基于细长反应腔的全基因组扩增方法

摘要

本发明提出了一种基于细长反应腔的全基因组扩增方法，其特征在于将多重链置换扩增反应体系注入细长型的反应腔中，完成对目标基因组的全基因组扩增。细长形的反应腔体将多重链置换扩增反应体系相对分隔于一个细长的反应腔中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标核酸各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，基于细长反应腔的多重链置换扩增，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，简化了反应系统，降低了操作复杂度。

说明书

技术领域

本发明涉及一种采用细长反应腔体进行全基因组扩增反应的技术，是一种实现对全基因组信息进行高效、高均一性扩增的方法，属于生物技术领域。

背景技术

在过去的10年中，使用多重链置换反应(Multiple displacementamplification，MDA)(Genome research,2001,11:1095-1099)进行全基因组扩增(Wholegenome amplification，WGA)的方法得到了很大的关注，多重链置换反应可以完成对低起始量样本的有效扩增，使得扩增后的核酸质量和浓度满足各类应用的需求，特别是满足构建高通量DNA测序文库的需要。

与另一种同样被广泛使用的全基因组扩增技术——聚合酶链式反应(PolymeraseChain Reaction，PCR)技术不同的是，多重链置换反应的主要问题是整个反应过程中的不均匀扩增，导致基因组内的扩增均一性较差，对基因组之间的杂合信息分辨率低。一些研究者将这两种方法混合使用，例如MALBAC(Science,2012,338:1627-1630)和PicoPLEX，在扩增的早期阶段采用随机引物和变温预扩增，后期采用聚合酶链式反应进行扩增的方法，但限制反应的循环数。然而这种混合并没有解决多重链置换反应的不足，与单纯使用PCR和MDA方法比较起来，这些方法也仅仅获得了中间效果。

尽管存在这样的问题，由于MDA具有较高的扩增效率和保真度，依然是较为广泛使用的基于低起始量样本的有效扩增方法。一些基于微流控装置或微液滴的多重链置换扩增方法随后被开发出来，以改善传统多重链置换扩增方法在扩增均一性上的不足。Quake等人将传统的发生在离心管内的多重链置换反应转移到纳升的微流控反应微腔中(PLoSgenetics,2007,3:1702-1708)，证实可以改善扩增反应的偏好性(bias)；在另一些报道中，多重链置换反应体系被转移进微液滴环境中(PNAS,2015,112:11923-11928；Nucleicacids research,2016,44:e66)，结果表明这些扩增偏好会在一定程度上得到抑制。

然而，反应微腔的制备和操作较为复杂，依赖精密的设备和精巧的操作，且费用较为高昂，从零散的材料和设备开始构建整个系统费时费力。将多重链置换扩增转移进油水混合的乳液环境同样对设备和操作的依赖性极大，商业化微液滴发生器机器配件价格较高，并且制备微乳液使用的表面活性剂在一定程度上影响反应的进行。因此，低起始量全基因组扩增、单细胞全基因组扩增等应用迫切需要一种高效、廉价且具有较好均一性的全基因组扩增方法。

发明内容

技术问题：本发明的目的就是针对现有的用于全基因组的多重链置换扩增方法，对基因组不同区域的扩增一致性较差这一现状，以及基于反应微腔和微液滴的多重链置换扩增方法系统复杂、花费高昂和实验流程复杂这一问题，试图通过对反应腔的改造，将反应容器转换为细长的连续反应腔体，提升扩增的均一性，简化系统和实验流程，降低花费。

发明内容：本发明提出了一种基于细长反应腔的全基因组扩增方法。本发明采用多重链置换扩增方法，完成对目标基因组的全基因组扩增。多重链置换扩增采用Φ29、Bst和Klenow等DNA聚合酶，在恒温的条件下，利用随机序列引物对目的核酸片段进行大量高效的扩增，可以实现飞克(fg)量级核酸或单个细胞基因组的有效扩增，满足后续的核酸检测、DNA测序等应用的要求，具有较高的扩增效率和保真性，使用较为广泛。本发明将多重链置换扩增反应体系置于细长形的反应腔体中，并在该腔体中完成扩增反应。细长形的反应腔体将多重链置换扩增反应体系相对分隔于一个细长的反应腔中，各微观反应单元之间的物质交换和相互影响大为减少，因此各微观反应单元以一个相对独立的状态发生反应，目标核酸各个片段之间的扩增一致性得到很大提升。同时，连通的细长反应腔体，允许小分子量的离子在反应体系内的扩散，对局部反应单元的离子消耗给予相对及时的补充，保证了反应体系的扩增效率不受影响。

