链球菌属益生菌在预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病中的应用

摘要

本发明公开了一种链球菌属益生菌在预防和治疗糖尿病及其相关疾病中的应用，具体地，本发明的链球菌属益生菌用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途：(a)预防和/或治疗糖尿病；(b)预防和/或治疗心血管疾病；和/或(c)预防和/或治疗肥胖。本发明的链球菌属益生菌能够显著抑制体重增加、降低血清葡萄糖水平、降低血脂水平、改善胰岛素抵抗和/或降低糖化血红蛋白水平，有效减轻糖尿病及其相关疾病的病症。

说明书

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体地，本发明涉及链球菌属益生菌在预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病中的应用，也涉及包含链球菌属益生菌的组合物及其应用。

背景技术

人体内存在大量共生微生物，它们大部分寄居在人的肠道中，数量超过1000万亿(10¹⁴数量级)，是人体细胞总数的10倍以上。在漫长的进化过程中，肠道微生物与人类达成了良好的合作，对人体的营养、代谢和免疫都起着至关重要的作用，许多研究者更多地是将人体肠道微生物群落看作是人体的一个“器官”，或者是人体第二基因组，其中蕴含的海量遗传信息与人类健康密切相关。通过对糖尿病、冠心病、糖尿病、结肠癌、等数百种疾病近万种样品的研究发现，某些特定的物种与疾病呈现出显著的关联，这些结果在疾病的临床评定和诊断以及后期的干预治疗提供了一个全新的方向。

糖尿病已经成为世界上继肿瘤、心脑血管病之后第三位严重威胁人健康的慢性病。同时，它将严重影响人的心脑血管和肾脏。随着经济的快速发展和生活方式的不断提高，我国的糖尿病等代谢性疾病的发病率急剧上升，已成为影响人类健康的主要威胁。国际糖尿病联盟最新数据显示，糖尿病人发病率1994年为2.5％，2002增长为5.5％，到2008年达9.7％。目前，中国的糖尿病发病率已经与经济发达的美国相当，大城市糖尿病的发病率已经达到9-10％。2005年，世界卫生组织发布的报告中指出，从2005年到2015年，由于心脏病、中风和糖尿病导致过早死亡而将损失的国民收入大约为3.9万亿人民币。因此，研究导致糖尿病主要病因，并建立强有力和易推广的干预措施，遏制人群中糖尿病发病率的上升趋势，已成为中国生物医学、营养学领域中亟待解决的科学问题。

在患有糖尿病的人群中，90％以上是II型糖尿病。II型糖尿病是由于血糖自平衡失调而表现高血糖症状的慢性综合疾病，在发病过程中碳水化合物和脂肪代谢紊乱，影响全身各器官组织的正常生理活动。II型糖尿病的病理成因较多样化，一般认为是由于先天的遗传因素和后天的环境因素共同作用的。对于这些方面的研究有很多，但都不能很好的解释II型糖尿病的发生以及致病机理。

目前本领域还没有一种有效的、副作用小的预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病的方法和药物。

因此本领域迫切需要开发一种的新的、无毒副作用的，用于预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病的药物。

发明内容

本发明的一个目的是提供链球菌属益生菌在预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病方面的用途。

本发明的另一目的是提供一种有效的无毒副作用的，用于预防和/或者治疗糖尿病及其相关疾病的药品、饮料、食品组合物，或动物饲料组合物。

本发明的另一目的是提供一种降低血清葡萄糖、血脂和/或糖化血红蛋白水平的方法及其应用。

本发明第一方面提供了一种链球菌属益生菌(Streptococcus)的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途：(a)预防和/或治疗糖尿病；(b)预防和/或治疗心血管疾病；和/或(c)预防和/或治疗肥胖，

在另一优选例中，所述链球菌属益生菌选自下组：婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、或其组合。

