神经识别分子contactin6的抗原和抗体及应用

摘要

本发明涉及一种神经识别分子contactin 6的抗原，抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明还提供了一种采用上述抗原所制备的神经识别分子contactin 6的抗体。本发明进一步公开了上述抗体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。本发明的抗体可以有效阻断contactin 6的同源性结合，促进神经轴突的生长，该抗体在脊髓损伤中使用可以促进神经轴突的再生和功能改善。

说明书

技术领域

本发明涉及免疫学领域，尤其涉及一种神经识别分子contactin 6的抗原和抗体及应用。

背景技术

脊髓损伤后的功能恢复过程中，控制自主运动的皮质脊髓束的轴突再生一直是脊髓损伤领域研究热点之一。在脊髓损伤之后，反应性胶质细胞、小胶质细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和血管外周膜细胞等组成的瘢痕组织，构成了阻止轴突再生的屏障。各种生长抑制分子以及轴突导向分子会相应地被诱导并抑制轴突的生长。把损伤处的抑制因子去除能够使存活下来的轴突重新出芽生长，但并不足以导致轴突再生。研究发现，神经元的内在生长能力在调控轴突再生过程中起了很重要的作用，但是瘢痕形成细胞如何调控神经元的内在生长能力仍然有待研究。

Contactin家族作为免疫球蛋白超家族中神经识别分子亚家族，特异性地表达在神经系统中，目前为止共发现六个成员：F3/contactin、TAG-1、BIG-1、BIG-2、NB-2和contactin 6。受损的轴突上诱导表达的contactin 6和反应性星形胶质细胞上诱导表达的contactin 6的反式同源性相互作用，会把信号从反应性胶质细胞上向神经元传递，引起轴突再生的接触性抑制。目前还没有针对contactin 6蛋白的促进轴突再生的抗体作为临床应用。

目前，促进轴突再生的相关技术，包括针对Nogo的抗体设计专利，以及针对CSPGs降解的PTPs酶类设计专利。前者在使用的抗体在体检测时，无论在脊髓损伤还是脑缺血领域都能观察到促进轴突再生的现象，但涉及到利用转基因小鼠阐明具体Nogo－NgR以及其下游信号转导机制时，关于其促进再生作用一直存在很强的争议。而PTP家族的酶类种类较多，但目前仅少数种类(比如PTP sigma)对促进轴突再生具有一定的作用，但具体机制依然有待进一步阐明。无论是哪种相关技术，涉及抗体或酶的亲和性和特异性，均依赖于近年来迅速发展的噬菌体筛选，碱基回复突变等手段优化序列设计，来改善关键作用位点的识别和功能检测确认，从而能获得最佳的产物。

目前国内在脊髓损伤领域尚没有针对轴突再生的抗体。而在国外，之前的抗体在设计时，由于没有结构生物学和生物信息学等方面的深度解析，导致抗体往往缺乏足够的特异性和亲和性，抗体结合部位构象形成的微环境很难实现进一步优化；另外，某些多克隆抗体的功能阻断效果，相对于单克隆抗体，缺乏足够针对性和特异性。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种神经识别分子contactin 6的抗原和抗体及应用，本发明的抗体可以有效阻断contactin 6的同源性结合，促进神经轴突的生长，该抗体在脊髓损伤中使用可以促进神经轴突的再生和功能改善。

在一方面，本发明提供了一种神经识别分子contactin 6的抗原，抗原的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在又一方面，本发明还提供了一种神经识别分子contactin 6的抗体，抗体是上述抗原制备而成的抗体。

进一步地，抗体为单克隆抗体。

进一步地，抗体的制备方法包括以下步骤：

(1)使用上述contactin 6抗原免疫小鼠，刺激小鼠B淋巴细胞克隆分化为致敏B淋巴细胞；

(2)提取小鼠的脾细胞，将骨髓瘤细胞与脾细胞混合后，形成杂交瘤细胞；

(3)采用有限稀释法在HAT培养基中培养杂交瘤细胞，筛选出阳性杂交瘤细胞；

(4)将阳性杂交瘤细胞在小鼠体内增殖，得到抗体。

在另一方面，本发明还提供了上述抗体在制备治疗脊髓损伤药物中的应用。

借由上述方案，本发明至少具有以下优点：

本发明利用contactin 6蛋白为代表的contactin家族的结构生物学的相关研究基础，并结合MOE等生物信息学相关软件，分别在抗原结合、理想CDR构象、FR折叠等几个方面，设计保留小鼠单抗的关键的抗原结合部位CDR区域，并进一步提高抗体的特异性和亲和性，改善抗体结合部位最理想构象形成的微环境，从而得到针对contactin信号通路的一种抗体，这种抗体能够特异性地促进皮质脊髓束的轴突损伤再生，并改善脊髓损伤后的修复能力，从而为脊髓损伤领域的康复治疗提供有益的线索。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后所示。

