一株植物固氮细菌DJG211及其在提高土壤和植物活力中的应用

摘要

本发明公开了一株植物固氮细菌（

说明书

技术领域

本发明涉及植物固氮技术领域，具体地，涉及固氮菌种资源，更具体地，涉及一株植物固氮细菌DJG211及其在提高土壤和植物活力中的应用。

背景技术

土壤污染可大致归纳为有机污染物和无机污染物两大类。无机物污染主要为盐类、酸、碱、重金属、放射性元素化合物等；有机物污染主要包含合成洗涤剂、有机农药、氰化物、酚类、城市污水、石油、污泥及厩肥带来的有害物等。当土壤中积累有害物质较多，超过土壤的自身净能力，就会导致土壤的结构、组成和功能发生变化，有益微生物活动被抑制，有害物质或其分解产物在土壤中逐渐累积。经过“土壤→植物→人体”，或经过“土壤→水→人体”间接进入人体吸收，造成人体健康危害。现在农民普遍感觉土壤板结，庄稼比过去难种了。居民普遍感觉水果不如昔日香、瓜不不如过去甜、菜无味道，蔬菜虽然数量增多了，但比小时候的味道差多了。事实上，由于我们过去片面追求增加粮食产量，使得土壤及其生产环境受到了严重的破坏。中国化肥的使用量全球第一，过量的化肥使用导致农业生产的生态要素品质下降，这就是症结所在。我国农药施用量达130万吨，是世界平均水平的2.5倍。在中国，农药和化肥的实际利用率不到30%，其余70%以上都污染环境了。污染物的施用增加，导致土壤中的有益菌大量减少，土壤质量下降，土壤自净能力减弱，从而影响农作物的产量与品质，危害人类的身体健康，甚至出现环境报复风险。

固氮植物细菌可以内生于作物组织体内，也存在于自然环境中，具有较快的繁殖速度和代谢过程。该属细菌为我们分离和描述的一个新属，与肠杆菌属的细菌亲缘关系较近。它来源于普通野生稻组织中，能水解淀粉，分解蛋白质、降解纤微素等。它们也存在于土壤、水、植物根际及其组织内，与自然界的物质循环转化、土壤肥力转换、环境物质代谢均密切相关。同时它们对有机质的分解力强，增殖的同时，会释出活性的分解物质，促进作物生长。随着土壤中固氮植物细菌数量的增多，他能够为土壤提供各种酶类、清除土壤的污染物等有害物质和增加土壤微生物多样性。利用特定能够降解土壤中污染物的固氮植物细菌，配制成生物肥料，应用于土壤恢复，促进作物生长、提供植物活力方面具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一株植物固氮细菌DJG211。

本发明的另一个目的是提供一株植物固氮细菌DJG211在提高土壤和植物活力中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一株植物固氮细菌（Phytobacter>）DJG211，所述菌株于2017年6月5日保藏在广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60195。广东省微生物菌种保藏中心的保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

固氮植物细菌（Phytobacter>）能够产生淀粉酶、过氧化氢酶、色氨酸脱氨酶、赖氨酸脱羧酶等，因而能水解淀粉、蛋白质和纤微素等，从而清洁土壤、增加土壤中微生物多样性和提高土壤活力。该固氮植物细菌同时能内生于植物组织内，产生生物活性物质，具有生物固氮功能，能够清洁土壤中的污染物和抑制土壤中致病菌的生长繁殖，提高植物活力，延缓作物衰老。使用固氮植物细菌制品能够提高土壤活力和土壤微生物的多样性，从而改善农产品品质，有效提高农作物的产量。