在另一优选例中，所述婴儿链球菌(Streptococcus infantis)选自下组：Streptococcus infantis DSM 12492、Streptococcus infantis ATCC BAA-208、Streptococcus infantis ATCC 700780、或其组合。

在另一优选例中，所述前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)选自下组：Streptococcus vestibularis DSM 5636、Streptococcus vestibularis ATCC 49126、Streptococcus vestibularis ATCC 20125、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物选自下组：食品组合物、保健组合物、药物组合物、饮料组合物、饲料组合物、或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物为口服制剂。

在另一优选例中，所述的组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。

在另一优选例中，所述的组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、和舌下含片。

在另一优选例中，所述的食品组合物包括乳液制品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。

在另一优选例中，所述的食品组合物包括乳品、乳粉、或乳液。

在另一优选例中，所述的液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。

本发明第二方面提供了一种链球菌属益生菌的用途，用于制备组合物或制剂，所述组合物或制剂用于选自下组的一种或多种用途：(i)降低哺乳动物血清葡萄糖水平；(ii)改善哺乳动物胰岛素抵抗；和/或(iii)降低哺乳动物糖化血红蛋白(HbA1c)水平。

在另一优选例中，所述链球菌属益生菌选自下组：婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物或制剂还独立地或额外地用于选自下组的一种或多种用途：

(iv)抑制哺乳动物的体重增长；

(v)降低哺乳动物的血脂水平。

在另一优选例中，所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述非人哺乳动物包括啮齿动物，如大鼠、小鼠。

在另一优选例中，所述降低哺乳动物的血脂水平包括降低血清甘油三酯水平。

本发明第三方面提供了一种用于治疗和/或预防糖尿病的组合物，所述组合物包括：(i)安全有效量的链球菌属益生菌；和(ii)食品上或药学上可接受的载体；其中，所述链球菌属益生菌选自下组：婴儿链球菌(Streptococcusinfantis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、或其组合。

在另一优选例中，所述链球菌属益生菌选自下组：婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、或其组合。

在另一优选例中，所述婴儿链球菌(Streptococcus infantis)选自下组：Streptococcus infantis DSM 12492、Streptococcus infantis ATCC BAA-208、Streptococcus infantis ATCC 700780、或其组合。

在另一优选例中，所述前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)选自下组：Streptococcus vestibularis DSM 5636、Streptococcus vestibularis ATCC 49126、Streptococcus vestibularis ATCC 20125、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物选自下组：食品组合物、保健组合物、药物组合物、饮料组合物、饲料组合物、或其组合。

在另一优选例中，所述组合物含有1×10-1×10²⁰cfu/mL或cfu/g的链球菌属益生菌，较佳地1×10⁴-1×10¹⁵cfu/mL或cfu/g的链球菌属益生菌，以所述组合物的总体积或总重量计。

在另一优选例中，所述的组合物中，含有0.0001-99wt％，较佳地0.1-90wt％所述的链球菌属益生菌，以所述组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的组合物为单元剂型(一片、一粒胶囊或一小瓶)，每个单元剂型中所述组合物的质量为0.05-5g，较佳地为0.1-1g。

另一优选例中，所述的组合物还含有其它益生菌和/或益生元。

在另一优选例中，所述的其他益生菌选自下组：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或其组合。

在另一优选例中，所述的益生元选自下组：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、或其组合。

本发明第四方面提供了一种本发明第三方面所述组合物的制法，包括步骤：

将(i)链球菌属益生菌、与(ii)食品上或药学上可接受的载体混合，从而形成本发明第三方面所述的组合物，其中，所述链球菌属益生菌选自下组：婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物为口服制剂。

本发明第五方面提供了一种降低血清葡萄糖、血脂和/或糖化血红蛋白水平的方法，给所述对象施用(i)链球菌属益生菌或本发明第三方面所述的组合物，其中，所述链球菌属益生菌选自下组：婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、或其组合。

