基于HPLC‑MS/MS检测平台的溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法

摘要

本发明公开了一种基于HPLC‑MS/MS检测平台的溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法。本发明建立了HPLC‑MS/MS检测平台，以利血平为内标物绘制LPC 14:0‑LPC 18:0系列物质检测的标准曲线，并对检测平台的线性、精密度和准确度进行验证，并检测血清的基质效应。验证结果表明本发明建立的HPLC‑MS/MS检测平台针对人血清中LPC物质的检测稳定性和准确性较高，满足临床需求，适于临床推广。

说明书

技术领域

本发明属于医学检测领域，涉及一种溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法，具体涉及一种基于HPLC-MS/MS检测平台的溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法。

背景技术

HBV相关性HCC是我国最常见的肝癌类型，也是HCC的发生发展是一个涉及多个信号通路和代谢通路异常改变的复杂病理过程，在此过程中多种物质的代谢水平发生变化，这些变化的代谢物具有潜在诊断、疾病分期和预后的临床价值。其中LPC类物质被多次报道与HCC具有某种关系。

溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholi ne，LPC)是氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipopro2 tei ox2LDL)的主要成分，是磷脂分解代谢的主要产物之一，在人体血清中的含量亦随之变化，此变化与肝脏疾病的种类和严重程度相关。为了研究LPC类物质在HBV-HCC发生发展过程中的变化趋势，探索可能的病理机制，并分析潜在的临床应用，首要的任务是精确定量LPC类物质。

目前最常用的代谢组学技术是质谱技术(mass spectrometry，MS)和核磁共振技术(nuclear magnetic resonance，NMR)，而MS最常用的分析方法是气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)、液相色谱-质谱联用(liquidchromatography-mass spectrometry，LC-MS)和毛细管电泳-质谱联用(capillaryelectrophoresis coupled to mass spectrometry，CE-MS)。NMR、GC-MS、LC-MS和CE-MS可谓是目前代谢组学分析技术的四大支柱。LC-MS适用的待检代谢物范围较广，涉及极性糖类分子、非芳香族有机酸和各种脂类等物质。LC-MS联用平台同时具有较高的特异性和敏感性，是目前定量检测微量非挥发性分析物的金标准。由于LPC类物对热不稳定，且不易挥发，适用于LC-MS技术定量分析检测。使用LC/MS进行定量分析时，需要借助于内标或外标绘制标准曲线，原始信号强度或峰面积可以转换为代谢物浓度。因为原始信号强度取决于质谱仪的条件和源于样品基质的离子抑制程度的大小。但是，为所有的代谢物均绘制对应的标准曲线或找到一种普适性的内标物质是不太现实的，所以大量的非靶向代谢研究和广谱靶向代谢研究使用原始数据中的离子强度来表示代谢物水平的高低，也就是只能进行相对定量。目前已有研究试图采用简化的标准化方法(例如通用内标物)来解决定量难题，但是其质量控制和性能验证的结果并不令人满意。由于LC-MS技术本身存在的缺陷不能广泛在临床中推广应用于LPC类物质的检测。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明提供了一种用于人血清中LPC14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0五种物质的绝对定量分析的方法。本研究利用HPLC-MS/MS分析平台、以利血平为内标物质，构建了完全定量分析检测人血清中LPC14:0、LPC 15:0、LPC16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的方法，绘制每种目标溶血磷脂酰胆碱对应的标准曲线；并进一步验证了该方法平台的定量限、线性范围，通过加标回收实验评价其准确性和血清基质对结果的影响，分析计算该平台检测的偏倚以评价其精密度，最终成功建立了一个稳定的、灵敏而可靠的定量检测人血清中LPC 14:0-LPC 18:0五种目标LPC类物质的检测平台。

具体的，本发明采用了如下技术方案：

根据本发明的一个方面，提供了一种基于HPLC-MS/MS检测平台的溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析方法，所述方法包括如下步骤：

(1)将人血清标本进行预处理去除干扰蛋白质；

(2)经过步骤(1)处理的人血清标本注入到高效液相色谱柱中完成标本的初步分离；

(3)初步分离后的人血清标本进入质谱仪，完成定量分析离子碎片到的强度和质谱图的绘制。

所述方法使用利血平作为溶血磷脂酰胆碱定量检测的内标物。

进一步，将人血清标本进行预处理除去干扰蛋白质的过程中加入了0.1％2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)的甲醇溶液进行前处理。