技术方案：本发明是一种基于细长反应腔的全基因组扩增方法，将多重链置换扩增反应体系注入细长型的反应腔中，完成对目标基因组的全基因组扩增。

所述的多重链置换扩增，是采用具有链置换能力的核酸聚合酶和随机序列引物，在恒温的条件下，对目标基因组核酸片段进行扩增，提高其绝对质量。

所述的具有链置换能力的核酸聚合酶，包括Φ29DNA聚合酶，Klenow DNA聚合酶或Bst DNA聚合酶等具有链置换能力的聚合酶。

所述的随机序列引物，其长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个碱基，其中包含一个或多个简并碱基。

所述的随机序列引物，可以为普通未修饰引物，也可以为经过硫代修饰、硫酸化修饰或氨基修饰等的修饰引物。

所述的细长形的反应腔，反应腔中反应溶液所处的区域，区域总长度和反应腔内部平均横截面积的平方根之间的比值在5：1到2×10⁶：1之间。

所述的细长形的反应腔，反应腔中反应溶液所处的区域，反应腔内部的平均横截面积在25平方微米到4平方毫米之间。

所述的细长形的反应腔，细长反应腔的横截面可以是圆形、椭圆形、正方形或长方形等各种几何结构，细长反应腔各部分的横截面可以相同，也可以不相同。

所述的细长形的反应腔，细长形的反应腔可以是塑料、玻璃或金属等材质的微细管道，也可以是通过微加工工艺在微流控芯片中制备的细长形流道。

所述的目标基因组，为一种或多种人类、动物、植物或微生物的基因组，目标基因组的规模，可以为单细胞基因组或多细胞基因组。

有益效果：

1、基于细长反应腔的多重链置换扩增，因为细长的反应腔将待扩增的DNA模板和反应体系分散于一个细长形的空间结构中，各个具体的扩增反应单元彼此相对孤立，包括聚合酶和引物在内的大分子交换较少，以一个近乎独立的状态进行扩增，缓解了部分反应单元的扩增过度和扩增不足，从而极大地提高了整个多重链置换反应的扩增均一性。

2、基于细长反应腔的多重链置换扩增，不需要预先制备微液滴发生装置或复杂反应微腔，并且在系统调试和扩增反应的过程中，不需要对微量液体进行精密和复杂的控制，与微液滴多重链置换扩增和基于微流控反应微腔的多重链置换扩增相比，极大地简化了反应系统，降低了操作复杂度。

3、基于细长反应腔的多重链置换扩增，不需要使用微液滴多重链置换扩增体系所需的矿物油、表面活性剂等组分，避免了这些组分对扩增反应体系的干扰。

具体实施方式

实施例1：利用聚四氟乙烯(PTFE)毛细管全基因组扩增YH-1永生化细胞。

样本：1ng人类永生态细胞系YH-1基因组DNA。

反应体系：2.5nmol的N6随机序列引物，序列为5’-NNNN-s-N-s-N-3’，其中第4和第5位碱基的3’端经硫代修饰处理；Φ29DNA聚合酶，10U；Φ29DNA聚合酶反应缓冲液，定容至50μl。

在冰上混合反应体系，随后注入内径为320μm的聚四氟乙烯(PTFE)毛细管。毛细管预先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常温处理1小时。反应体系通入毛细管后，用环氧树脂胶密封毛细管两端，并将毛细管绕于金属绕线器上。毛细管的截面积约为80425μm²，截面积的平方根约为283.6μm，反应区域长度约为621.7mm。将缠有毛细管的绕线器放入30℃水浴中孵育16小时，再进入另一个65℃水浴中放置5分钟以灭活Φ29DNA聚合酶。

