一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用

摘要

本发明公开了一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用。本发明的方法包括如下步骤：(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。通过实验证明：本发明的方法具有工艺操作简单、衔接度高，产品回收率和纯度高的特点，可用于大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌。

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及一种甲基营养菌发酵液中吡咯喹啉醌的分离纯化方法及其应用。

背景技术

吡咯喹啉醌(PQQ)属于芳香三环邻位醌，作为核黄素和吡啶核苷酸之后发现的第三种氧化还原酶辅因子。PQQ参与脱氢酶的氧化还原过程，协同COQ完成呼吸链的电子传递，广泛存在于生物体内，具有促进神经生长因子合成与修复、防止神经细胞纤维化、清除自由基以及维护线粒体能量代谢功能等生理功能，在医药、食品和化妆品领域具有广阔的应用前景。化学合成法由于异构体和副产物多、产率低、合成步骤繁琐且需使用多种有毒试剂等问题逐渐被微生物发酵法所替代。

甲基营养菌的PQQ合成量高，生丝微菌Hyphomicrobium sp.TK 0441的产量为1g/L(Applied and Environmental Microbiology，1992；58(12)：3970-3976)；甲基营养菌Methylovorus sp.MP688的产量高达2g/L(CN 103224965)，并且培养基组分只需含有甲醇和无机盐，成本低廉、下游纯化工艺较为简单是微生物发酵法合成PQQ产业化的主要生产菌株。因此，开发分离步骤少、衔接度好且回收率高的分离纯化工艺从甲基营养菌发酵液中提取PQQ是产业化的关键步骤。目前，关于发酵液中PQQ的提取方法有络合萃取分离纯化法(CN 104892597)、离子对双水相萃取分离结合阴离子交换树脂吸附纯化法(CN 105294687)、DEAE-葡聚糖凝胶吸附分离结合C18固相萃取纯化法(CN 1138776和US 4994382)以及HP-20大孔树脂吸附分离结合聚酰胺柱纯化法(CN 104328155)。上述方法需要使用大量的正己烷、甲醇或乙醇等有机溶剂，工业化应用成本高且污染环境。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法。

本发明提供的从发酵液中分离纯化吡咯喹啉醌的方法包括如下步骤：

(1)将发酵液先经大孔树脂富集，再依次经过缓冲液和水进行洗脱，收集洗脱液，得到富含吡咯喹啉醌的富集液；

(2)将所述富含吡咯喹啉醌的富集液经亲水性硅胶填料纯化，得到吡咯喹啉醌母液；

(3)使所述吡咯喹啉醌母液中的吡咯喹啉醌结晶析出，得到吡咯喹啉醌粗晶体；

(4)采用碱溶酸沉法将所述吡咯喹啉醌粗晶体进行重结晶，得到吡咯喹啉醌。

上述方法中，所述大孔树脂为非极性大孔树脂。所述非极性大孔树脂的比表面积为800-1000m²/g，平均孔径为15-20nm，优选为美国罗门哈斯公司生产的XAD>

上述方法中，所述亲水性硅胶填料为亲水性C₁₈硅胶填料，优选为华谱新创科技有限公司生产的C18HC填料。

上述方法中，所述步骤(1)前还包括如下步骤：将发酵液离心(10000×g离心5min)，收集上清液；将所述上清液过滤(1KDa的中空纤维膜)，收集滤液。

上述方法中，所述步骤(1)，所述洗脱的具体步骤如下：先用缓冲液(pH 6.5的0.1M磷酸盐缓冲液)以2BV/h的流速洗脱1BV，再用纯水以2BV/h的流速继续洗脱，洗脱液颜色先由无色变为红色至暗红色，最后变为黄色，收集红色至暗红色的洗脱液，即为富含吡咯喹啉醌的富集液(PQQ富集液)。

上述方法中，所述步骤(3)的方法为用水将所述吡咯喹啉醌母液稀释至浓度为4-5g/L，用浓盐酸或者浓磷酸调节pH至3.0-3.5，析出红褐色固体，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌粗晶体。在本发明的具体实施例中，用浓磷酸调节pH至3.5。

上述方法中，所述步骤(4)的方法为用水溶解所述吡咯喹啉醌粗晶体，得到浓度为10-15g/L的粗晶体溶液；用氢氧化钠水溶液(1M)调节所述粗晶体溶液的pH至10.0-10.5，再用硫酸溶液(0.25M)调节pH至2.0-3.5，静置，离心，收集沉淀即得到吡咯喹啉醌。在本发明的具体实施例中，用氢氧化钠水溶液(1M)调节所述粗晶体溶液的pH至10.0或10.3或10.5，然后再根据实际需求，在10℃条件下用硫酸溶液(0.25M)调节pH至2.0-3.5：若用硫酸溶液调节pH至2.0时，可得到吡咯喹啉醌晶体；若用硫酸溶液调节pH至3.5时，可得到吡咯喹啉醌二钠盐晶体。

