抑制心肌肥厚的重组蛋白基因及其表达产物和应用

摘要

本发明公开了一种重组蛋白基因和包含该基因的重组质粒，以及该重组质粒表达蛋白的制备及应用。该重组AGGF1蛋白能通过抑制心肌肥厚小鼠心脏的肥厚，改善小鼠心功能，抑制心肌细胞凋亡和心脏纤维化，最终抑制心衰。因此，所述重组AGGF1蛋白能制备抗心肌肥厚药物，用于心肌肥厚疾病和心衰的治疗。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，更具体地，涉及一种重组蛋白及其应用。

背景技术

心肌肥厚是机体对生理及病理上压力所产生的一种适应性应答，它是心血管疾病患病病人死亡率升高的一个独立危险因素。心脏为了应答压力负荷，个体的心肌细胞开始机械性的拉伸并且激活细胞内的促肥厚信号途径，导致胚胎期的转录因子再次被激活，并且各种蛋白质的合成增多，如各种结构蛋白及收缩相关蛋白。这些蛋白合成增多会导致心肌结构紊乱，心脏收缩力降低，氧耗增多，供血不足，最终会导致心力衰竭，心律失常或者猝死等。

诸如高血压，心肌梗死，心脏瓣膜病变，动脉粥样硬化及一些遗传性心脏病都会导致心肌肥厚的发生，往往我们认为心肌肥厚是不可逆的。因此，如何有效控制心肌肥厚的发生，成为了临床干预的基础。探明心肌肥厚疾病分发病机理及寻找有效的干预方法，具有重要的临床及研究意义。

发明内容

针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种重组蛋白及其应用，其目的在于通过所述重组蛋白制备抗心肌肥厚及心衰的药物，有效控制心肌肥厚的发生和临床干预。

为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种抑制心肌肥厚的重组蛋白基因AGGF1，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。

按照本发明的另一方面，提供了一种抑制心肌肥厚的重组蛋白基因AGGF1的克隆方法，使用SEQ ID NO：3所示的正向引物和SEQ ID NO：4所示的反向引物,应用PCR方法从人的cDNA中克隆得到AGGF1基因。

按照本发明的另一方面，提供了一种表达抑制心肌肥厚的重组蛋白的重组质粒，该质粒由以下步骤制得：

(1)将AGGF1基因与His标签序列连接，所述AGGF1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列；

(2)将步骤(1)中得到的连接有His标签序列的AGGF1基因序列插入到表达载体的多克隆酶切位点处，得到重组质粒。

优选地，所述的表达载体为pet28a。

按照本发明的另一方面，提供了一种抑制心肌肥厚的重组蛋白，该蛋白的氨基酸序列为：

(1)由SEQ ID NO：2氨基酸序列所示；或

(2)与序列SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID NO：2限定的氨基酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸，具有与序列SEQ ID No：2序列所示的蛋白质具有同等活性的氨基酸序列。

按照本发明的另一方面，提供了一种抑制心肌肥厚的重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)将人源AGGF1基因与His标签序列连接后，插入到原核表达载体pet28a的多克隆酶切位点处，构建含有AGGF1基因的重组质粒pet28a-AGGF1，所述AGGF1基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列；；

(2)将步骤(1)所述的的重组质粒转染进入原核细胞，并通过抗生素抗性筛选，得到具有抗生素抗性的阳性细胞克隆；

(3)将步骤(2)中得到的阳性细胞克隆扩增培养后，分离纯化后得到所述的抑制心肌肥厚的重组蛋白。

按照本发明的另一方面，提供了一种抑制心肌肥厚的重组蛋白的应用，其特征在于，应用于制备抗心肌肥厚或抗心衰药物。

按照本发明的另一方面，提供了一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求4所述的多肽和药学上可接受的赋形剂。

按照本发明的另一方面，提供了一种如权利要求7所述的药物组合物的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求4所述的多肽与至少一种药学上可接受的赋形剂混合。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，本发明提供的重组AGGF1蛋白能通过阻断心肌细胞凋亡通路来保护心肌细胞，提高左心室射血分数和左心室缩短分数，抑制心肌肥厚，最终抑制心衰的发生。因此，本发明含有His标签的重组AGGF1蛋白能制备抗心肌肥厚及心衰药物，用于心肌肥厚疾病的治疗。