进一步，步骤(2)中使用的高效液相色谱柱的流动相是0.1％甲酸25mM甲酸铵-水溶液、0.1％甲酸-甲醇溶液。

进一步，步骤(3)使用的质谱仪采用了Turbo V^TM离子源和帘气的设计、电离模式是电喷雾电离、质量分析器是三重四级杆、所述三重四级杆采用的是多反应检测模式进行扫描检测。

进一步，步骤(1)的详细工艺如下：

1)配制含有0.1％BHT的甲醇溶液：70mL甲醇溶液加入70mg BHT，充分涡旋使BHT完全溶解；

2)预处理去除干扰蛋白前的前处理：

配制标准曲线样品溶液：标准曲线样品溶液共有S1-S7个浓度水平，称取LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的标准品分别1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50mL甲醇溶液中，充分混匀溶解后，取5μL移至20μL甲醇溶液中，即制成S7浓度的标准曲线样品溶液，S7溶液用甲醇稀释两倍得S6，S7浓度的溶液甲醇稀释3倍得S5，S5稀释2倍得S4，S5稀释5倍得S3，S3稀释2倍得S2，S2稀释2倍得S1。

配制人血清标本：取100μL人血清至EP管内，加入25μL25μL含有0.1％BHT的甲醇，充分涡旋均匀即得一份标本；

3)预处理去除干扰蛋白：先向Cleanert PPT 96孔蛋白沉淀板中加入含100ppb利血平的150μL含有0.1％BHT的甲醇溶液，再加入经过步骤2)前处理的标本25μL，使用96孔板振荡器于600rpm涡旋5min混合均匀后静置10min，最后使用Cleanert M96生物样品前处理仪将去蛋白后的溶液收集到洁净的收集板中备用；

4)将收集板里的溶液在V96样品氮吹浓缩仪中用氮气吹干，温度设定为30℃；吹干后标本再于1mL 80％甲醇水溶液中复溶，涡旋器上混合均匀后即可进行后续测试，所述甲醇水溶液中含有0.1％BHT。

进一步，步骤(2)的详细工艺如下：经过步骤(1)处理的人血清标本注入到高效液相色谱柱中，HPLC流动相的参数如下：0min时，0.1％甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为70％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比为30％；5min时，0.1％甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为50％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比为50％：50％，1min时，0.1％甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为0％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比为100％；4min时，0.1％甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为0％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比为100％；4.1min时，0.1％甲酸25mM甲酸铵-水溶液的占比为70％，0.1％甲酸-甲醇溶液的占比为30％；5min时，停止；流速设定为800μL/min，柱温固定在30℃，进样量设定为5μL。

进一步，步骤(3)的详细工艺如下：经HPLC分离后的标本进入质谱仪进行鉴定和定量分析，质谱仪的参数设置见下面的表格：

表格中“*”表示定量离子对；“Q1”指母离子，“Q3”指子离子，单位均为质荷比m/z；“DP¹”表示去簇电压，单位是伏特；“CE²”表示碰撞电压，单位是伏特。

进一步，本发明使用的所述高效液相色谱柱是Durashell C18(L)色谱柱，色谱柱孔径色谱柱中C18的直径大小约5μm，色谱柱大小为3.0*50mm。

进一步，前面所述的溶血磷脂酰胆碱选自以下组：LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0。

根据本发明的另一个方面，本发明提供了一种用于溶血磷脂酰胆碱绝对定量分析的HPLC-MS/MS检测平台，所述检测平台能够使用前面所述的方法进行溶血磷脂酰胆碱的绝对定量分析。

进一步，上面所述的溶血磷脂酰胆碱选自以下组：LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0、LPC 18:0。