附图说明

图1是contactin 6蛋白IgG 2-3结构域与PTP家族蛋白形成复合体的晶体结构；

图2是contactin 6蛋白FN结构域的晶体结构；

图3图示了contactin 6蛋白与PTP家族蛋白结合关键氨基酸位点；

图4为contactin 6蛋白和contactin家族同源蛋白在Ω环处关键氨基酸比对；

图5图示了contactin 6蛋白氨基酸修饰位点；

图6为Elisa实验检测抗体的结合效价；

图7为Western Blot实验检测抗体的结合能力。

图8为组织培养技术体外检测抗体促进被蛋白阻断的轴突生长的效果；

图9为植入式渗透压泵技术在体检测抗体促进小鼠轴突再生的结果。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1 神经识别分子contactin 6的抗原的制备

利用生物信息学相关软件(MOE软件、Bowtie软件、BWA软件、Clustalw等)，将contactin 6蛋白的同源蛋白(contactin-4、contactin-5、contactin-6)的相关关键序列进行比对，其中，contactin-4、contactin-5、contactin-6的关键氨基酸序列分别如SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示。

利用分别已知的contactin 6FN区域的晶体结构、IgG区域和PTPR蛋白复合体的晶体结构，在提高抗原结合的稳定性、理想CDR构象的特异性结合、FR折叠引起的构象变化等几个方面，分析针对阻断contactin 6反式同源性结合的抗体设计对于抗体亲和性和特异性的影响。

其中，contactin 6蛋白的IgG 2-3结构域对应序列如SEQ ID No.5所示。该序列能够与PTP家族蛋白形成复合体，其晶体结构如图1所示，在设计时根据相应的序列和构象来比较抗原的候选区域。

contactin 6蛋白FN结构域对应序列如SEQ ID No.6所示，其晶体结构如图2所示，在设计时根据相应的序列和构象来比较抗原的候选区域。

contactin 6蛋白与PTP家族蛋白结合关键氨基酸位点如图3所示，从图中可看出结合区段的相应特殊氨基酸位序列和构象，在设计时参考其结合特性和可能引起的构象变化，来比较抗原的候选区域。

图4为contactin 6蛋白和cntn家族同源蛋白(contactin 5蛋白)在Ω环处关键氨基酸局部比对图，图4A和图4B分别为Ω环处关键氨基酸关键区域的构象的正面观和反面观，从图中展现了与同源的contactin 4和contactin 5蛋白相比，contactin 6在该区域的特殊空间构象。

图5为contactin 6蛋白氨基酸修饰位点，图5列出了所有contactin 6的修饰位点，参考其对相应序列位点造成的特异影响。

根据上述方法，设计出神经识别分子contactin 6的抗原，其序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2 神经识别分子contactin 6的抗体的制备

用上述针对性设计的contactin 6抗原多肽免疫小鼠，选用6-8周龄雌性野生型小鼠，使其通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆分化成为致敏B淋巴细胞。随后取出小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，将骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按1:2到1:5混合，在聚乙二醇作用下，形成杂交瘤细胞。在HAT培养基中，只有融合的杂交瘤细胞可从脾细胞获得次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，且具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，从而能在HAT培养基中存活和增殖。采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，小鼠腹腔内可产生和分泌单克隆抗体。约1-2周后，小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得大量单克隆抗体，分别命名为aCNTN6-001，aCNTN6-002，aCNTN6-003等等。

实施例3 抗体的筛选和功能检测

(1)Elisa检测

脊髓组织取材：以损伤区域为中心在脊髓组织的胸段第八到第十节段截取5mm长的组织，将取得的脊髓组织匀浆，将组织加入生理盐水中捣碎，3000转离心10分钟后取上清。从室温平衡20分钟后的铝箔袋中取出所需板条，将剩余板条用自封袋密封放回4℃下保存。