附图说明

图1是实施例3假手术组，对照治疗组及AGGF1治疗组心肌肥厚小鼠的心脏心态学染色；

图2是实施例3假手术组，对照治疗组及AGGF1治疗组的心肌肥厚小鼠心功能参数；图2A是射血分数，图2B是缩短分数；

图3是实施例3重组AGGF1蛋白抑制心肌梗死导致的心脏纤维化结果；

图4是实施例3的光学显微镜下的TUNEL实验结果图；

图5是实施例3的TUNEL实验结果统计数据。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

为了去有效控制心肌肥厚的发生及临床干预。探明心肌肥厚疾病分发病机理及寻找有效的干预方法。本发明提供一种体外纯化的重组蛋白，即AGGF1蛋白，制备抗心肌肥厚药物，具有治疗心肌肥厚并且抑制心衰的效果。本发明提供的一种重组蛋白，编码所述重组蛋白的核酸序列为：

(1)由SEQ ID No.1所示的核酸序列编码的蛋白质；或

(2)与序列SEQ ID No.1限定的核酸序列同源性在80％至100％编码相同功能蛋白质的核酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的核酸序列经增加、缺失或替换一个或多个氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的序列。

所述重组蛋白命名为AGGF1蛋白，其编码基因通过基因连锁定位分析，在先天性静脉畸形骨肥大综合征(Klippel-Trenaunay syndrome，简称KTS)中发现并克隆出的新基因。AGGF1蛋白在内皮细胞，平滑肌细胞及成骨细胞中有着极高的表达量。并且在各种组织的血管中，都能检测到AGGF1的较高表达量。鸡胚绒毛实验研究发现，重组的AGGF1蛋白和VEGF一样，有强烈的促血管生成能力。并且AGGF1裸质粒注射能显著提高后肢缺血小鼠的缺血后肢血流灌注并且抑制缺血后肢的组织坏死。使用AGGF1的纯化蛋白治疗急性心肌梗死小鼠，能提高小鼠生存率和心功能。

实施例1

AGGF1重组蛋白的制备

在大肠杆菌BL21中表达AGGF1蛋白表达质粒pet28-AGGF1，其中AGGF1序列如SEQNO.1所示。将表达菌株在20ml卡那霉素抗性的LB培养基中过夜培养。第二天，将这20ml培养基加入到1L卡那霉素抗性的LB培养基中，37℃摇床培养2.5小时。然后加入1mM的IPTG诱导蛋白表达。IPTG是一种高度稳定的乳糖类似物，它可以抑制lac阻遏蛋白，诱导β-半乳糖苷酶的合成。这种酶能促进乳糖的利用。IPTG能用来诱导被lac操纵子调控的目的基因的表达。加入IPTG诱导后，大肠杆菌在培养基中继续生长5.5小时。再离心培养基，4000rpm，4℃，10mins。如果不立即分离蛋白，则把大肠杆菌沉淀储存在-20℃。纯化重组蛋白采用的是QIAexpressionist高水平表达和六联组氨酸标记蛋白纯化手册(Qiagen)。配制6ml缓冲液(50mM NaH₂PO₄,300mMNaCl,20mMimidazole,0.05％Tween-20,pH8.0)，加入蛋白酶抑制剂混合物(6μg/ml>2PO₄,300mM>

实施例2

AGGF1同源重组蛋白制备

对含有AGGF1重组蛋白质氨基酸序列有100％，99％，98％，97％，96％，95％，94％，93％，92％，91％，90％，89％，88％，87％，86％，85％，84％，83％，82％、81％及80％同源性的蛋白质(通过AGGF1蛋白序列截短或者突变获得的同源性蛋白)制备。以真核表达的pcDNA3.1-AGGF1为模板，PCR扩增出AGGF1基因的全长和各个截短片段，所获得的各截短片段经双酶切后克隆至pet28蛋白表达质粒中，将构建的AGGF1全长以及各截短质粒转化入Ecoli BL21中,采用IPTG诱导AGGF1基因截短融合蛋白表达,采用Western blotting法鉴定AGGF1基因截短融合蛋白的表达。制备方法同实施例1。