在另一优选例中，所述的施用包括口服。

在另一优选例中，所述的施用剂量为0.01-5g/50kg体重/天，较佳地，0.1-2g/50kg体重/天。

在另一优选例中，所述方法还用于改善胰岛素抵抗。

在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物，如人。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了灌胃婴儿链球菌后各组小鼠的体重增长情况。

图2显示了灌胃前庭链球菌后各组小鼠的体重增长情况。

图3显示了灌胃组合菌后各组小鼠的体重增长情况。

图4显示了灌胃婴儿链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平的影响。

图5显示了灌胃前庭链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平的影响。

图6显示了灌胃组合菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平的影响。

图7显示了灌胃婴儿链球菌对糖尿病模型小鼠的血清葡萄糖水平的影响。

图8显示了灌胃前庭链球菌对糖尿病模型小鼠的血清葡萄糖水平的影响。

图9显示了灌胃组合菌对糖尿病模型小鼠的血清葡萄糖水平的影响。

图10显示了灌胃婴儿链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

图11显示了灌胃前庭链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

图12显示了灌胃组合菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

图13显示了灌胃婴儿链球菌对糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

图14显示了灌胃前庭链球菌对糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

图15显示了灌胃组合菌对糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究和实验，意外地发现，链球菌属益生菌具有预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病的作用，将含有链球菌属益生菌的活性组合物喂食实验对象，发现该组合物能够抑制体重增加、降低血清葡萄糖水平、降低血脂水平、改善胰岛素抵抗和/或降低糖化血红蛋白水平，有效减轻糖尿病及其相关疾病(如心血管疾病、肥胖)的病症。在此基础上完成本发明。

如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明的链球菌属益生菌及其应用

如本文所用，所述“本发明的链球菌属益生菌”指链球菌属益生菌中多个菌的一个或多个混合。

在本发明的一个优选例中，所述链球菌属益生菌选自下组：婴儿链球菌(Streptococcus infantis)、前庭链球菌(Streptococcus vestibularis)、或其组合。

链球菌属(Streptococcus)是链球菌科(Streptococcaceae)的1个属，为一类球形的革兰氏阳性细菌。这些细菌细胞分裂时总是沿一个轴，所以通常成对或者链状的。因为这些特征，他们被称作“链球菌”，区别于可以沿多个轴分裂而形成一团细胞的“葡萄球菌”(Staphylococcus)。

婴儿链球菌是兼性厌氧菌，革兰氏染色呈阳性，不产生芽孢，不能运动，不产生接触酶。细胞呈球状，直径约0.6-1.0mm，呈单个分散形态或者链状形态生长。

前庭链球菌是微需氧菌，革兰氏染色呈阳性，不产生接触酶。细胞呈球状，直径约1μm，呈链状形态生长。

本发明提供了链球菌属益生菌在预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病方面的应用。链球菌属益生菌具有：a)抑制体重增加；(b)降低血清葡萄糖水平；(c)降低血脂水平；(d)改善胰岛素抵抗；和/或(e)降低糖化血红蛋白水平的能力。

根据本发明的一个优选例，经链球菌属益生菌灌胃的被喂以高脂肪食物的C57BL/6J雄性小鼠，与未接受灌胃的对照组相比，其体重增加幅度减缓，各种与糖尿病及其相关疾病(如心血管疾病、肥胖)相关的指标增加的幅度被抑制，如血清葡萄糖水平、血脂水平和糖化血红蛋白水平，并且胰岛素抵抗显著得到改善。

根据本发明的另一个优选例，经链球菌属益生菌治疗的糖尿病模型C57BL/6J雄性小鼠，与未接受治疗的对照组相比，其与糖尿病及其相关疾病(如心血管疾病)相关的指标显著下降，如血清葡萄糖水平、血脂水平和糖化血红蛋白水平，并且胰岛素抵抗显著得到改善。