设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加确定已知浓度的IgG溶液标准品50μl；样本孔加待测样本10μl，再加稀释液40μl；空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60分钟。弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。每孔加入底物A(H₂O₂)、B(TMB/OPD)各50μl，37℃避光孵育15分钟。每孔加入终止液50μl，15分钟内，在450nm波长处测定各孔的OD值。选取与诱导的NB-3蛋白有阳性结合的检测抗体样品。检测结果如图6所示，图6A为Elisa检测各组抗体和脊髓组织中的contactin>

(2)Western blot检测

脊髓组织取材：以损伤区域为中心在脊髓组织的胸段第八到第十节段截取5mm长的组织，用来检测损伤脊髓的蛋白表达水平和相应抗体样品的结合能力。

将所取组织以机械捣碎后溶解于RIPA缓冲液(50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液，150mM氯化钠溶液，1mM乙二胺四乙酸钠盐溶液，1％NP-40，0.25％脱氧胆酸钠溶液，蛋白酶抑制剂合剂和磷酸酶抑制剂合剂)。超声匀浆并加热后，得到的上清液用于蛋白凝胶电泳，然后电泳转移到PVDF膜上。

留有蛋白印记的PVDF膜以一抗(R&D公司生产的NB-3蛋白的抗体，稀释比例1:1000；Sigma公司生产的β-tubulin蛋白的抗体，稀释比例1:1000；Sigma公司生产的GAPDH蛋白的抗体，稀释比例1:1000)孵育置于4℃冰箱过夜，然后将留有蛋白印记的PVDF膜以偶联有辣根过氧化物酶的二抗(GE医疗公司生产)室温孵育1小时，最后在PVDF膜上加上增强型显影液(Millipore公司生产)，并置于Bio-Rad公司生产的凝胶成像仪中成像获得相应蛋白条带的结果。选取与诱导的NB-3蛋白有阳性结合的检测抗体样品。检测结果如图7所示，相对于前面两种抗体样品(aCNTN6-117和aCNTN6-025)，最后一种样品(aCNTN6-027)的结合能力相对更强。

(3)组织培养技术检测抗体阻断contactin 6同源性相互作用介导的阻抑作用

体感运动皮层组织培养：从受孕第十八天的母鼠胎中获取胚胎小鼠的体感运动皮层，分离其中的第五六层的椎体细胞，并接种到预铺设混有contactin 6蛋白的鼠尾胶原的四孔板中培养，所用培养基成分为：细胞培养基(MEM)、5％胎牛血清(FBS)、2％葡萄糖、1％谷氨酰胺溶液、1％青霉素和链霉素合剂。培养60小时后细胞以4％多聚甲醛(PFA)溶液固定，并以β-微管蛋白Ⅲ蛋白的抗体(Tuj1)进行免疫荧光的染色，结果如图8所示。图中可以看到相对于空白对照组(图8B)，加入了NB-3-Fc蛋白能够阻断神经组织块的轴突生长(图8C)，同时加入各组阻断抗体(aCNTN6-117，aCNTN6-025和aCNTN6-027等)之后可见，相应最后一组试验抗体(aCNTN6-027)组能够在一定程度上成功阻断NB-3-Fc的抑制作用(图8D-F)，实现体外组织培养促进轴突再生的作用。

(4)植入式渗透压泵技术检测抗体阻断contactin 6同源性相互作用介导的阻抑作用

该实验以野生型小鼠作为实验对象(之后分别以植入式渗透压泵泵入aCNTN6-027和对照IgG抗体等)，小鼠均饲养于无病原菌级别(SPF)的实验室中。

首先构建小鼠模型，所用小鼠体重为20-25g，年龄为出生后10周。

在手术前，用每千克体重40毫克的戊巴比妥钠腹腔注射小鼠，进行麻醉。脊髓背半切模型实施所在区域是脊髓颈段第4节段。损伤模型实施之后，韧带和皮肤先后会被缝合。术后每天对小鼠实施两次膀胱按压促进其排尿，并按每千克体重10000单位的青霉素进行肌肉注射。