本发明提供了一株来源于健康普通野生稻（Oryza>）植物组织内生的固氮植物细菌，在NFB和PDA培养基上生长势好，能够利用空气中氮气进行固氮生长。能在植物根际和植物组织内生存，提高植物对病原菌和植物活力，延缓作物衰老。16S rRNA基因序列分析该菌株DJG211与固氮植物细菌的模式菌株LS8^T同源性为99.6%。所述的固氮植物细菌能够降解土壤中的纤维素和腐败物质，清洁土壤和提高土壤活力，显著地促进水稻、油麦菜等作物的生长和提高产量，可应用于各种农作物种植应用。在经本发明的固氮植物菌处理后，显著促进水稻、油麦菜等作物的生长和延缓作物衰老。

本发明所述的植物固氮细菌（Phytobacter>）DJG211具有如下形态和生理、生化特性：

a、菌体形态特性：固氮植物细菌为革兰氏阴性菌，长杆状，兼性厌氧；菌落呈乳白色，不透明，边缘圆整，表面光滑，细胞大小（长×宽）0.9～1.2× 0.6～0.9 mm。

b、菌落形态特性：菌落在NFB培养基平板上生长速度较快，菌落圆形，不透明。30℃，生长24小时，菌落直径1-3毫米。生长温度范围5℃～40℃及pH生长范围为4.0～10.0，可以生长的最佳pH值生长范围5.0～7.0，高于5%的NaCl抑制生长。

c、生理生化特性：革兰氏阴性，菌株在改良PDA液体培养基上生长产酸。淀粉水解、脲酶、甲基红试验、VP (Voges Proskauer)试验、吲哚试验、酪蛋白水解、过氧化氢酶均为阳性、硝酸还原酶、明胶液化阴性。能以D-甘露醇、乳果糖、麦芽糖、甘露糖胺、杏苷、熊果苷、α-环式糊精、D-蜜二糖、N-已酰基-D-葡萄糖胺、N-已酰基-β-D-甘露糖胺、D-甘露醇、水苷杨、β-环式糊精、i-赤藻糖醇、L-海藻糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、α-D-葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐、L-乳酸、醋乳酸、D，L-α-丙三醇磷酸盐、β-甲基-D-葡萄糖、m-酒石酸、L-尿刊酸、α-甲基-D-葡萄糖苷、m-纤维醇、麦芽三糖、3-甲基-D-葡萄糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、6-o-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-蜜三糖、D-山梨醇、水苏四糖、蔗糖、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、α-酮戊二酸、L-苹果酸、甲脂丙酮酸、D-葡糖二酸、琥珀酰胺酸、α-琥珀酸、琥珀酸甲脂、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-苏氨酸、胸苷、尿苷、胸苷-5¢-一磷酸盐、尿苷-5¢-一磷酸盐为碳源的培养基上生长。不能够利用甘油、D-甘露糖、龙胆二糖、丙酮腈酸、α-甲基-D-半乳糖苷、丙胺酸胺、L-丙氨基-组氨酸、L-谷氨酸盐、甘甘氨酰脯氨酸、氨酰-L-胺、L-甲硫氨酸为唯一碳源的培养基上生长。pH生长范围pH4.0～pH10.0；对NaCl有轻度耐受性，在低于5.0%NaCl浓度下可生长。

所述DJG211菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明要求保护所述的植物固氮细菌（Phytobacter>）DJG211在降解对硫磷中的应用。

本发明要求保护所述的植物固氮细菌（Phytobacter>）DJG211在将乙炔还原为乙烯，将空气中的氮气转化为氨，供植物利用中的应用。

本发明要求保护所述的植物固氮细菌（Phytobacter>）DJG211在促进水稻或/和油麦菜生长中的应用。

一种促进水稻或油麦菜生长的方法，将本发明所述的植物固氮细菌（Phytobacter>diazotrophicus）DJG211制备成液体或固体菌肥，将液体或固体菌肥施用于水稻或油麦菜。