因此，本发明的链球菌属益生菌能够用以预防和/或治疗糖尿病及其相关疾病(如心血管疾病、肥胖)。

组合物及其应用

本发明还提供了一种组合物，优选地，为药物组合物。所述组合物包括有效量的链球菌属益生菌，在一个优选例中，所述组合物还包括选自下组的益生菌：乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、或其组合；和/或选自下组的益生元：低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(GOS)、低聚木糖(XOS)、低聚乳果糖(LACT)、大豆低聚糖(SOS)、菊粉(Inulin)、或其组合。

在一优选例中，所述的组合物为液态制剂、固态制剂、半固态制剂。

在一优选例中，所述的液态制剂选自下组：溶液制品或悬浮液制品。

在一优选例中，所述的组合物的剂型选自下组：粉末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、和舌下含片。

本发明药物组合物可以以药物片剂，针剂或胶囊的任一种形式给药，所述药物制剂包括赋形剂、药物允许的媒介和载体，这些物质可根据给药途径进行选择。本发明中药物制剂可进一步包含辅助的活性组份。

乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、细结晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁或矿物油等都可用作本发明中药物组合物的载体、赋形剂或稀释剂等。

此外，本发明的药物组合物可进一步包括润滑剂、润湿剂、乳化剂、悬浮液稳定剂、防腐剂、甜味剂和香料等。本发明的药物组合物可通过多种公知的方法以肠衣制剂生产，以便于药物组合物的活性成分即微生物能顺利通过胃而不被胃酸所破坏。

另外，本发明的微生物可以常规方法制备的胶囊形式使用。例如，标准赋形剂和本发明的冷干微生物混合制成小球药丸，然后将药丸装填入明胶胶囊中。此外，本发明的微生物和药物允许使用的赋形剂如液体胶、纤维素、硅酸盐或矿物油等混合制作悬浮液或分散液，这种悬浮液或分散液可装入软的明胶胶囊中。

本发明的药物组合物可制成肠衣片供口服使用。本申请中的术语—“肠衣”，包括所有常规药物允许使用的包衣，这些包衣不被胃酸降解，但在小肠中能充分分解并快速释放出本发明的微生物。本发明的肠衣能在合成胃酸如pH＝1的HCl溶液中在36-38℃维持2小时以上，并优选在合成肠液如pH＝7.0的缓冲液中在1.0小时内分解。

本发明的肠衣为以每片约16-30mg进行包衣，较佳地16-25mg，更佳地16-20mg进行包衣。本发明中肠衣厚度为5-100μm，理想的厚度为20-80μm。肠衣成分选自己公开知晓的常规聚合物。

本发明优选的肠衣由纤维素乙酸邻苯二甲酸酯聚合物或偏苯三酸酯聚合物以及异丁烯酸的共聚物(例如，含有40％以上异丁烯酸和含有甲基纤维素邻苯二甲酸羟丙酯或其酯类衍生物的异丁烯酸的共聚物)制备。

本发明中肠衣所使用的纤维素乙酸邻苯二甲酸酯的粘度为约45-90cp，乙酰含量17-26％，邻苯二甲酸含量30-40％。用于肠衣中的纤维素乙酸偏苯二酸酯粘度为约5-21cp，乙酞含量17-26％。纤维素乙酸偏苯三酸酯由Eastman科达公司生产，可用于本发明中的肠衣材料。

用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酷，分子量一般为20,000-130,000道尔顿，理想分子量为80,000-100,000道尔顿，羟丙基含量为5-10％，甲氧基含量为18-24％，邻苯二甲酰基含量为21-35％。

用于本发明肠衣中的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酷为HP50，由日本Shin-Etsu Chemidnl Co.Ltd.生产。HP50含有6-10％羟丙基，20-24％甲氧基，21-27％的丙基，其分子量为84,000道尔顿。另一种肠衣物质为HP55，HP55含有5-9％的羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，18-22％甲氧基，27-35％的邻苯二甲酸，其分子量为78,000道尔顿。