上述方法中，所述发酵液为以甲醇为唯一碳源的甲基营养菌发酵液。所述发酵液的具体制备方法如下：在发酵培养基中发酵培养甲基营养菌，得到所述发酵液。

上述方法中，所述甲基营养菌可为脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans或扭托甲基杆菌Methylobacterium extorquens。

所述脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans具体可为脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans CGMCC 10620或脱氮生丝微菌Hyphomicrobium denitrificans DSM 1869；所述扭托甲基杆菌Methylobacterium extorquens具体可为扭托甲基杆菌Methylobacteriumextorquens CGMCC 1.6987。

上述方法中，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液的浓度具体为0.1M，pH具体为6.5。

上述方法中，所述静置的条件为(4-10)℃静置12h，所述静置的条件具体为4℃静置12h。

本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。

本发明提供了上述方法在制备吡咯喹啉醌中的应用。

本发明还提供了上述方法在提高吡咯喹啉醌晶体纯度中的应用。

本发明提供了一种大规模工业化生产制备吡咯喹啉醌的方法。通过实验证明：本发明的方法具有工艺操作简单、衔接度高、产品回收率的特点，且制备得到的吡咯喹啉醌晶体的纯度高于99.5％，晶型单一。

附图说明

图1为脱氮生丝微菌FJNU-R8发酵液制备的PQQNa₂晶体的性质表征。A：HPLC分析晶体纯度；B：HPLC-MS分析晶体吸收光谱及分子量；C：X-射线衍射分析晶型；D：差示扫描量热法及热重法分析晶体熔点和含水量。

图2为脱氮生丝微菌DSM 1869发酵液制备的PQQNa₂晶体的性质表征。A：HPLC分析晶体纯度；B：HPLC-MS分析晶体吸收光谱及分子量；C：X-射线衍射分析晶型；D：差示扫描量热法及热重法分析晶体熔点和含水量。

图3为扭托甲基杆菌1.6987发酵液制备的PQQNa₂晶体的性质表征。A：HPLC分析晶体纯度；B：HPLC-MS分析晶体吸收光谱及分子量；C：X-射线衍射分析晶型；D：差示扫描量热法及热重法分析晶体熔点和含水量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下面实施例中所使用的菌株如下：

脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)FJNU-R8为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)的菌种，已于2015年3月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.10620。

脱氮生丝微菌(Hyphomicrobium denitrificans)DSM 1869为德国菌种保藏中心(简称DSMZ)的菌种，DSMZ编号为1869，在文献“吡咯喹啉醌产生菌的筛选及其培养基优化”中公开过，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

扭托甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)的菌种，CGMCC编号为1.6987。

下面实施例中所使用的发酵培养基配方如下：甲醇10g/L、无机氮源3g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠4g/L、硫酸镁1g/L，微量元素液2mL/L，初始pH为6.8-7.0。上述无机氮源为硫酸铵或氯化铵。上述微量元素液由溶质和溶剂组成，溶剂为水，其余溶质及浓度如下：硫酸亚铁80g/L、硫酸锌22.5g/L、硫酸锰40g/L、硫酸铜5g/L、氯化钠15g/L、钼酸钠0.3g/L、氯化钾0.3g/L、氯化钴0.03g/L、硼酸3g/L、氯化钙300g/L。

下面实施例中所使用的大孔树脂为非极性大孔树脂，是美国罗门哈斯公司生产的XAD 18、XAD 1600N和XAD 16N大孔吸附树脂。比表面积为800-1000m²/g，平均孔径为15-23nm。

下面实施例中所使用的亲水性C₁₈硅胶填料，是华谱新创科技有限公司生产的C18HC填料。

下面实施例中所使用的磷酸盐缓冲液为pH 6.5的0.1M磷酸盐缓冲液，是将68.5ml 0.1M NaH₂PO₄水溶液和31.5ml>2HPO₄水溶液混匀得到的。

实施例1、脱氮生丝微菌FJNU-R8生产吡咯喹啉醌

1、脱氮生丝微菌FJNU-R8的发酵培养及上清液的制备

(1)挑取FJNU-R8单菌落至装有培养基的三角瓶中，在32℃，220rpm条件下培养24-36小时(OD₆₅₀在2.5-3.0之间，以种子培养基调零)，得到种子液。

