.0,2.3Hz,1H),3.60(dd,J＝12.1,6.1Hz,1H),3.55(t,J＝9.4Hz,1H),3.34–3.32(m,1H),3.03(td,J＝7.9,3.6Hz,1H).

化合物10：MS m/z:403(M+1)；¹H>3OD)δ7.09(d,J＝8.3Hz,2H),7.08(d,J＝8.4Hz,1H),6.68(d,J＝8.5Hz,2H),6.43(d,J＝8.1Hz,1H),4.92(d,J＝3.1Hz,1H),4.52–4.40(m,3H),4.35(dd,J＝4.8,3.1Hz,1H),4.21–4.10(m,1H),3.76(dd,J＝9.4,4.7Hz,1H),3.68–3.55(m,1H),3.42-3.38(m,1H),3.13(ddd,J＝8.9,5.3,1.9Hz,1H),3.05(dt,J＝12.3,2.9Hz,1H).

化合物1-10室温(25℃)进行水溶性试验，葛根素衍生物(化合物1-10)的水溶性较葛根素有显著提高(4.5g/L)，其中化合物5至10的水溶性最好，为20-25g/L，化合物1至4的水溶性略低，均为10g/L左右，取水溶性较好的化合物10、化合物5、6进行后续试验。

实施例六：式(I)或式(II)化合物对离体豚鼠冠脉流量的影响

1.材料：

动物：豚鼠

仪器：恒温装置、供氧系统、恒压装置、主动脉套管、手术器械

药品：葛根素注射液、化合物10、化合物5和6混合物，分别用无菌生理盐水溶解成10mg/ml和5mg/ml，腹腔注射和灌胃体积为0.5mL/100g。

2.方法：

(1)豚鼠雌雄各半，体重250-350g，随机分为正常组、葛根素组(50mg/kg)，化合物10低剂量组(25mg/kg,)、化合物10高剂量组(50mg/kg)、化合物5和6混合物低剂量组(25mg/kg)、化合物5和6混合物高剂量组(50mg/kg)每组4-5只，分别腹腔注射，每天一次，共10天。

另外还有正常组、化合物10高剂量组(50mg/kg)、化合物5和6混合物高剂量组(50mg/kg)分别灌胃给药，共7天。

(2)采用Langendorff法观察化合物对冠脉流量的影响，调节恒温恒压灌流仪器：温度37±0.5℃，氧气2-3个/s，压力40-60cm水柱。

(3)于末次给药30min后，20％乌拉坦(0.5ml/100g)麻醉，剪胸部皮肤，自剑突处剪开胸骨，迅速打开胸腔，暴露心脏，左手轻轻拿住心脏，剪断上下腔静脉、肺动脉、主动脉及心脏周围的组织，摘出心脏。置于充氧的4℃任洛氏液的培养皿中，用手指轻轻挤压心脏，使心室内残血排出，去除心包膜，找到主动脉。修剪连接在心脏上的肺叶、气管等累赘物，主动脉挂在主动脉套管上，供给离体条件。稳定10min后连续测定20min的每分冠脉流量。

3.结果：

葛根素组(50mg/kg)，化合物10低剂量组(25mg/kg,)、化合物10高剂量组(50mg/kg)、化合物5和6混合物低剂量组(25mg/kg)、化合物5和6混合物高剂量组(50mg/kg)与正常组相比，都能增加豚鼠的冠脉血流量。化合物5和6混合物高剂量组(50mg/kg)与正常组相比有统计学意义(腹腔注射*P0.05；灌胃**P0.01)。与葛根素组相比，化合物5和6混合物高剂量组(50mg/kg)对豚鼠的冠脉血流量的增加更明显，具体结果见表1。

表1：葛根素衍生物对离体豚鼠冠脉流量的影响

与相同给药途径的正常组相比：^*P0.05，^**P0.01。

4.结论：葛根素衍生物5和6混合物对豚鼠的冠脉血流量的增加更明显。

实施例七：式(I)或式(II)化合物对家兔主动脉环的作用

1.方法：

取家兔，棒击致昏，颈动脉放血致死，迅速开胸取出胸主动脉，置冷克亨氏液中，分离周围的组织，剪成0.5mm大小的环，备用，将其动脉环置恒温浴槽中(内有10ml克亨氏液)，并与压力换能器链接，(前负荷定为2g)，将其电信号传入电脑。37度恒温，通O₂，稳定2小时后，给予10^-6mmol/L去甲肾上腺素，待其是动脉收缩达高峰后，分别加入累加浓度的葛根素、化合物10、化合物5和6混合物0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml(生理盐水组加入同体积的生理盐水)，观察血管的舒张情况。

2.结果

具体结果如图1至图4所示，其中纵坐标代表动脉血管收缩张力，数值越高，血管收缩力越大。横坐标代表时间。由结果可知，化合物10以及化合物5和6混合物对去甲肾上腺素所致的动脉收缩有舒张作用。

实施例八：式(I)或式(II)化合物对大鼠局灶性脑缺血再灌住损伤保护作用的药效学观察

1.方法：

取90只SD雄性大鼠，体重280-320g，随机分为5组，实验前12小时，禁食不禁水。2％戊巴比妥钠溶液0.2ml/100g腹腔注射麻醉，仰位固定，用栓线法制作局灶性脑缺血再灌注损伤模型(缺血2小时再灌注24小时)，缺血后即刻静脉注射给药(葛根素、化合物10、化合物5和6混合物均为100mg/kg，sham组和模型组给予同容量的NS；402为腹腔注射)，24小时后观察神经学评分；心脏取血(4000转/min离心10min，取血清备用)，断头取脑，冰箱冷冻30min，将鼠脑横切成6片，置TTC染液中，37度水浴中30min，取出拍照，用捷达801形态分析软件计算梗塞面机百分比。用生化法检测SOD和MDA含量。

2.结果

具体实验结果如表2和表3所示：

表2：化合物10、化合物5和6混合物对脑缺血再灌注损伤的保护作用

注：^###p<0.001，vs假手术组；^*p<0.05,^**p<0.01,^***p<0.001，vs模型组。

表3：化合物10、化合物5和6混合物对脑缺血再灌注损伤血清SOD、MDA的影响

注：^###p<0.001，vs假手术组；^***p<0.001，vs模型组。

3.结论

(1)化合物10、化合物5和6混合物都可以减小大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤所致的脑梗塞面积，降低神经学评分。

(2)化合物10、化合物5和6混合物都可以升高局灶性脑缺血再灌注损伤所致的血清SOD含量，降低其MDA含量。