反应完成后，拆除毛细管两端的密封胶，回收反应体系，纯化扩增产物，并按照标准流程制备高通量DNA测序文库，在Hiseq 4000测序仪上进行序列测定。测序完成后利用BWA短序列比对软件与人类参考基因组进行比对，并进行统计分析。

结果表明，与常规的在离心管中进行全基因组扩增的方法对比，两者在扩增效率上并不存在显著的差异，然而利用聚四氟乙烯毛细管的扩增方法显著提升了扩增的一致性，不同区域覆盖深度的变异系数(coefficient of variation)由离心管中全基因组扩增的0.78降低至毛细管中的0.38。覆盖参考基因组90％的区域，毛细管法需要约6倍的测序深度，而离心管法需要约13倍的测序深度，毛细管法更加有优势。当测序通量为基因组大小的35倍时，采用离心管法在基因组73.64％的区域覆盖深度大于等于10倍，而采用毛细管法在基因组85.61％的区域覆盖深度大于等于10倍。

实施例2：利用微流控芯片细长微流道扩增单个TC-1小鼠永生化细胞基因组。

样本：裂解后的小鼠永生态细胞系TC-1单细胞。

反应体系：2.5nmol的N9随机序列引物，序列为5’-NNNNNNN-s-N-s-N-3’，其中第7和第8位碱基的3’端经硫代修饰处理；Klenow DNA聚合酶，5U；Klenow DNA聚合酶反应缓冲液，定容至20μl。

利用软光刻法制备含有细长微流道的玻璃微流控芯片，微流道反复弯折整齐排列，微流道横截面为长方形，宽400μm，深500μm，微流道长200mm。微流控芯片的底面紧贴半导体温控器件用于对芯片的温度控制。

在冰上混合反应体系，随后注入上述微流控芯片中，并使反应体系停留在细长微流道区域。微流道的截面积为0.2mm²，截面积的平方根约为447.2μm，反应区域长度约为100mm。细长微流道预先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常温处理1小时。反应体系通入细长微流道后，利用半导体温控器件进行温控，37℃孵育10小时，65℃孵育5分钟以灭活Klenow>

反应完成后，回收反应体系，纯化扩增产物，并按照标准流程制备高通量DNA测序文库，在Hiseq 4000测序仪上进行序列测定。测序完成后利用BWA短序列比对软件与小鼠参考基因组进行比对，并进行统计分析。

结果表明，与常规的在离心管中进行全基因组扩增的方法对比，两者在扩增效率上并不存在显著的差异，然而利用微流控芯片微流道的扩增方法显著提升了扩增的一致性，不同区域覆盖深度的变异系数(coefficient of variation)由离心管中全基因组扩增的0.82降低至微流道中的0.40。覆盖参考基因组40％的区域，微流道法需要约15倍的测序深度，而离心管法需要约30倍的测序深度，微流道法更加有优势。

实施例3：利用不锈钢金属管扩增扩增拟南芥基因组DNA。

样本：5ng拟南芥基因组DNA。

反应体系：2.5nmol的N12随机序列引物，序列为5’-NNNNNNNNNNNN-3’；Bst DNA聚合酶，10U；Bst DNA聚合酶反应缓冲液，定容至40μl。

在冰上混合反应体系，随后注入内口为正方形的，边长为2mm的不锈钢方管中。不锈钢管预先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常温处理1小时。反应体系通入不锈钢管，用环氧树脂胶密封不锈钢管两端。金属管的截面积为4mm²，截面积的平方根为2mm，反应区域长度约为10mm。随后将不锈钢管置于水浴锅内65℃孵育4小时，再进入另一个80℃水浴中放置20分钟以灭活Bst>

反应完成后，回收反应体系，纯化扩增产物，并按照标准流程制备高通量DNA测序文库，在Hiseq 4000测序仪上进行序列测定。测序完成后利用BWA短序列比对软件与拟南芥参考基因组进行比对，并进行统计分析。