小鼠腹腔注射麻醉后，鞘内置入：微导管至脊髓颈膨大处置入约2cm，与聚乙烯管相连后逐层缝合固定导管。用青霉素钠每千克体重一万单位防止术后感染。3天后，对无置管并发症的动物鞘内缓慢给予的利多卡因，动物上肢出现麻痹表明导管在蛛网膜下腔，即可用于实验。植入式渗透压泵使用前，在无菌生理盐水中浸泡，将聚乙烯管相连于泵并充分固定，植入到小鼠背部皮下，然后缝合好。

体感运动皮层椎体神经元的顺行标记：以小鼠颅骨上的Bregma点作为原点，双耳连线的平行线中穿过Bregma点的平行线为Y轴，与该Y轴垂直且穿过Bregma点的直线为X轴(头端为X轴正方向)建立坐标系(单位是mm)，选取(1.0，1.5)、(0.5，1.5)、(-0.5，1.5)(-1.0,1.5)作为体感运动皮层上单侧注射生物素结合的葡聚糖胺(BDA)(10％的溶液，Invitrogen公司生产)的四个坐标点(注射深度均为0.5mm)，每个坐标点注射0.4μl。为了检测皮质脊髓束的再生情况，生物素结合的葡聚糖胺(BDA)在术后12周被注射到小鼠体感运动皮层中，在牺牲小鼠取材之前还需再使之再存活两周，确保生物素结合的葡聚糖胺(BDA)能够标记到从皮层一直贯穿到脊髓腰骶段的皮质脊髓束。

生物素结合的葡聚糖胺(BDA)顺行标记的轴突的荧光强度分析：在脊髓矢状面切片进行免疫荧光染色处理后，结果如图9所示。图中，A图代表在体泵持续在体注射抗体(aCNTN6-027)的试验组，B图代表对照组(IgG)。图中结果表明，相对于对照组，损伤后的皮质脊髓束轴突在有抗体注射的情况下，在体条件下同样能在一定程度上促进轴突再生。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 苏州大学

<120> 神经识别分子contactin 6的抗原和抗体及应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 1

Gly Ser Pro Met Pro Gly Lys Ile Lys Tyr Ser Lys Ser Gln Ala

5 1015

<210> 2

<211> 1026

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 2

Met Arg Leu Pro Trp Glu Leu Leu Val Leu Gln Ser Phe Met Leu

5 1015

Cys Leu Ala Asp Asp Tyr Thr Leu His Gly Pro Val Phe Val Gln

202530

Glu Pro Ser His Val Met Phe Pro Leu Asp Ser Glu Glu Lys Lys

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Arg Trp Lys Ile Asn Gly Thr Asp Val Asp Ile Gly Met Asp Phe

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Arg Tyr Ser Val Val Asp Gly Ser Leu Leu Ile Asn Asn Pro Asn

808590

Lys Thr Gln Asp Ala Gly Thr Tyr Gln Cys Ile Ala Thr Asn Ser

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Phe Gly Thr Ile Val Ser Arg Glu Ala Lys Leu Gln Phe Ala Tyr

110 115 120

Leu Glu Asn Phe Lys Thr Arg Thr Arg Ser Thr Val Ser Val Arg

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Gly Glu Leu Ser Tyr Ala Trp Ile Phe Asn Glu Tyr Pro Ser Tyr

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<211> 1098

<212> PRT

<213> 氨基酸序列

<400> 3

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5 1015

Trp Leu Ser Asp Tyr Ser Glu Ala Leu Ser Gly Leu Ser Thr Ser

202530

Tyr Ala Ala Leu Leu Arg Ile Lys Lys Ser Ser Thr Ser Pro Phe

354045

Gly Ser Lys Ser Arg Pro Arg Phe Ser Ser Pro Ser Leu Gly Thr

505560

Ile Ser Val Ser Pro Pro Ser Trp Arg Gly Ala Ala Gln Gln Tyr

657075

His Ser Pro Gly Asn Leu Tyr His Ser Ser Asp Ala Phe Arg Gln

808590

Asp Glu Ser Val Asp Tyr Gly Pro Val Phe Val Gln Glu Pro Asp

95100 105

Asp Val Ile Phe Pro Thr Asp Ser Asp Glu Lys Lys Val Ala Leu

110 115 120

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125 130 135

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155 160 165

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170 175 180

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200 205 210

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695 700 705

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710 715 720

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725 730 735

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740 745 750

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755 760 765

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770 775 780

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785 790 795

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830 835 840

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845 850 855

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875 880 885

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320 325 330

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380 385 390

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395