一种促进水稻或油麦菜生长的菌剂，其制备方法为，将本发明所述的植物固氮细菌DJG211采用液体培养基于28℃培养48小时，得到菌数达4´10⁹CFU.mL^-1的发酵液，用蛭石作载体，将发酵液与蛭石按2：1的质量比混合，制备成菌数达1.1～2.8´10⁹>-1的菌剂。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明为一株能够降解土壤污染物、清洁土壤、提高土壤微生物多样性，从而活化土壤和内生作物组织内促进作物生长功能的固氮植物细菌。它来源于健康的普通野生稻植物组织中，能够明显促进水稻、油麦菜等作物生长。

附图说明

图1为固氮植物细菌DJG211菌株对20 mg/L对硫磷的降解率。

图2为接种固氮植物细菌DJG211菌株对含对硫磷土壤好氧细菌影响，接种量0.2g/kg土壤。

图3为接种固氮植物细菌DJG211菌株对含对硫磷土壤放线菌影响，接种量0.2g/kg土壤。

图4为固氮植物细菌促进油麦菜生长。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

本发明菌株的分离纯化方法如下：将采集的新鲜普通野生稻根样本用蒸馏水冲洗净，然后剪下根部样品置于已灭菌的培养皿中，用3%的双氧水(H₂O₂)处理4分钟（以除去根表面的腐烂物质），无菌水洗涤一次，再用0.1%的升汞(HgCl₂)处理5分钟，无菌水中振动洗涤5～7次，每次5～10分钟，并将最后一次洗涤液涂布于无氮或少氮的NFB和PDA固体培养基上，以检测消毒是否彻底。将表面消毒完全的普通野生稻根样品用已灭菌手术刀切碎，制成10^-3，10^-4，10^-5菌悬液分别涂布到NFB、PDA固体培养基表面，在30℃的人工培养箱内进行培养，整个操作过程均在无菌条件下完成。待长出菌落后，挑取单菌落再涂布平板，直至菌落的颜色、形状、透明度、质地一致。最后通过简单镜检和染色，进一步观察其形态，以宽度一致、长度均一、染色情况均一为菌株纯化标准。

保存：将分离纯化后的菌株在NFB培养基平板及斜面上培养2～3 d后，收集平板上的菌体。部分保存于15%灭菌甘油(-20 ℃日常保存)和(-80 ℃长期保存)。

本发明的固氮植物细菌（Phytobacter>）DJG211具有如下形态和生理、生化特性：

a、菌体形态特性：固氮植物细菌为革兰氏阴性菌，长杆状，兼性厌氧；菌落呈乳白色，不透明，边缘圆整，表面光滑，细胞大小（长×宽）0.9～1.2× 0.6～0.9 mm。

b、菌落形态特性：菌落在NFB培养基平板上生长速度较快，菌落圆形，不透明。30℃，生长24小时，菌落直径1-3毫米。生长温度范围5℃～40℃及pH生长范围为4.0～10.0，可以生长的最佳pH值生长范围5.0～7.0，高于5%的NaCl抑制生长。

c、生理生化特性：革兰氏阴性，菌株在改良PDA液体培养基上生长产酸。淀粉水解、脲酶、甲基红试验、VP (Voges Proskauer)试验、吲哚试验、酪蛋白水解、过氧化氢酶均为阳性、硝酸还原酶、明胶液化阴性。能以D-甘露醇、乳果糖、麦芽糖、甘露糖胺、杏苷、熊果苷、α-环式糊精、D-蜜二糖、N-已酰基-D-葡萄糖胺、N-已酰基-β-D-甘露糖胺、D-甘露醇、水苷杨、β-环式糊精、i-赤藻糖醇、L-海藻糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、α-D-葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸盐、葡萄糖-6-磷酸盐、L-乳酸、醋乳酸、D，L-α-丙三醇磷酸盐、β-甲基-D-葡萄糖、m-酒石酸、L-尿刊酸、α-甲基-D-葡萄糖苷、m-纤维醇、麦芽三糖、3-甲基-D-葡萄糖、β-甲基-D-葡萄糖苷、6-o-D-吡喃葡萄糖酰-D-呋喃果糖、D-蜜三糖、D-山梨醇、水苏四糖、蔗糖、α-羟基丁酸、β-羟基丁酸、α-酮戊二酸、L-苹果酸、甲脂丙酮酸、D-葡糖二酸、琥珀酰胺酸、α-琥珀酸、琥珀酸甲脂、L-苯基丙氨酸、L-丝氨酸、L-天冬酰胺酸、甘氨酰-L-谷氨酸、L-苏氨酸、胸苷、尿苷、胸苷-5¢-一磷酸盐、尿苷-5¢-一磷酸盐为碳源的培养基上生长。不能够利用甘油、D-甘露糖、龙胆二糖、丙酮腈酸、α-甲基-D-半乳糖苷、丙胺酸胺、L-丙氨基-组氨酸、L-谷氨酸盐、甘甘氨酰脯氨酸、氨酰-L-胺、L-甲硫氨酸为唯一碳源的培养基上生长。pH生长范围pH4.0～pH10.0；对NaCl有轻度耐受性，在低于5.0%NaCl浓度下可生长。

