吡咯喹啉醌高产菌的筛选、诱变、发酵及基因克隆

摘要

吡咯喹啉醌(PQQ)是一种新型的氧化还原型辅酶，具有许多生物功能，近几年来成为研究热点。本论文主要致力于吡咯喹啉醌产量方面的研究，分为以下四个章节。
　　 1、本实验筛选获得一株高产吡咯喹啉醌菌株，经生理生化实验和16S rRNA鉴定属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.0813，简称:PS0813。用非酶检测法和高效液相色谱检测PS0813合成的PQQ能力，该菌种在未经过任何优化和基因工程改造下合成能力达到258mg/L。
　　 2、由于其出色的产PQQ能力，对其进行发酵以得到更高产量。实验中，进行单因素实验及正交实验。对PS0813的培养基成分以及发酵条件进行研究。优化后依次对PS0813进行摇瓶发酵和发酵罐实验，发酵补料采用流加碳氮源和无机盐的方法，PQQ产量分别最高可达到448 mg/L和695 mg/L。这在未经任何诱变或基因工程改造条件下的天然菌株中，居于最高产量。
　　 3、之后为了进一步提高产量对其进行诱变育种。本研究采用紫外-NaNO2复合诱变进行筛选，分别研究紫外的致死率和正突变率以及NaNO2致死率和正突变率，最终诱变剂量为紫外照射30 S之后与0.1M的NaNO2反应5min的条件下诱变效果最好，筛选出两株高产诱变株PM1和PM2，经传代培养2代确定其具有遗传稳定性。对PM1和PM2进行发酵，产量分别比原代菌产量提高1.63倍和1.56倍。
　　 4、为了在基因水平上对PS0813菌株进一步研究，对该菌株的PQQ合成基因簇进行扩增，采用分段扩增。根据PqqD氨基酸序列的比对，设计出简并引物对PqqD片段进行扩增。结果得到约300bp长度的片段，经测序确定为PqqD基因。

目录

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摘要

第一章 绪论

1．1 吡咯喹啉醌的发现

1．2 吡咯喹啉醌的生物功能

1．2．1 生长因子

1．2．2 在健康科学中的应用

1．2．3 吡咯睦啉醌的临床应用

1．2．4 吡咯睦啉醌与信号转导

1．2．5 吡咯喹啉醌在生物电子学中的前景

1．2．6 吡咯睦啉醌在基因表达和蛋白功能上的应用

1．3 吡咯睦啉醌的生物特性

1．4 吡咯喹啉醌的生物合成

1．4．1 PqqA

1．4．2 PqqB

1．4．3 PqqC

1．4．4 PqqD

1．4．5 PqqE

1．4．6 PqqF

1．4．7 小结

1．5 检测方法

1．6 本课题的研究意义

第二章 吡咯喹啉醌高产菌的筛选与鉴定

2．1 吡咯喹啉醌高产菌的筛选

2．1．1 实验原理

2．1．2 实验材料

2．1．3 实验方法

2．1．4 实验结果与讨论

2．2 筛选菌株的鉴定

2．2．1 实验原理

2．2．2 实验材料

2．2．3 实验方法

2．2．4 实验结果与讨论

2．3 Pseudomonas sp．0813合成吡咯睦啉醌能力测定

2．3．1 实验材料

2．3．2 实验方法

2．3．3 实验结果与讨论

2．4 本章小结

第三章 吡咯喹啉醌高产菌株发酵条件的优化

3．1 实验原理

3．2 实验材料

3．2．1 培养基

3．2．2 试剂

3．2．3 实验仪器：附录

3．3 实验方法

3．3．1 检溯方法

3．3．2 单因素实验

3．3．3 正交实验

3．3．4 发酵条件优化

3．3．5 摇瓶发酵

3．3．6 发酵罐扩大发酵

3．3．7 发酵罐条件优化

3．4 结果与讨论

3．4．1 单因素实验

3．4．2 正交实验

3．4．3 发酵条件优化

3．4．4 发酵

3．4．5 发酵罐条件的优化

3．5 本章小结

第四章 Pseudomonas sp．0813的诱变育种

4．1 实验原理

4．2 实验材料

4．2．1 菌种和培养基

4．2．2 仪器

4．2．3 实验试剂

4．3 实验方法

4．3．1 检测方法

4．3．2 紫外诱变

4．3．3 亚硝酸钠诱变

4．3．4 紫外-亚硝酸钠复合诱变

4．3．5 遗传稳定性检测

4．3．6 菌种的保藏

4．4 结果与讨论

4．4．1 紫外诱变致死情况和突变情况

4．4．2 NaNO2处理后的突变情况和致死情况

4．4．3 紫外-NaNO2复合诱变

4．4．4 遗传稳定性测验

4．4．5 突变菌株PM1和PM2的发酵

4．5 本章小结

第五章 Pseudomonas sp．0813菌株中吡咯喹啉醌合成基因簇的克隆

5．1 实验原理

5．2 实验材料

5．2．1 实验试剂

5．2．2 实验设备

5．3 实验方法

5．3．1 细菌基因组提取

5．3．2 PqqD基因的扩增

5．3．3 PCR产物回收与连接

5．3．4 感受态的制备

5．3．5 pMD-18T-PqqQ的转化

5．3．6 PqqD片段的测序

5．4 结果与讨论

5．4．1 PqqA氨基酸序列的比对

5．4．2 PqqD基因的扩增

5．4．3 PqqD基因的测序

5．5 本章小结

第六章 总结与展望

6．1 实验总结

6．2 本研究创新点

6．3 展望

参考文献

附录表1 试剂

附录表2 仪器

致谢

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