将种子液按10％(体积分数)的接种量转入发酵培养基，30℃发酵培养5-6天，得到发酵液；发酵培养条件：装液量(发酵培养基与发酵罐的体积比)为70％，发酵过程中通过流加甲醇和氨水，使发酵液中甲醇浓度控制在1-2g/L，pH控制在6.8-7.0；搅拌关联溶氧，溶氧量(DO)控制在20-30％。

(2)将步骤(1)获得的发酵液在10℃条件下10000×g离心5min，收集上清液；

(3)将步骤(2)获得的上清液经1KDa的中空纤维膜过滤，收集滤液。

2、PQQ的富集

将步骤1获得的滤液的pH调节至3.0，以4BV/h的流速上大孔树脂柱5BV，用磷酸盐缓冲液(pH 6.5的0.1M磷酸盐缓冲液)以2BV/h的流速洗脱1BV，再用纯水以2BV/h的流速继续洗脱，洗脱液颜色先由无色变为红色至暗红色，最后变为黄色，收集红色至暗红色洗脱液，即为PQQ富集液。

3、PQQ的纯化

将PQQ富集液的pH调节至2.5，上装有亲水性C₁₈硅胶填料的色谱柱，用磷酸盐缓冲液洗脱，并用紫外检测器检测洗脱液330nm波长的紫外吸收值的变化情况，至紫外吸收值突然增大时(出现峰值)，收集PQQ母液。

4、结晶

PQQ母液用纯水稀释至4-5g/L，用浓磷酸(国药集团)调节pH至3.5，有红褐色固体析出，4℃下静置12h，6000×g离心5min，弃上清，收集沉淀即得到PQQ粗晶体。

5、重结晶

(1)用纯水溶解PQQ粗晶体至浓度为10-15g/L，用1M氢氧化钠水溶液调节pH至10.5，在10℃条件下用0.25M硫酸溶液缓慢调节pH至3.5，4℃下静置12h，6000×g离心5min，收集沉淀，获得纯度高于99.5％、晶型单一的PQQNa₂晶体(PQQ二钠盐晶体)。

(2)用纯水溶解PQQ粗晶体至浓度为10-15g/L，用1M氢氧化钠水溶液调节pH至10.5，在10℃条件下用0.25M硫酸溶液缓慢调节pH至2，4℃下静置12h，6000×g离心5min，收集沉淀，获得纯度高于99.5％、晶型单一的PQQ晶体。

6、晶体分析

(1)纯度分析

采用高效液相色谱法，使用美国Thermo Fisher液相色谱仪(U3000系统配有DAD-3000检测器)对获得的PQQNa₂晶体进行纯度分析。高效液相色谱分析的条件如下：色谱柱：Thermo>2O+0.1％TFA，B：乙腈；梯度洗脱：0-20min，5％乙腈-50％乙腈；20-30min，50％乙腈-100％乙腈。

结果如1-A所示。结果表明所获得的红色结晶物(PQQNa₂晶体)纯度达到99.91％。

(2)质谱鉴定

采用高效液相色谱-质谱联用法，使用美国Thermo Fisher液质联用仪(U3000系统配有DAD-3000检测器和LC Fleet质谱仪)对获得的PQQNa₂晶体进行质谱鉴定。LCFleet质谱仪设置条件如下：电离源：电喷雾电离源(ESI)；检测方式：正离子检测；扫描范围：100-1000Da；喷雾电压：4.0kV；离子传输管温度：350℃；离子传输管电压：10V；套管透镜电压：75V。

结果如1-B所示。结果表明所获得的红色结晶物(PQQNa₂晶体)的确为PQQ二钠盐晶体。

(3)晶型检测

采用X射线衍射法，使用日本Ricoh X-射线衍射仪(Rigaku D/max-2500)对获得的PQQNa₂晶体进行晶型检测。X-射线衍射条件如下：X射线：Cu>

结果如1-C所示。结果表明所获得的PQQNa₂晶体的晶型单一。

(4)含水量及熔点分析

采用热重分析法和差示扫描量热法，使用美国TA热重分析仪(TGA Q500)和差示扫描量热仪(DSC Q2000)对获得的PQQNa₂晶体进行含水量和熔点分析。分析条件如下：升温范围：25-350℃；氮气流量：40mL/min；升温速率：10℃/min。

结果如1-D所示。结果表明所获得的PQQNa₂晶体的熔点为122.39℃，含水量为13.05％。

实施例2、脱氮生丝微菌DSM 1869生产吡咯喹啉醌

1、脱氮生丝微菌DSM 1869的发酵培养及上清液的制备

(1)挑取DSM 1869单菌落至装有种子培养基的三角瓶中，在32℃，220rpm条件下培养24-36小时(OD₆₅₀在2.5-3.0之间，以种子培养基调零)，得到种子液。