所述DJG211菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明DJG211菌株的分子分类地位的确定：采用细菌16S rRNA基因通用引物25f和1492r进行DNA的体外扩增，将PCR产物直接进行序列测定。将测序获得的16S rDNA序列输入GenBank进行序列Blast比对，初步确定本发明的固氮植物细菌（Phytobacter>diazotrophicus）菌株在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的固氮植物细菌（Phytobacter>）属于植物细菌属（Phytobacter），与与固氮植物细菌（Phytobacter>）的模式菌株LS8^T同源性为99.6%，但二者的序列不完全一致，有0.4%的差异，表明二者是同种内不同的菌株。结合上述的生理生化特性、16S>Phytobacter>）应归属于植物细菌属（Phytobacter）。

因此，将本发明的DJG211菌株于2017年6月5日保藏在广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为GDMCC No：60195。广东省微生物菌种保藏中心的保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2

PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加10-20g葡萄糖，充分溶解，pH自然，121°C，蒸汽灭菌30min。

以对硫磷为唯一碳源的培养基：K₂HPO₄×3H₂O>2O>4×7H₂O>3>2O>

DJG211菌株降解对硫磷的应用：将固氮植物细菌DJG211菌株在 PDA 中预培养到对数生长期，再以2%的接种量接种到5 mg/L的对硫磷培养基中适应培养24h，再将适应培养液以2%接种量接种到20 mg/L的对硫磷培养液中，培养8小时后，测定对硫磷的降解率为18.2%，以后每隔6小时测定一次降解率，直至测定到培养50小时后，降解率达到了80.5%，测定结果如图1。

实施例3

DJG211菌株提高土壤微生物多样性和土壤活性：将固氮植物细菌DJG211菌株在 PDA 中预培养到对数生长期，离心收集菌体，以葡萄糖为载体，制备含菌量约为2x10⁹/g的菌剂。使用50%对硫磷120>

实施例4

DJG211菌株促水稻生长效果：采用盆栽法试验固氮植物细菌接菌水稻中嘉早的效果。将固氮植物细菌菌株活化后，在对数生长期内，制成菌悬液10⁸细胞.mL^-1浓度处理有10天苗龄的水稻苗根部40小时，对照用无菌水处理。然后转接到装有500克水稻土的塑料杯中，每个塑料杯中再加入50mL植物少氮营养液，3个重复处理，室温下培养。每天及时观察、加水。培养观察至25天后，试验组加入相应的浓度为10⁸细胞.mL^-1的菌液40mL及50mL植物少氮营养液，对照组加入等量无菌水及50mL植物无氮营养液。继续培养观察至20天后拍照并记录，测定水稻的根长、叶长、鲜重、分蘖数、根重及干重。

植物少氮营养液组成：硫酸钙 0.046%；硝酸钙 0.003%；氯化钾 0.0075%；磷酸氢二钾0.0136%；柠檬酸铁 0.0075%；硫酸镁 0.0046%；微量元素液1ml。微量元素液配比：ZnSO₄>3BO₃>4>2MoO₄>4>2O>