本发明肠衣如下制备：使用常规方法将肠衣溶液喷雾到核心上。该肠包衣方法中所有溶剂为醇类(如乙醇)、酮类(如丙酮)、卤代烃化合物(如二氯甲烷)、或其组合物。将软化剂如二-正丁基邻苯二甲酸酯和三乙酸甘油酯加入到肠衣溶液中，其比例为1份包衣物对约0.05份或约0.3份软化剂。喷雾方法优选连续执行，所喷雾的料量可根据包衣所采用的条件进行控制。喷雾压力可随意调节，一般而言，能在平均1-1.5帕压力下获得理想的结果。

说明书中“药物有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。比如，在本发明中，可制备含有1×10-1×10²⁰cfu/ml或cfu/g(特别的，可含有1×10⁴-1×10¹⁵cfu/ml或cfu/g；更特别地，可含有1×10⁶-1×10¹¹cfu/ml或cfu/g)的链球菌属益生菌的制剂。

当用于制备药物组合物时，所用的链球菌属益生菌(如婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合)，和/或其代谢产物的有效剂量可随施用的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约1×10-1×10²⁰cfu/ml或cfu/g(特别的，可含有1×10⁴-1×10¹⁵cfu/ml或cfu/g；更特别地，可含有1×10⁶-1×10¹¹cfu/ml或cfu/g)的活性链球菌属益生菌，或其发酵产生的活性成分。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

所述的链球菌属益生菌可通过口服等途径给予。固态载体包括：淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括：培养基、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合链球菌属益生菌特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。

从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。口服给药是优选的。

将本发明组合物施用给所述个体，每天给药1次或多次。给药剂量单位表示其形式上能分开且适用于人类或其他所有哺乳动物个体的剂量。每一单位含有药物允许的载体和有效治疗量的本发明微生物。给药量随病人的体重和糖尿病严重程度、所包括的补充活性组份和所使用的微生物而变化。此外如可能，可分开给药，并且如需要可连续给药。因此，所述给药量不会对本发明造成限制。此外，本发明中的“组合物”不仅意味着药品而且表示可作为功能性食品和健康补充食品。在一个优选例中，所述组合物包括：饮料、食品、药品、动物饲料等。

在本发明的一个优选例中，还提供了一种食品组合物，它含有有效量的链球菌属益生菌，以及余量的食品上可接受的载体，所述的食物组合物的剂型选自固体、乳品、溶液制品、粉末制品、或悬浮液制品。

在一优选例中，所述组合物的配方如下：

1×10-1×10²⁰cfu/mL的链球菌属益生菌；以及食品上或药学上可接受的载体，和/或赋形剂。

在另一优选例中，所述组合物的配方如下：

1×10⁶-1×10¹¹cfu/mL的链球菌属益生菌；以及食品上或药学上可接受的载体，和/或赋形剂。

降低血清葡萄糖、血脂和/或糖化血红蛋白水平的方法

在另一优选例中，所述方法包括：摄取本发明的药物组合物、食品组合物、饮料组合物、或其组合。所述实验对象为人。

在另一优选例中，所述方法包括：摄取本发明的药物组合物、食品组合物、或动物饲料，或其组合。所述实验对象为动物，较佳地为鼠类，兔类。

在另一优选例中，所述方法还用于改善胰岛素抵抗。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的链球菌属益生菌能够显著抑制体重增加。

(b)本发明的链球菌属益生菌能够显著抑制血清葡萄糖水平、血脂水平和/或糖化血红蛋白水平的升高，改善胰岛素抵抗，从而预防糖尿病及其相关疾病(如心血管疾病、肥胖)。

(c)本发明的链球菌属益生菌能够显著降低升高的血清葡萄糖水平、血脂水平和/或糖化血红蛋白水平，改善胰岛素抵抗，从而治疗糖尿病及其相关疾病(如心血管疾病、肥胖)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照《微生物：实验手册》(James Cappuccino和Natalie Sherman编，Pearson Education出版社)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1含链球菌属益生菌(如婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合)的食品组合物