将种子液按10％(体积分数)的接种量转入发酵培养基，30℃发酵培养7-8天，得到发酵液；发酵培养条件：装液量为70％，发酵过程中通过流加甲醇和氨水，使发酵液中甲醇浓度控制在1-2g/L，pH控制在6.8-7.0；搅拌关联溶氧，溶氧量(DO)控制在20-30％。

(2)将步骤(1)获得的发酵液在10℃条件下10000×g离心5min，收集上清液；

(3)将步骤(2)获得的上清液经1KDa的中空纤维膜过滤，收集滤液。

2、PQQ的富集

将步骤1获得的滤液的pH调节至3.0，以4BV/h的流速上大孔树脂柱15BV，用磷酸盐缓冲液以2BV/h的流速洗脱1BV，再用纯水以2BV/h的流速继续洗脱，洗脱液颜色先由无色变为红色至暗红色，最后变为黄色，收集红色至暗红色洗脱液，即为PQQ富集液。

3、PQQ的纯化

PQQ富集液的pH调节至2.5，上装有亲水性C₁₈硅胶填料的色谱柱，用磷酸盐缓冲液洗脱，并用紫外检测器检测洗脱液330nm波长的紫外吸收值的变化情况，至紫外吸收值突然增大时(出现峰值)，收集PQQ母液。

4、结晶

PQQ母液用纯水稀释至4-5g/L，用浓磷酸调节pH至3.5，有红褐色固体析出，4℃下静置12h，6000×g离心5min，弃上清，收集沉淀即得到PQQ粗晶体。

5、重结晶

(1)用纯水溶解PQQ粗晶体至浓度为10-15g/L，用1M氢氧化钠水溶液调节pH至10.0，在10℃条件下用0.25M硫酸缓慢调节pH至3.5，4℃下静置12h，6000×g离心5min，收集沉淀，获得纯度高于99.5％、晶型单一的PQQNa₂晶体(PQQ二钠盐晶体)。

(2)用纯水溶解PQQ粗晶体至浓度为10-15g/L，用1M氢氧化钠水溶液调节pH至10.5，在10℃条件下用0.25M硫酸溶液缓慢调节pH至2，4℃下静置12h，6000×g离心5min，收集沉淀，获得纯度高于99.5％、晶型单一的PQQ晶体。

6、晶体分析

(1)纯度分析

采用高效液相色谱法，使用美国Thermo Fisher液相色谱仪(U3000系统配有DAD-3000检测器)对获得的PQQNa₂晶体进行纯度分析。高效液相色谱分析的条件如下：色谱柱：Thermo>2O+0.1％TFA，B：乙腈；梯度洗脱：0-20min，5％乙腈-50％乙腈；20-30min，50％乙腈-100％乙腈。

结果如2-A所示。结果表明获得的红色结晶物(PQQNa₂晶体)纯度达到99.88％。

(2)质谱鉴定

采用高效液相色谱-质谱联用法，使用美国Thermo Fisher液质联用仪(U3000系统配有DAD-3000检测器和LC Fleet质谱仪)对获得的PQQNa₂晶体进行质谱鉴定。LCFleet质谱仪设置条件如下：电离源：电喷雾电离源(ESI)；检测方式：正离子检测；扫描范围：100-1000Da；喷雾电压：4.0kV；离子传输管温度：350℃；离子传输管电压：10V；套管透镜电压：75V。

结果如2-B所示。结果表明所获得的红色结晶物(PQQNa₂晶体)的确为PQQ二钠盐晶体。

(3)晶型检测

采用X射线衍射法，使用日本Ricoh X-射线衍射仪(Rigaku D/max-2500)对获得的PQQNa₂晶体进行晶型检测。X-射线衍射条件如下：X射线：Cu>

结果如2-C所示。结果表明所获得的PQQNa₂晶体的晶型单一。

(4)含水量及熔点分析

采用热重分析法和差示扫描量热法，使用美国TA热重分析仪(TGA Q500)和差示扫描量热仪(DSC Q2000)对获得的PQQNa₂晶体进行含水量分析。分析条件如下：升温范围：60-400℃；氮气流量：100mL/min；升温速率：10℃/min。