本发明使用了API 4000+质谱仪，所使用的离子源是Turbo V^TM离子源，具有离子化效率高，灵敏度高和允许的液相流速范围宽等特点，同时帘气设计可以有效降低交叉污染，抗污染能力强，适用于标本基质复杂的待检样品，例如本研究中的人血清样本。对LPC类待检物质的电离模式选择电喷雾(electrospray>TM离子源和帘气的设计共同使待检物质的电离更加稳定和高效。本发明待测的五种LPC类物质经电离后成为带电离子在接口内进行去溶剂、聚集、冷却后进入质量分析器。质量分析器的作用简单来说就是将在离子源中电离后产生的带电离子根据其质荷比的不同分离开来。本研究过程中使用的质量分析器是三重四级杆(triple>软件分析成离子强度图，最终完成定量分析子离子碎片的强度和质谱图的绘制。本研究采用三重四级杆的多反应检测模式(Multi-reactiion monitoring，MRM)进行扫描检测，限定母离子和子离子两个参数，选择性极高，提高了灵敏度。

本发明通过预处理、色谱参数和质谱条件的选择优化，建立了HPLC-MS/MS液质联用平台，并对该技术的性能进行验证。

首先是标准曲线的绘制和线性相关性的验证。本发明以生理盐水为基质配制不同浓度梯度的LPC 14:0-LPC 18:0标准曲线样品溶液，通过质谱仪自带软件分析待测物浓度和峰下面积的关系并绘制标准曲线和线性相关系数，结果显示LPC 14:0-LPC 18:0五种LPC的实测浓度和配制浓度之间的r值分别为0.9965、0.9913、0.9956、0.9938和0.9961，相关系数r值均在0.99以上。结果表明每一种LPC类物质配制的S1至S7共计七个浓度水平均在直线范围内，说明本发明建立的HPLC-MS/MS方法学平台可以满足对人血清中五种LPC的定量检测在浓度范围方面的需求。而且，该方法学平台对溶液中LPC 14:0-LPC 18:0的定量检测下限分别是0.027ppm、0.12ppm、0.32ppm、0.059ppm和0.072ppm。

接下来是HPLC-MS/MS技术平台准确度的验证，本发明以高(S6)、低(S4)两个浓度水平加标回收率试验，结果显示五种LPC在以生理盐水为基质的高、低两个浓度水平均具有满意的回收率，在85％至115％范围内。而且，低浓度的八个样本的平行试验结果数据显示LPC 14:0-LPC 18:0五种物质的平均回收率分别是96.3％、99.9％、103.6％、96.6％和100.0％，均处于95％至105％范围内；八个高浓度水平标准样品对LPC 14:0-LPC 18:0五种物质的加标回收率平均值分别是96.8％、99.1％、97.5％、93.8％和97.7％，亦在95％至105％范围内，证明该方法平台能够以高准确度定量分析以生理盐水为基质的溶液中的LPC14:0-LPC 18:0。而本发明的研究对象是人血清当中的LPC 14:0-LPC 18:0，故而本发明以血清为基质再次进行加标回收率实验已确定基质效应的大小，结果显示以人血清为基质时，加标回收率也可控制在85％至115％范围内，说明该平台性能稳定，受人血清基质效应影响较小，适用于对人血清中LPC 14:0-LPC 18:0的定量检测分析。

最后是本发明的HPLC-MS/MS检测平台的精密度验证，先后八次应用本发明的HPLC-MS/MS检测平台定量检测高浓度水平和低浓度水平的LPC 14:0-LPC 18:0，分析八次检测结果的批内偏倚值大小，以此来评估HPLC-MS/MS平台的精密度大小，分析结果提示，两个浓度水平的CV值均小于15％，符合临床检验工作中对仪器精密度的要求。

本发明的优点和有益效果：

(1)本发明选用利血平作为定量检测五种待测溶血磷脂酰胆碱类物质的内标物，分子量与所要检测的代谢物相近，所以设定的质谱仪参数既适用于内标物利血平的电离和检测，也满足待检的LPC类物质的定量分析。此外，利血平的tR时间为2min，而待检代谢物在2.46min～2.83min，时间间隔较大，不会对目标物质的定量检测造成干扰。利血平廉价易得，在多个实验室具有普适性。

(2)本发明的方法在标本预处理去蛋白过程中使用加入了0.1％2,6-二叔丁基对甲酚的甲醇溶液进行前处理，2,6-二叔丁基对甲酚对LPC类物质具有保护作用，防止其分解；而甲醇对水的亲和力大，能破坏人血清蛋白颗粒表面的水化膜，致使蛋白质沉淀而除去待测溶液中的蛋白质；