固氮植物细菌DJG211接种水稻经盆栽培养45天后，拍照并测量水稻的根长、叶长、鲜重、分蘖数、根重及干重。结果见表1。由表1可以看出，固氮植物细菌DJG211接种水稻之后，与没有接种菌株的对照相比水稻的根长、叶长、根重、鲜重都达到了显著差异，对水稻有明显的促进生作用。其中根增长了52.7%，叶长增加了44.9%，鲜重增加了73.2%，根重增加了52.3%，干重增加了53.1%。

表1固氮植物细菌DJG211接种水稻后的促生效果

菌株叶长(cm)根长(cm)鲜重(g)干重(g)根重(g)CK35.07±1.02e 9.45±0.73c 1.31±0.09d 0.52±0.02c 0.1±0.02d DJG21150.82±0.81abc14.43±0.42a 4.89±0.26bc 1.11±0.05ab 0.21±0.02abc

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著（p<0.05）

实施例5

固氮植物细菌DJG211促油麦菜生长效果：将固氮植物细菌菌株活化后，在对数生长期内，离心收集菌体，用无菌蒸馏水配制成菌悬液2x10⁸细胞.mL^-1浓度喷施有7天苗龄的油麦菜，对照用无菌水喷施处理。每10平方米菜地去菌悬液10mL稀释到100mL喷施，对照用100mL无菌水喷施，15天后，效果如图4。喷施固氮植物细菌的油麦菜叶绿素含量比喷施清水对照增加15.2%，Vc含量比喷施清水对照增加11.2%，可溶性糖比喷施清水的对照增加8.2%，收获后鲜重比对照增加20.2%。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东杰士农业科技有限公司

<120> 一株植物固氮细菌DJG211及其在提高土壤和植物活力中的应用

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<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1345

<212> DNA

<213> 16S rDNA序列

<400> 1

ggtagcacag ggagcttgct ctcgggtgac gagtggggga cgggtgagta atgtctggga 60

aactgcccga tggaggggga taactactgg aaacggtagc taataccgca taatgtggca 120

agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt gccatcggat gtgcccagat gggattagct 180

tgttggtgag gtaatggctc accaaggcga caatccctag ctggtctgag aggatgacca 240

gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg 300

cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggcc ttcgggttgt 360

aaagcacttt cagcggggag gaaggtgtta aggttaataa ccttgtcgat tgacgttacc 420

cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga gggtgcaagc 480

gttaatcgga attactgggc gtaaagcgca cgcaggcggt ctgtcaagtc ggatgtgaaa 540

tccccgggct caacctggga actgcattcg aaactggcag gcttgagtct tgtagagggg 600

ggtagaattc caggtgtagc ggtgaaatgc gtaaagatct ggaggaatac cggtggcgaa 660

ggcggccccc tggacaaaga ctgacgctca ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 720

agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgtcgacttg gaggttgtgc ccttgaggcg 780

tggcttccgg agctaacgcg ttaagtcgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa 840

ctcaaatgaa ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgatgcaa 900

cgcgaagaac cttacctggt cttgacatcc acggaatttg gcagagatgc cttagtgcct 960

tcgggaaccg tgagacaggt gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgttgtg aaatgttggg 1020

ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc ctttgttgcc agcggtccgg ccgggaactc 1080

aaaggasact gccagtgata aactggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatggcc 1140

cttacgacta gggctacaca cgtgctacaa tggcatatac aaagagaagc gacctcgcga 1200

gagcaagcgg acctcataaa gtatgtcgta gtccggattg gagtctgcaa ctcgactcca 1260

tgaagtcgga atcgctagta atcgtggatc agaatgccac ggtgaatacg ttcccgggcc 1320

ttgtacacac cgcccgtcac accat 1345

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