结果如2-D所示。结果表明所获得的PQQNa₂晶体的熔点为122.70℃，含水量为12.52％。

实施例3、扭托甲基杆菌CGMCC 1.6987生产吡咯喹啉醌

1、扭托甲基杆菌CGMCC 1.6987的发酵培养及上清液的制备

(1)挑取CGMCC 1.6987单菌落至装有种子培养基的三角瓶中，在32℃，220rpm条件下培养24-36小时(OD₆₅₀在2.5-3.0之间，以种子培养基调零)，得到种子液。

将种子液按10％(体积分数)的接种量转入发酵培养基，30℃发酵培养4-5天，得到发酵液；发酵培养条件：装液量为70％，发酵过程中通过流加甲醇和氨水，使发酵液中甲醇浓度控制在1-2g/L，pH控制在6.8-7.0；搅拌关联溶氧，溶氧量(DO)控制在20-30％。

(2)将步骤(1)获得的发酵液在10℃条件下10000×g离心5min，收集上清液；

(3)将步骤(2)获得的上清液经1KDa的中空纤维膜过滤，收集滤液。

2、PQQ的富集

将步骤1获得的滤液的pH调节至3.0，以4BV/h的流速上大孔树脂柱25BV，用磷酸盐缓冲液以2BV/h的流速洗脱1BV，再用纯水以2BV/h的流速继续洗脱，洗脱液颜色先由无色变为红色至暗红色，最后变为黄色，收集红色至暗红色洗脱液，即为PQQ富集液。

3、PQQ的纯化

PQQ富集液的pH调节至2.5，上装有亲水性C₁₈硅胶填料的色谱柱，用磷酸盐缓冲液洗脱，并用紫外检测器检测洗脱液330nm波长的紫外吸收值的变化情况，至紫外吸收值突然增大时(出现峰值)，收集PQQ母液。

4、结晶

PQQ母液用纯水稀释至4-5g/L，用浓磷酸调节pH至3.5，有红褐色固体析出，4℃下静置12h，6000×g离心5min，弃上清，收集沉淀即得到PQQ粗晶体。

5、重结晶

(1)用纯水溶解PQQ粗晶体至浓度为10-15g/L，用1M氢氧化钠水溶液调节pH至10.3，在10℃条件下用0.25M硫酸缓慢调节pH至3.5，4℃下静置12h，6000×g离心5min，收集沉淀，获得纯度高于99.5％、晶型单一的PQQNa₂晶体(PQQ二钠盐晶体)。

(2)用纯水溶解PQQ粗晶体至浓度为10-15g/L，用1M氢氧化钠水溶液调节pH至10.5，在10℃条件下用0.25M硫酸溶液缓慢调节pH至2，4℃下静置12h，6000×g离心5min，收集沉淀，获得纯度高于99.5％、晶型单一的PQQ晶体。

6、晶体分析

(1)纯度分析

采用高效液相色谱法，使用美国Thermo Fisher液相色谱仪(U3000系统配有DAD-3000检测器)对获得的PQQNa₂晶体进行纯度分析。高效液相色谱分析的条件如下：色谱柱：Thermo>2O+0.1％TFA，B：乙腈；梯度洗脱：0-20min，5％乙腈-50％乙腈；20-30min，50％乙腈-100％乙腈。

结果如3-A所示。结果表明获得的红色结晶物(PQQNa₂晶体)纯度达到99.83％。

(2)质谱鉴定

采用高效液相色谱-质谱联用法，使用美国Thermo Fisher液质联用仪(U3000系统配有DAD-3000检测器和LC Fleet质谱仪)对获得的PQQNa₂晶体进行质谱鉴定。LCFleet质谱仪设置条件如下：电离源：电喷雾电离源(ESI)；检测方式：正离子检测；扫描范围：100-1000Da；喷雾电压：4.0kV；离子传输管温度：350℃；离子传输管电压：10V；套管透镜电压：75V。

结果如3-B所示。结果表明所获得的红色结晶物(PQQNa₂晶体)的确为吡咯喹啉醌晶体。

(3)晶型检测

采用X射线衍射法，使用日本Ricoh X-射线衍射仪(Rigaku D/max-2500)对获得的PQQNa₂晶体进行晶型检测。X射线衍射的条件如下：X射线：Cu>

结果如3-C所示。结果表明所获得的PQQNa₂晶体的晶型单一。

(4)含水量及熔点分析

采用热重分析法和差示扫描量热法，使用美国TA热重分析仪(TGA Q500)和差示扫描量热仪(DSC Q2000)对获得的PQQNa₂晶体进行含水量分析。分析条件如下：升温范围：60-400℃；氮气流量：100mL/min；升温速率：10℃/min。

结果如3-D所示。结果表明所获得的PQQNa₂晶体的熔点为122.74℃，含水量为13.42％。