原料配比如表1。

表1食品组合物配方

原料质量百分比(％)菌组分0.5牛奶90.0白糖9.5

配方1-6中的菌组分为单细菌组分，分别含有Streptococcus infantis DSM12492、Streptococcus infantis ATCC BAA-208、Streptococcus infantis ATCC700780、Streptococcus vestibularis DSM 5636、Streptococcus vestibularis ATCC49126、Streptococcus vestibularis ATCC 20125。

配方7中的菌组分为上述6种菌的任意两种的混合物(重量比为1:1)。

按照上述配方比例混合牛奶、白糖，搅拌至完全混合，预热，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌5-10分钟，冷却至40-43℃，接种1-100×10⁶cfu/g的菌组分，即制成含菌组分(如婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合)的食品组合物。

实施例2

含链球菌属益生菌(如婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合)的药物组合物

原料配比见表2。

表2药物组合物配方

原料质量百分比(％)菌组分1.0％乳糖2.0％酵母粉2.0％蛋白胨1.0％纯净水94.0％

配方1-6中的菌组分为单细菌组分，分别含有Streptococcus infantis DSM12492、Streptococcus infantis ATCC BAA-208、Streptococcus infantis ATCC700780、Streptococcus vestibularis DSM 5636、Streptococcus vestibularis ATCC49126、Streptococcus vestibularis ATCC 20125。

配方7中的菌组分为上述6种菌的任意两种的混合物(重量比为1:1)。

按照比例将乳糖、酵母粉、蛋白胨以纯净水混合均匀，预热到60-65℃，20Mpa压力均质，90℃左右杀菌20-30分钟，冷却至36-38℃，接入菌组分(1-50×10⁶cfu/mL)，36-38℃发酵至pH值为6.0，离心，冷冻干燥至水份含量小于3％，即制备含菌组分的冷冻干燥物。称取0.5克含菌组分的冷冻干燥物与麦芽糊精等量混合后装入胶囊中，即制成含菌组分(如婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合)的药物组合物。

实施例3动物实验验证

实验材料:

小鼠：购买C57BL/6J雄性小鼠(4周龄，购自中山大学实验动物中心)，小鼠生长过程处于同一环境，且喂养同样的食物。

发明人从保藏机构获得6株链球菌，并保存于深圳华大基因研究院。同时，选取罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)，购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M207154，作为对照组(LR组)，于MRS培养液中，37℃培养24-48h。

其中，上述6株链球菌的来源信息如表3所示。所有菌株于胰酪胨大豆酵母浸膏培养液(DSMZ Medium 92)中，37℃厌氧培养24-48h。所有菌株经16S rDNA测序鉴定无误后开始实验。

菌株信息见表3。

表3菌株信息

ATCC:American Type Culture Collection，美国典型培养物保藏中心；

DSMZ:Leibniz-Institute DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen GmbH，德国微生物菌种保藏中心。

高脂肪食物：含60％脂肪、20％碳水化合物及20％蛋白，购自美国ResearchDiets公司(D12492)。

普通维持饲料：购自中山大学实验动物中心。

实验方法：

实验一：

为了验证菌株对喂食不同食物的小鼠的影响，取正常雄性C57BL/6J小鼠(4周龄，购自中山大学实验动物中心)饲养于鼠笼中，鼠笼置于可控环境中：每日光照12h，保持温度22℃。小鼠可自由进食及饮水，适应性饲养2周后随机分组，分别为对照组(CK)，实验菌剂组(菌1组，菌2组，菌3组，菌4组，菌5组，菌6组，菌2+菌3组，菌4+菌6组，菌1+菌4组)，对照菌剂组(LR，Lactobacillusreuteri GMNL-89)和高脂肪食物组(HF)，每组10只。LR组、HF组和实验菌剂组喂食高脂肪食物，CK组喂食普通维持饲料。实验菌剂组和LR组分别用胃管灌胃0.2ml相应菌株菌液(10⁸CFU/0.2ml)；HF组和CK组灌胃等量生理盐水，持续8周，每周测量一次体重(结果见图1-3和表4-6)。