(3)本发明的方法中使用的高效液相色谱柱的流动相-0.1％甲酸25mM甲酸铵-水溶液和0.1％甲酸-甲醇溶液的配比随时间而改变，待测标本中各种物质在不同配比的流动相中的溶解度不同而先后被洗脱下来；这就完成色谱过程对样本的初步分离作用，而不破坏待测物质的化学结构；

(4)本发明的方法中采用三重四级杆的多反应检测模式(Multi-reactiionmonitoring，MRM)进行扫描检测，限定母离子和子离子两个参数，选择性极高，提高了灵敏度。

附图说明

图1显示S1浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图；

图2显示S2浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图；

图3显示S3浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图；

图4显示S4浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图；

图5显示S5浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图；

图6显示S6浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图；

图7显示S7浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图；

图8显示LPC 14:0的标准曲线图；

图9显示LPC 15:0的标准曲线图；

图10显示LPC 16:0的标准曲线图；

图11显示LPC 17:0的标准曲线图；

图12显示LPC 18:0的标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步说明本发明，本发明的实施例仅用于解释本发明，并不意味着限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 HPLC-MS/MS方法学建立

1、试剂和仪器

标本分析过程主要涉及标本预处理、色谱分离、质谱鉴定，所使用的试剂和仪器也主要是这三步中需要的。

1.1标本预处理所需试剂及仪器

试剂：(1)甲醇(Honeywell公司生产，纯度为LC-MS级)、(2)2,6-二叔丁基对甲酚(2,6-di-tert-butyl-p-cresol也称ButylatedHydroxytoluene，BHT)，该试剂纯度是优级纯，由百灵威企业有限公司生产。

仪器：Cleanert PPT 96孔蛋白沉淀板，货号96CD2025Q；Cleanert M96生物样品前处理仪；V96样品氮吹浓缩仪和96孔收集板。以上仪器均来自天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2色谱分离所需试剂及仪器

试剂：0.1％甲酸(体积比)25mM甲酸铵-水溶液和0.1％甲酸(体积比)-甲醇溶液。甲酸和甲酸铵均是由Mreda公司生产，纯度均是HPLC级，甲醇由Hone-ywell公司生产，纯度为LC-MS级。

仪器：Durashell C18(L)色谱柱，由天津博纳艾杰尔科技有限公司生产；色谱柱孔径色谱柱中C18的直径大小约5μm，色谱柱大小为3.0*50mm。

1.3质谱鉴定所需仪器

仪器：API 4000+质谱仪(美国应用生物系统(Appliedbiosystems)公司下属的AB/SCIEX生产部门制造)，质谱仪中使用TurboV离子源，三重四级杆(Triple quadruple)作为串联质谱的质量分析装置。

1.4其他试剂

LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的标准品均购自美国Avanti公司，纯度为100％。

内标物质利血平由sigma公司生产提供。

2、方法

(1)标本预处理

人血清标本中含有大量的蛋白质，影响对检测LPC类物质的定量检测，所以需要对标本进行预处理除去干扰蛋白质。主要步骤如下：

a、配制含有0.1％BHT的甲醇溶液：70mL甲醇溶液加入70mg BHT，充分涡旋使BHT完全溶解；

b、预处理去除干扰蛋白前的前处理：

配制标准曲线样品溶液：标准曲线样品溶液共有S1-S7个浓度水平，称取LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的标准品分别1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50mL甲醇溶液中，充分混匀溶解后，取5μL移至20μL甲醇溶液中，即制成S7浓度的标准曲线样品，S7溶液用甲醇稀释两倍得S6，S7浓度的溶液稀释3倍得S5，S5稀释2倍得S4，S5稀释5倍得S3，S3稀释2倍得S2，S2稀释2倍得S1。

配制人血清标本：取100μL人血清至EP管内，加入25μL含有0.1％BHT的甲醇，充分涡旋均匀即得一份标本；

c、预处理去除干扰蛋白：先向Cleanert PPT 96孔蛋白沉淀板中加入含100ppb利血平的150μL含有0.1％BHT的甲醇溶液，再加入经过步骤2)前处理的标本25μL，使用96孔板振荡器于600rpm涡旋5min混合均匀后静置10min，最后使用Cleanert M96生物样品前处理仪将去蛋白后的溶液收集到洁净的收集板中备用；

d、将收集板里的溶液在V96样品氮吹浓缩仪中用氮气吹干，温度设定为30℃；吹干后标本再于1mL 80％甲醇水溶液(甲醇水溶液中含有0.1％BHT)中复溶，涡旋器上混合均匀后即可进行后续测试。