结果表明，与常规的在离心管中进行全基因组扩增的方法对比，两者在扩增效率上并不存在显著的差异，然而利用不锈钢管的扩增方法提升了扩增的一致性，不同区域覆盖深度的变异系数(coefficient of variation)由离心管中全基因组扩增的0.79降低至不锈钢管中的0.62。覆盖参考基因组90％的区域，不锈钢管法需要约12倍的测序深度，而离心管法需要约16倍的测序深度，不锈钢管法更加有优势。

实施例4：利用聚乙烯(PE)毛细管扩增K12大肠杆菌DNA样本。

样本：2ng提取自K12大肠杆菌的基因组DNA。

反应体系：2.5nmol的N6随机序列引物，序列为5’-NNNN-s-N-s-N-3’，其中第4和第5位碱基的3’端经硫代修饰处理；Φ29DNA聚合酶，10U；Φ29DNA聚合酶反应缓冲液，定容至50μl。

在冰上混合反应体系，随后注入内径为200μm的聚乙烯(PE)毛细管。毛细管预先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常温处理1小时。反应体系通入毛细管后，用环氧树脂胶密封毛细管两端，并将毛细管绕于金属绕线器上。毛细管的截面积为31415.9μm²，截面积的平方根约为177.2μm，反应区域长度约为621.7mm。将缠有毛细管的绕线器放入30℃水浴中孵育16小时，再进入另一个65℃水浴中放置5分钟以灭活Φ29DNA聚合酶。

反应完成后，拆除毛细管两端的密封胶，回收反应体系，纯化扩增产物，并按照标准流程制备高通量DNA测序文库，在Hiseq 4000测序仪上进行序列测定。测序完成后利用BWA短序列比对软件与K12大肠杆菌参考基因组进行比对，并进行统计分析。

结果表明，与常规的在离心管中进行全基因组扩增的方法对比，两者在扩增效率上并不存在显著的差异，然而利用聚乙烯毛细管的扩增方法显著提升了扩增结果的一致性。不同区域覆盖深度的变异系数(coefficient of variation)由离心管中全基因组扩增的0.65降低至毛细管中的0.23。覆盖参考基因组90％的区域，毛细管法需要约8倍的测序深度，而离心管法需要约17倍的测序深度，毛细管法更加有优势。

实施例5：利用微流控芯片细长微流道扩增人类肿瘤K562永生化细胞基因组。

样本：60pg提取自人类肿瘤细胞K562的基因组DNA。

反应体系：2.5pmol的N6随机序列引物，序列为5’-NNNN-s-N-s-N-3’，其中第4和第5位碱基的3’端经硫代修饰处理；Φ29DNA聚合酶，0.5U；Φ29DNA聚合酶反应缓冲液，定容至0.25μl。

利用光刻法制备含有细长微流道的硅微流控芯片，微流道反复弯折整齐排列，微流道横截面为长方形，宽5μm，深5μm，微流道长12m。微流控芯片的底面紧贴半导体温控器件用于对芯片的温度控制。

在冰上混合反应体系，随后注入上述微流控芯片中，并使反应体系停留在细长微流道区域。微流道的截面积为25μm²，截面积的平方根约为5μm，反应区域长度约为10m。细长微流道预先通入0.1％(w/w)的牛血清白蛋白，常温处理1小时。反应体系通入细长微流道后，利用半导体温控器件进行温控，30℃孵育10小时，65℃孵育5分钟以灭活Φ29DNA聚合酶。

反应完成后，回收反应体系，纯化扩增产物，并按照标准流程制备高通量DNA测序文库，在Hiseq 4000测序仪上进行序列测定。测序完成后利用BWA短序列比对软件与人类参考基因组进行比对，并进行统计分析。

结果表明，与常规的在离心管中进行全基因组扩增的方法对比，两者在扩增效率上并不存在显著的差异，然而利用微流控芯片微流道的扩增方法显著提升了扩增的一致性，不同区域覆盖深度的变异系数(coefficient of variation)由离心管中全基因组扩增的0.82降低至微流道中的0.60。覆盖参考基因组70％的区域，微流道法需要约16倍的测序深度，而离心管法需要约22倍的测序深度，微流道法更加有优势。