实验二：

为了验证菌株对糖尿病模型小鼠的影响，取正常雄性C57BL/6J小鼠(4周龄，购自中山大学实验动物中心)饲养于鼠笼中，鼠笼置于可控环境中：每日光照12h，保持温度22℃。小鼠可自由进食及饮水，适应性饲养2周改喂高脂肪食物，持续8周。在第4周时，均连续两天腹膜注射阿脲(60mg/kg alloxan)，在此接下来的4周之后，选取禁食血糖含量高于10.0mmol/L的小鼠，随机分组，分别为实验菌剂组(菌1组，菌2组，菌3组，菌4组，菌5组，菌6组，菌2+菌3组，菌4+菌6组，菌1+菌4组)，对照菌剂组(LR)和糖尿病模型组(DM)，每组10只。实验菌剂组和LR组分别灌胃0.2ml相应菌株菌液(10⁶～10⁸CFU/0.2ml)；DM组灌胃等量生理盐水，持续8周，所有小鼠喂食相同高脂肪食物，并处于相同生活环境下。

血液参数

小鼠空腹16小时后，分别从眼球后及眼眶内的毛细血管中抽取血液，并立即放入4℃冰箱保存。分离血浆后保存至-20℃备用。利用葡萄糖仪(购自罗氏诊断(Roche Diagnostics))测定血清葡萄糖基线水平；利用酶反应-分光温度计测定藕联试剂盒测定血清甘油三脂水平；利用ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定血清胰岛素水平和糖化血红蛋白(HbA1c)水平。

数据统计分析

数据结果以平均值±标准差表示。经方差分析(ANOVA)后利用Tuckey多重比较方法(GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚洲，美国)(GraphPad Software,San Diego,CA,USA)进行显著性分析，p<0.05即认为统计学上差异显著。

实验结果：

(1)婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合对鼠体重的影响。

表4灌胃婴儿链球菌后各组小鼠的体重增长情况(图1)

注：表中数据为平均值±标准差，对于每一列的任意两组数据，数字后面没有相同字母表示差异显著(p<0.05)，表5-18与此相同。

表5灌胃前庭链球菌后各组小鼠的体重增长情况(图2)

表6灌胃组合菌后各组小鼠的体重增长情况(图3)

肥胖是胰岛素抗性的一个主要危险因素(Seamus Crowe,et al.PigmentEpithelium-Derived Factor Contributes to Insulin Resistance in Obesity.CellMetabolism,Volume 10,Issue 1,40-47,doi:10.1016/j.cmet.2009.06.001，通过参照并入本文)，而且可以诱导II型糖尿病，因此，控制肥胖有助于预防II型糖尿病。

结果如表4-6和图1-3所示。结果显示，在小鼠的生长曲线中，通过8周的喂养，仅喂食高脂肪食物小鼠的体重显著高于喂食普通维持饲料小鼠的体重(p<0.05)；同时喂食本发明链球菌属益生菌(婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合)和高脂肪食物的小鼠体重显著低于仅喂食高脂肪食物的小鼠(p<0.05)；并且，喂食本发明链球菌属益生菌的小鼠体重显著低于喂食罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri GMNL-89)的小鼠体重(p<0.05)。

结果表明，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合可以有效控制小鼠肥胖发生率并有助于预防II型糖尿病，且效果显著优于罗伊氏乳杆菌。

(2)婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合对喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平的影响。

表7灌胃婴儿链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平的影响(图4)

表8灌胃前庭链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平的影响(图5)

表9灌胃组合菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平的影响(图6)