(2)色谱分离

将经过预处理的标本注入到高效液相色谱柱中，HPLC流动相参数见表1，流速均设定为800μL/min，柱温固定在30℃，进样量设定为5μL。

表1 HPLC的流动相条件

(3)质谱鉴定

经HPLC分离后的标本进入质谱仪进行鉴定和定量分析，质谱仪的参数设置见表2。

表2质谱条件参数信息

注：*表示定量离子对。Q1指母离子，Q3指子离子，单位均为质荷比m/z。DP¹表示去簇电压(declustering>2表示碰撞电压(collision>

实施例2 HPLC-MS/MS方法学验证

由于难以获得完全不含LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的基质，所以本发明首先采用0.9％的生理盐水代替人血清进行方法学评估和性能验证。

1、验证方法

(1)线性关系和灵敏度的评估

称取LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的标准品分别1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50mL甲醇溶液中，取5μL移至20μL甲醇溶液中，即制成表3中S7浓度的标准曲线样品，用S7浓度的标准曲线样品倍比稀释成S1-S6各梯度浓度的标准曲线样品用于标准曲线确定和线性关系验证。将S1浓度的标准曲线样品稀释至更低浓度梯度上机检测，测定信噪比(S/N)，直至S/N为10:1。再平行处理五个样本，满足CV值小于20％，则此时的标准曲线样品浓度即为仪器的最低定量限(limit ofquantitation，LOQ)，用最低定量限(LOQ)值表示本发明HPLC-MS/MS技术平台的灵敏度。

表3标准曲线样品配制浓度

注：1ppm＝1μg/mL

HPLC-MS/MS方法学的标准曲线是由工作站软件自动处理给出的，主要原理是根据检测的S1-S7系列浓度和相应的峰面积，绘制标准浓度/内标物浓度-标准浓度面积/内标物面积的曲线，并计算曲线方程和相关系数(linear correlation coefficient，r)，变异系数

(2)方法精密度和准确度确定

a、准确度

进行加标回收实验评价方法学的准确度。

以生理盐水为基质，配制出S3和S5两个浓度的标准曲线样品，配制方法：称取LPC14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的标准品分别1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50mL甲醇中，取5μL移至20μL甲醇中，即制成表3中S7浓度的标准曲线样品，用S7浓度的标准曲线样品倍比稀释成S4和S6两个浓度的标准曲线样品。

根据配制的标准曲线样品的浓度(称为加标浓度)和上述样品的实测浓度(称为加标样实测浓度)计算加标回收率，加标回收率＝加标样实测浓度/加标浓度*100％；S6和S4两个浓度水平分别进行两个平行实验。

b、精密度

以S3和S5浓度两个水平的标准曲线样品进行精密度的评价。

以S3水平为例，取浓度水平为S3的标准曲线样品进行8个样品的平行试验，基质为生理盐水，按照上述步骤上机检测，利用测量的八个结果进行平均值(Mean，)和标准差(Standard deviation，SD)的计算。最后以变异系数(coefficient of variation，CV)值表示该方法学的精密度，变异系数S5浓度水平的检测和计算与S3相同。

(3)人血清为基质进行的加标回收实验

由于本发明的标本均是来自人体血清，故而再以人血清为基质进行加标回收率的检测，以验证本发明的HPLC-MS/MS实验平台对人血清标本是否也有较好的适用性。

以人血清代替生理盐水配制成S4和S6两个浓度梯度的加标准品的人血清(以下简称“加标血清”)，配制方法：称取LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的标准品分别1.875mg、3.750mg、56.250mg、5.625mg和37.500mg溶解于50mL甲醇中，充分溶解混匀后，取5μL移至20μL甲醇中，即制成表3中S7浓度的标准曲线样品，用S7浓度的标准曲线样品倍比稀释成S6和S4两个浓度的标准曲线样品。将5μL S4浓度标准溶液加入到20μL人血清中即可得到S4浓度的加标血清，将5μL S6浓度标准溶液加入到20μL人血清中即可得到S6浓度的加标血清。