实施例3

实施例1中合成的重组蛋白促血管生成效果及在制备抗心肌梗死药物中的应用

将C57BL/6小鼠分为4组：假手术组给安慰剂组(Sham+PBS)，假手术给AGGF1蛋白组(Sham+AGGF1)，心肌肥厚手术给安慰剂组(TAC+PBS)，心肌肥厚手术给重组AGGF1蛋白组(TAC+AGGF1),每组小鼠12只。PBS为磷酸缓冲液。在手术前及心肌肥厚手术后，用小动物超声成像系统对小鼠的心功能进行评估。手术后一天，小鼠用超声检测，确定细节肥厚手术成功。手术成功2周后，通过小鼠尾静脉注射重组AGGF1蛋白或者相同剂量的PBS做为对照，一周两次，持续4周。蛋白给药剂量为0.25mg/kg。

如图1所示：对比用重组AGGF1蛋白治疗的心肌肥厚小鼠及使用对照PBS治疗的心肌肥厚小鼠心脏，AGGF1蛋白能显著抑制心脏肥厚，从图1中可以看出，用重组AGGF1蛋白治疗过的心肌肥厚的小鼠的心脏体积比使用对照PBS治疗的心肌肥厚小鼠心脏要小得多。

此外，本发明实施例中，假手术组给安慰剂组(Sham+PBS)，假手术给AGGF1蛋白组(Sham+AGGF1)，心肌肥厚手术给安慰剂组(TAC+PBS)，心肌肥厚手术给重组AGGF1蛋白组(TAC+AGGF1)小鼠的心功能。相比对照PBS治疗组的小鼠，重组AGGF1蛋白治疗的心肌肥厚小鼠心功能有明显好转，其心功能指标：射血分数LVEF(图2A)，缩短分数(图2B)相比对照组显著升高并且具有统计学意义(P<0.01)。LVEF指左心室射血分数，FS指左心室短轴缩短率，是评价心脏收缩功能的指标，心肌肥厚的小鼠在AGGF1重组蛋白的治疗下，心脏的LVEF和缩短分数提高，说明心脏收缩能力增强，心脏功能好转。图3的HE染色显示，给予AGGF1治疗的TAC小鼠的心脏，与PBS安慰剂治疗的TAC小鼠心脏相比，心肌胶原纤维增生明显减少，心肌细胞肥大以及坏死性变化明显减少。说明重组AGGF1蛋白治疗的急性心肌梗死小鼠能显著抑制心肌梗死导致的心脏纤维化(图3)。图4，小鼠心脏切片进行TUNEL凋亡检测。原理是荧光素(fluorescein)标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶(HRP，horse-radishperoxidase)的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺(DAB)反应产生很强的颜色反应(呈深棕色)，特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。阳性信号为细胞核呈棕黄色，不着色为阴性。镜下观察发现，给予AGGF1治疗的TAC小鼠的心脏，与PBS安慰剂治疗的TAC小鼠心脏相比，tunel阳性信号细胞明显减少，显示使用重组AGGF1蛋白治疗心肌梗死能抑制心肌细胞凋亡，图5为统计数据(P<0.01)。

综上所述，本发明中的含有His标签的重组AGGF1蛋白能通过抗小鼠心肌肥厚，改善小鼠心功能，抑制心肌细胞凋亡和心脏纤维化，最终抑制心衰。因此，本发明含有His标签的重组AGGF1蛋白能制备抗心肌肥厚及心衰药物，用于心肌肥厚及心衰疾病的治疗。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中科技大学

<120> 抑制心肌肥厚的重组蛋白基因及其表达产物和应用

<130> 4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2145

<212> DNA

<213> 人

<400> 1

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<212> PRT

<213> 人

<400> 2

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1 5 1015

Gly Gln Gln Met Gly Gly Arg Asp Pro Met Ala Ser Glu Ala Pro Ser

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Pro Pro Arg Ser Pro Pro Pro Pro Thr Ser Pro Glu Pro Glu Leu Ala

354045

Gln Leu Arg Arg Lys Val Glu Lys Leu Glu Arg Glu Leu Arg Ser Cys

505560

Lys Arg Gln Val Arg Glu Ile Glu Lys Leu Leu His His Thr Glu Arg

65707580

Leu Tyr Gln Asn Ala Glu Ser Asn Asn Gln Glu Leu Arg Thr Gln Val

859095

Glu Glu Leu Ser Lys Ile Leu Gln Arg Gly Arg Asn Glu Asp Asn Lys

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Lys Ser Asp Val Glu Val Gln Thr Glu Asn His Ala Pro Trp Ser Ile

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Ser Asp Tyr Phe Tyr Gln Thr Tyr Tyr Asn Asp Val Ser Leu Pro Asn

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Lys Val Thr Glu Leu Ser Asp Gln Gln Asp Gln Ala Ile Glu Thr Ser