结果如表7-9和图4-6所示。在实验一进行之前，各组小鼠(6周龄)的血清葡萄糖含量为均没有差异(p>0.05)。结果显示，实验处理8周后，保持普通维持饲料喂食的CK组小鼠血清葡萄糖含量没有明显变化；而喂食高脂肪食物的HF组小鼠血清葡萄糖含量大幅度增加；婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合处理组小鼠血清葡萄糖含量虽然高于正常喂食的CK组小鼠，但是却显著低于仅喂食高脂肪食物的HF组小鼠(p<0.05)；并且，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合处理组小鼠的血清葡萄糖含量显著低于罗伊氏乳杆菌处理组小鼠(p<0.05)。

结果表明，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合可显著降低喂食高脂肪食物小鼠的血清葡萄糖水平，且效果显著优于罗伊氏乳杆菌。

(3)婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合对糖尿病模型小鼠血清葡萄糖水平的影响。

表10灌胃婴儿链球菌对糖尿病模型小鼠血清葡萄糖水平的影响(图7)

表11灌胃前庭链球菌对糖尿病模型小鼠血清葡萄糖水平的影响(图8)

表12灌胃组合菌对糖尿病模型小鼠血清葡萄糖水平的影响(图9)

结果如表10-12和图7-9所示。在糖尿病模型小鼠实验(实验二)进行之前，所有组小鼠(14周龄)的血清葡萄糖均没有差异。结果显示，实验处理4周后，糖尿病模型组(DM组)小鼠的血清葡萄糖含量明显升高，而同时添加菌剂的小鼠的血清葡萄糖含量低于对照组。8周后，同时喂食菌剂的小鼠的血清葡萄糖含量显著低于DM组(p<0.05)；并且，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合处理组小鼠的血清葡萄糖含量显著低于罗伊氏乳杆菌处理组小鼠(p<0.05)。

结果表明，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合可以显著降低糖尿病模型小鼠血清葡萄糖含量，且效果显著优于罗伊氏乳杆菌。

(4)婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合对喂食高脂肪食物小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

表13灌胃婴儿链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响(图10)

表14灌胃前庭链球菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响(见图11)

表15灌胃组合菌对喂食高脂肪食物小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响(见图12)

结果如表13-15和图10-12所示。在实验一进行之前，正常小鼠(6周龄)的血清甘油三脂、胰岛素和HbA1c水平在所有组中均没有差异。结果显示，实验处理8周后，保持普通维持饲料喂食的小鼠血液参数依旧没有差异，而喂食高脂肪食物的小鼠(HF组)血清甘油三脂、胰岛素和HbA1c水平均显著增高，用婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合处理组小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和HbA1c水平均显著低于仅喂食高脂肪食物小鼠；并且，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合处理组小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平显著低于罗伊氏乳杆菌处理组小鼠(p<0.05)。

结果表明，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合可显著降低喂食高脂肪食物小鼠血清甘油三脂和HbA1c水平，并可显著改善胰岛素抵抗，且效果显著优于罗伊氏乳杆菌。

(5)婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合对糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平的影响。

表16灌胃婴儿链球菌对糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和HbA1c水平的影响(图13)

表17灌胃前庭链球菌对糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和HbA1c水平的影响(图14)

表18灌胃组合菌对糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和HbA1c水平的影响(图15)

结果如表16-18和图13-15所示。结果显示，用婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合处理8周后的小鼠，其血清甘油三脂、胰岛素和HbA1c水平均显著低于DM组小鼠；并且，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合处理组糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂、胰岛素和糖化血红蛋白(HbA1c)水平显著低于罗伊氏乳杆菌处理组糖尿病模型小鼠(p<0.05)。

结果表明，婴儿链球菌、前庭链球菌、或其组合可以显著降低糖尿病模型小鼠的血清甘油三脂和HbA1c含量，并显著改善胰岛素抵抗，且效果显著优于罗伊氏乳杆菌。

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