按照实施例1的方法进行预处理和参数设置，测量加标血清中LPC 14:0-LPC 18:0五种LPC类物质的含量，结果记为加标血清浓度。再用同一血清按照实施例1中的方法进行预处理和参数设置，测量人血清样本中LPC 14:0-LPC 18:0五种LPC类物质的含量，结果记为人血清浓度。由于人血清中含有浓度可观的溶血磷脂酰胆碱，实验检测两份人血清样品用于检测内源性溶血磷脂酰胆碱对结果的影响。以人血清为基质的加标回收率计算公式：加标回收率＝(加标血清浓度-人血清浓度)/加标浓度*100％。

2、结果

1.1灵敏度评估

本发明的HPLC-MS/MS技术平台分辨效果良好，图1-图7是S1-S7浓度的标准曲线样品溶液的MRM谱图，显示相邻两个峰的分辨良好。经检验，LPC 14:0、LPC 15:0、LPC 16:0、LPC 17:0和LPC 18:0的LOQ值分别是0.027ppm、0.12ppm、0.32ppm、0.059ppm和0.072ppm。表明本发明的HPLC-MS/MS技术平台的灵敏度高。

3.2线性关系评估

根据表3中不同浓度梯度标准溶液的检测结果中图谱的中峰面积和标准溶液浓度绘制标准曲线，并分析相关系数r值的大小，结果显示LPC 14:0-LPC 18:0五种物质的标准曲线分别为：y＝0.725x+0.00264、y＝0.212x-0.0256、y＝0.212x+0.268、y＝0.366x+0.00653和y＝0.31x+0.287；各指标对应的相关系数r值分别为0.9965、0.9913、0.9956、0.9938和0.9961。以LPC 14:0为例，图8所示X轴为LPC 14:0与内标物(利血平)浓度比值，Y为LPC 14:0与内标物峰面积比值，每一个上机样本里加入的内标物体积及浓度是一致的，所以利用上机样本检测结果中的峰面积，代入到标准曲线中，即可计算出相应的目标待测物的浓度。LPC 15:0-LPC 18:0的标准曲线和目标待测物浓度分析的原理与LPC 14:0的相同，标准曲线图分别见图9-图12。

线性范围的评估过程中，S1至S7共计七个系列浓度均在线性范围内，故而认为LPC14:0-LPC 18:0五种物质在该平台检测的线性范围即S1至S7浓度范围。在该范围内的检测结果可信，超出范围的检测结果不可信。

3.3准确度评估

HPLC-MS/MS技术平台的准确度用S4和S6两个浓度水平的标准曲线样品各两个平行样的加标回收率表示，计算公式为加标回收率＝加标样实测浓度/加标浓度*100％，测量结果和计算结果整理如表4。

表4生理盐水基质加标回收率数据

由上表可见，LPC 14:0-LPC 18:0五种标准品在S4和S6两个浓度水平的两个平行样，其加标回收率均在85％-115％范围内。

3.4精密度评估

精密度用变异系数CV值来表示，S4和S6两个浓度水平的标准曲线样品进行8个样本的平行试验，分别计算LPC 14:0-LPC 18:0的八个测量值的平均值和标准差，计算得其CV值。其中，LPC 14:0-LPC 18:0在S4水平的CV分别是：6.3％、6.4％、8.5％、7.1％和7.0％；LPC 14:0-LPC 18:0在S6浓度的CV值结果分别是：11.3％、12.1％、12.3％、12.0％和11.3％。可见五种LPC类标准品物质的CV检测结果均小于15％。

3.5人血清为基质进行的加标回收实验

为明确该HPLC-MS/MS平台在人血清中应用的适用性，以人血清为基质进行的加标回收实验，结果整理见表5。如表5中所示，人血清样本的LPC 14:0-LPC 18:0的浓度明显高于灵敏度结果部分的LOQ值，且都处于线性验证实验中的线性范围(S1至S7浓度范围)内，结果具有可信性。此外，在S4和S6两个标准物浓度以人血清样本为基质的加标回收率均落在85％至115％范围内，与以生理盐水为基质的加标回收率没有显著差异，所以可以认为人血清基质对该技术平台的影响不大，即HPLC-MS/MS平台对血清标本也有良好的适用性。

表5以人血清为基质加标回收实验结果

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。