145 150 155 160

Ile Leu Asn Ser Lys Asp His Leu Gln Val Glu Asn Asp Ala Tyr Pro

165 170 175

Gly Thr Asp Arg Thr Glu Asn Val Lys Tyr Arg Gln Val Asp His Phe

180 185 190

Ala Ser Asn Ser Gln Glu Pro Ala Ser Ala Leu Ala Thr Glu Asp Thr

195 200 205

Ser Leu Glu Gly Ser Ser Leu Ala Glu Ser Leu Arg Ala Ala Ala Glu

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Ala Ala Val Ser Gln Thr Gly Phe Ser Tyr Asp Glu Asn Thr Gly Leu

225 230 235 240

Tyr Phe Asp His Ser Thr Gly Phe Tyr Tyr Asp Ser Glu Asn Gln Leu

245 250 255

Tyr Tyr Asp Pro Ser Thr Gly Ile Tyr Tyr Tyr Cys Asp Val Glu Ser

260 265 270

Gly Arg Tyr Gln Phe His Ser Arg Val Asp Leu Gln Pro Tyr Pro Thr

275 280 285

Ser Ser Thr Lys Gln Ser Lys Asp Lys Lys Leu Lys Lys Lys Arg Lys

290 295 300

Asp Pro Asp Ser Ser Ala Thr Asn Glu Glu Lys Asp Leu Asn Ser Glu

305 310 315 320

Asp Gln Lys Ala Phe Ser Val Glu His Thr Ser Cys Asn Glu Glu Glu

325 330 335

Asn Phe Ala Asn Met Lys Lys Lys Ala Lys Ile Gly Ile His His Lys

340 345 350

Asn Ser Pro Pro Lys Val Thr Val Pro Thr Ser Gly Asn Thr Ile Glu

355 360 365

Ser Pro Leu His Glu Asn Ile Ser Asn Ser Thr Ser Phe Lys Asp Glu

370 375 380

Lys Ile Met Glu Thr Asp Ser Glu Pro Glu Glu Gly Glu Ile Thr Asp

385 390 395 400

Ser Gln Thr Glu Asp Ser Tyr Asp Glu Ala Ile Thr Ser Glu Gly Asn

405 410 415

Val Thr Ala Glu Asp Ser Glu Asp Glu Asp Glu Asp Lys Ile Trp Pro

420 425 430

Pro Cys Ile Arg Val Ile Val Ile Arg Ser Pro Val Leu Gln Ile Gly

435 440 445

Ser Leu Phe Ile Ile Thr Ala Val Asn Pro Ala Thr Ile Gly Arg Glu

450 455 460

Lys Asp Met Glu His Thr Leu Arg Ile Pro Glu Val Gly Val Ser Lys

465 470 475 480

Phe His Ala Glu Ile Tyr Phe Asp His Asp Leu Gln Ser Tyr Val Leu

485 490 495

Val Asp Gln Gly Ser Gln Asn Gly Thr Ile Val Asn Gly Lys Gln Ile

500 505 510

Leu Gln Pro Lys Thr Lys Cys Asp Pro Tyr Val Leu Glu His Gly Asp

515 520 525

Glu Val Lys Ile Gly Glu Thr Val Leu Ser Phe His Ile His Pro Gly

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Ser Asp Thr Cys Asp Gly Cys Glu Pro Gly Gln Val Arg Ala His Leu

545 550 555 560

Arg Leu Asp Lys Lys Asp Glu Ser Phe Val Gly Pro Thr Leu Ser Lys

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Glu Glu Lys Glu Leu Glu Arg Arg Lys Glu Leu Lys Lys Ile Arg Val

580 585 590

Lys Tyr Gly Leu Gln Asn Thr Glu Tyr Glu Asp Glu Lys Thr Leu Lys

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Asn Pro Lys Tyr Lys Asp Arg Ala Gly Lys Arg Arg Glu Gln Val Gly

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Ser Glu Gly Thr Phe Gln Arg Asp Asp Ala Pro Ala Ser Val His Ser

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Glu Ile Thr Asp Ser Asn Lys Gly Arg Lys Met Leu Glu Lys Met Gly

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Pro Ile Gln Leu Gln Leu Arg Arg Thr His Ala Gly Leu Gly Thr Gly

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcggatccat ggcctcggag gcgccgtccc cg 32

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<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ccaagctttc actctaaagt cccttttacc ca 32